一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法及其应用与流程

本发明属于抑藻剂技术领域，具体涉及一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法及其应用。

背景技术：

近年来水体富营养化现象愈演愈烈,导致藻华频发。藻华爆发的水域中藻类耗掉了水中大量溶解氧,使水生生物大量死亡,不仅严重恶化了水质,破坏了生态系统的平衡和自我调节能力,而且许多有害藻类会产生并向水体释放毒素。这些剧毒的藻分泌物不仅毒害水生生物,影响渔业生产,甚至会通过食物链传递,威胁人类的健康。一次严重水华或赤潮造成的经济损失超过数百万美元,每年因藻毒素而导致的人体中毒事件有近2000例之多。因此,有效控制富营养化水体中的藻类,防止水华发生成为目前环境领域的研究热点和前沿。传统的抑藻方法主要有物理法、化学法和生物法3类,但这些方法都存在操作难、费用高、生态危害大等缺点。因此,人们对新型高效、生态安全的藻类控制技术的探索一直没有停止,化感作用和化感物质的发现为解决以上问题提供了一种新的思路。

近年来，研究人员发现部分水生植物能通过化感作用明显抑制有害藻类的生长。因此利用植物化感作用开发相关抑藻技米应用于富营养化水体成为藻类水华控制研究领域的耀眼新星。由于植物化感物质是其生长过程中释放的次生代谢物质，广谱毒性低，具有较好的生物可降解性，不会在生态系统长期积累，因此被认为具有较佳的生态安全性，适合应用于环境治理中。植物化感作用抑藻的同时，能显著降低水体中藻毒素的含量，这一点是其他方法不可能做到的，其他方法最终的结果都极有可能使藻毒素大量释放，对饮用水安全造成极大的威胁。

生物的抑藻剂主要是利用生物之间生生相克的理念，从而达到对藻类的抑制，这是一种新型的生物抑藻技术，并且具有广阔的应用前景。目前应用上抑藻剂还不是很多，也可以说基本是空白，大部分都处于研究阶段，研究出高效可靠的生态环境型抑藻方法就显得尤为重要。由于生物化感物质制取的抑藻剂比较专业、经济、环保、易于操作、供求量大等优点，这对于我们控制水体的富营养化，建设一个环境友好型的社会有很大促进作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法及其应用。

本发明一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取苔藓研磨粉碎；并烘干至恒重，得到苔藓粉末。

步骤二、将步骤一所得的苔藓粉末分成两份。其中一份苔藓粉末加入到乙醇溶液中浸提，得到乙醇浸提液。另一份苔藓粉末加入到去离子水中浸提，得到去离子水浸提液。

步骤三、将经步骤二所得的乙醇浸提液浓缩并过滤，得到浓缩膏。

步骤四、将步骤三所得的浓缩膏加入到步骤二所得的去离子水浸提液中，并用微孔滤膜进行过滤，得到苔藓混合提取液。

步骤五、对步骤四所得的苔藓混合提取液进行离心剪切处理。将剪切处理后的苔藓提取液与海藻酸钠溶液混合，得到抑藻核心溶液。

步骤六、将壳聚糖水溶液、无水氯化钙水溶液以及乙酸水溶液混合，得到无机成型剂。用碱液调节成型剂的ph值至7.0。

步骤七、将步骤五所得的抑藻核心溶液逐滴加入步骤六所得无机成型剂中。之后过滤出锥形瓶内产生的沉淀。

步骤八、将步骤七所得沉淀烘干至恒重后，得到基于苔藓提取液的抑藻剂。

进一步地，步骤一中，烘干的方式为室温风干12～24小时或烘箱60℃烘干6～12小时。步骤八中，烘干的温度为25℃。

进一步地，步骤二中，苔藓粉末加入到乙醇溶液的料液比为1:10～1:5；苔藓粉末加入到去离子水的料液比为1:10～1:5；所述乙醇溶液的体积浓度为70％。

进一步地，步骤二中，浸提的条件为在25℃下浸泡48h。

进一步地，步骤三中，乙醇浸提液的浓缩通过在旋转蒸发仪内60-80℃下蒸发0.5h实现。步骤四中所述的微孔滤膜的孔径为0.45μm。

进一步地，步骤五中，离心剪切处理的条件为在25℃条件下进行3000～10000rpm离心。

进一步地，步骤五中，海藻酸钠溶液的质量分数为1～5％。

进一步地，步骤六中，壳聚糖水溶液中壳聚糖的质量分数为1～4％；无水氯化钙水溶液中氯化钙的质量分数为1～4.3％；乙酸水溶液中乙酸的质量分数为1～5％。所述的碱液采用0.2mol·l-1的氢氧化钠溶液。

本发明一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法制备的抑藻剂的应用，具体如下：将基于苔藓提取液的抑藻剂加入含有藻类的水体中，抑制藻类的生长。

进一步地，所述的藻类为铜绿微囊藻或小球藻。

本发明具有的有益效果是：

1、申请人发现苔藓提取液中的成分能够使得小球藻和铜绿微囊藻编码两者类囊体膜上两个关键蛋白复合体(光系统ⅰ和光系统ⅱ)的基因表达量明显降低，使光系统受到损伤；故提出了以苔藓提取液来制备高效的抑藻剂的方案。

2、本发明采用苔藓提取液作为制备抑藻剂的原料，对于水体影响小，易降解，对铜绿微囊藻和小球藻的有效抑制率达到70％～90％及以上，是一种环境友好型快速抑藻剂。

3、本发明采用的原料苔藓的自然环境中有大量生长，获取十分便捷，大大降低了本发明的生产成本。

附图说明

图1为本发明制备的抑藻剂对铜绿微囊藻的抑制率随时间变化的曲线图；

图2为本发明制备的抑藻剂对小球藻的抑制率随时间变化的曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，一种基于苔藓提取液的抑藻剂制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取180g的苔藓用蒸馏水清洗后，用研磨机研磨粉碎；并放置到烘箱中干燥60℃烘干至恒重(本实施例中烘干时长为12h)，得到苔藓粉末。烘干时，苔藓平铺于陶瓷托盘上，平铺以苔藓不重叠为准。

步骤二、将步骤一所得的苔藓粉末等分成两份。其中一份苔藓粉末按照1：10的料液比加入到体积浓度为70％的乙醇溶液中，在25℃条件下浸泡48h，得到乙醇浸提液。另一份苔藓粉末按照1：10的料液比加入到去离子水中，在25℃条件下浸泡48h，得到去离子水浸提液。

步骤三、将经步骤二所得的乙醇浸提液在80℃条件下通过旋转蒸发仪浓缩0.5h后用抽滤装置过滤，得到浓缩膏。

步骤四、将步骤三所得的浓缩膏加入到步骤二所得的去离子水浸提液进行溶解，之后用0.45μm微孔滤膜进行过滤，得到苔藓混合提取液

步骤五、将过滤后的苔藓混合提取液在25℃条件下进行15min、8000rpm的离心剪切处理。然后，将剪切处理后的苔藓提取液与质量分数为5％的海藻酸钠溶液按照体积比1:10混合，得到抑藻核心溶液。

步骤六、将质量分数为4％的壳聚糖水溶液和质量分数为4％的无水氯化钙水溶液加入体积分数为5％的乙酸水溶液中，得到无机成型剂。壳聚糖水溶液、无水氯化钙水溶液、乙酸水溶液的体积比为1：1:1。用0.2mol·l-¹的氢氧化钠溶液调节成型剂的ph值至7.0。

步骤七、取步骤六所得无机成型剂置于锥形瓶中，再将步骤五所得抑藻核心溶液用微量注射器逐滴加入锥形瓶中，并匀速搅拌；混合均匀且反应完成后，用慢速滤纸过滤出锥形瓶内混合液产生的沉淀。

步骤八、将步骤七所得沉淀在25℃烘干至恒重(本实施例中烘干时长为24h)后，得到呈固态的基于苔藓提取液的抑藻剂。

对本发明制备的苔藓提取液的抑藻剂的抑藻性能进行验证：

实验步骤：取12个灭菌后的锥形瓶按照三个一组的形式分为第一实验组、第一对照组、第二实验组、第二对照组。每个锥形瓶中均加入150ml灭菌后的bg11培养基。在第一实验组内的3个锥形瓶加入10ml对数生长期的铜绿微囊藻与苔藓提取液；在第一对照组内的3个锥形瓶加入10ml对数生长期的铜绿微囊藻；在第二实验组内的3个锥形瓶加入对数生长期的小球藻与苔藓提取液；在第二对照组内的3个锥形瓶加入对数生长期的小球藻。培养起始点记为第0h，分别在0、24、48、72、96和120h测定第一实验组、第一对照组、第二实验组、第二对照组内的光密度。计算抑藻剂对铜绿微囊藻的抑制率ir％＝1n/n0×100；其中，n为第一实验组内的光密度，n0为第一对照组内的光密度。计算抑藻剂对小球藻的抑制率ir′％＝1-n′/n′0×100；其中，n′为第二实验组内的光密度，n′0为第二对照组内的光密度。

抑藻剂在不同时间点对铜绿微囊藻的抑制率如图1所示。从图1中可以看出，抑藻剂对于铜绿微囊藻的抑制在24h时开始显现，抑制率42.5％；48h抑制率为59.12％，72h抑制率为70.16％，96h抑制率为91.13％，120h抑制率为92.41％。可见，本发明制备的抑藻剂能实现对铜绿微囊藻的长效稳定抑制。

抑藻剂在不同时间点对小球藻的抑制率如图2所示。从图1中可以看出，抑藻剂对于小球藻的抑制在24h时开始显现，抑制率为35.05％，48h抑制率为58.17％，72h的抑制率为81.92％，96h时的抑制率为88.61％，120h的抑制率为95.7％。可见，本发明制备的抑藻剂能实现对铜绿微囊藻的长效稳定抑制。

经申请人研究发现，本发明制得的基于苔藓提取液的抑藻剂的抑藻原理如下：

抑藻剂阻碍了小球藻和铜绿微囊藻的光系统中的电子传递，使小球藻和铜绿微囊藻编码两者类囊体膜上两个关键蛋白复合体(光系统ⅰ和光系统ⅱ)的基因表达量明显降低，使光系统受到损伤；同时，抑藻剂降低了藻细胞抗氧化系统中清除活性氧的主要酶类的含量，同时使相关酶类基因表达量也下降，使大量的活性氧在细胞内堆积，最终从内部破坏细胞器和细胞结构。抑藻剂还破坏了藻细胞的抗氧化酶活性，大量增加的活性氧破坏了藻细胞膜结构，使细胞膜合成相关基因的表达量也下降，细胞膜过氧化物反应的产物明显增加，从而抑制藻细胞的正常生长。