一种红掌种质资源离体保存的方法与流程

本发明涉及植物的种质资源离体保存领域，尤其是指一种红掌种质资源离体保存的方法。

背景技术：

红掌(anthuriumandraeanum)又名安祖花,为天南星科花烛属(araceae)多年生草本观赏植物，原产哥伦比亚。因其绚丽多彩的心型佛焰苞及艳丽的肉穗花序组成的花朵鲜艳夺目，叶型别致，有天鹅绒的金属光泽，深受全球消费者喜爱。已报道，仅荷兰安祖公司便拥有红掌原生和栽培种上千个。由于栽培红掌是杂合体，后代性状容易分离，且种子寿命极短，难以通过种子保存种质资源，而主要通过设施栽培手段进行母本保存，但是该常规保存方法存在耗费大量人力、物力和财力，容易因病虫害引起种质损失和退化等缺点。

在生产上，由于植物组培快繁产业生产的种苗不仅要顺应市场供求的变化而且受到生长季节的制约，在一定阶段使得一些母瓶材料扩繁没有任何意义，需要将母瓶材料进行暂时保存，当实际生产需要时，可将母瓶材料快速恢复到正常快繁状态。在高温高湿季节，继代培养容易污染，如能将母瓶材料进行短期保存，则可节约母瓶材料转接的生产成本。

为了克服红掌传统种植保存缺点及解决种苗组培快繁产业生产中的现实问题，开展红掌种质资源离体保存研究显得日益迫切。离体保存，具有省时、省工，不会因病害引起种质资源丢失，可保持种质优良性状等优点，且便于无病毒种质交换。有关植物离体保存技术已有不少报道，如中国专利文献一种菊花种质资源离体保存的方法（申请号cn200710019345.1）和中国专利文献一种减少培养基中大量元素进行菊花离体保存的方法（申请号cn200710019346.6）已分别公开了通过添加脱落酸和减少培养基中大量元素来离体保存菊花的方法，其保存期可达10个月；再如中国专利文献一种东方百合种质资源离体保存方法（申请号cn201010138986.0）公开了通过改进培养基配方和培养步骤方法来离体保存东方百合种质，保存期可达12～15个月；再如中国专利文献一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法（申请号cn200710164732.4）公开了通过减少培养基中大量元素，添加甘露醇和青霉素方法进行彩色马蹄莲离体种质保存，保存期可达12个月。

但是目前尚未有技术公开如何保存红掌试管苗，此问题亟需解决。

技术实现要素：

本发明提供一种红掌种质资源离体保存的方法，其主要目的在于克服目前红掌种质资源设施大棚种植保存成本高，容易受病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种红掌种质资源离体保存的方法，包括以下步骤：

1)外植体选择和消毒：以去除叶片后的红掌粗壮吸芽作为外植体，先在自来水下冲洗干净，之后用72～75%酒精对该外植体表面进行消毒45～60秒，再用无菌水冲洗1次，然后用0.1%升汞处理该外植体10～12分钟，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干备用；

2)无菌试管苗获得：将步骤1处理后的外植体切割成带节的茎段并接种到酸碱度为5.6～5.8的芽诱导培养基中以温度24～26℃、光照强度1500～2000lux、光照时间16小时/天的条件培养45天，之后将萌发的腋芽转接到酸碱度为5.6～5.8的增殖培养基上以温度24～26℃、光照强度1500～2000lux、光照时间16小时/天的条件进行扩繁40天获得丛生苗；其中，芽诱导培养基：white+1.5～2.5mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；增殖培养基：white+0.5～1.0mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；

3)试管苗保存：将步骤2中获得的丛生苗分切成单株并转入酸碱度为6.1～6.5的离体保存培养基中以温度18～25℃、光照强度1200～1500lux、光照时间6小时/天的条件进行保存；其中，离体保存培养基：white+0.1～0.2g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

进一步的，所述离体保存培养基为white+0.1g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

进一步的，所述离体保存培养基为white+0.15g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

进一步的，所述离体保存培养基为white+0.2g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

进一步的，所述芽诱导培养基为white+2.0mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

进一步的，所述增殖培养基为white+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

1、本发明利用在离体保存培养基中添加柠檬酸三钠保存红掌试管苗，试管苗保存16个月后存活率仍为100%，且植株生长正常，而常规培养基上的试管苗仅能存活4个月。

2、本发明方法保存16个月的红掌试管苗，其后代植物学性状和rapd扩增谱带不会有差异，保存材料稳定，不会发生遗传变异，可防止种性退化和病毒感染，保证种质优良特性。

3、本发明与传统的设施大棚种植保存相比，可节省保存空间，减少工作量。

4、本发明减少了生产中继代接种工作，减少生产操作过程中不必要的人力、物力资源的浪费，从而节约了生产成本，提高了经济效益。

附图说明

图1为在未添加柠檬酸三钠的对照离体保存培养基上保存3个月的试管苗。

图2为在添加了柠檬酸三钠的离体保存培养基上保存6个月的试管苗。

图3为在添加了柠檬酸三钠的离体保存培养基上保存16个月的试管苗。

图4为对照试管苗与采用本发明方法获得的保存试管苗分别在增殖培养基上恢复培养后的对照图（左：对照试管苗，右：本发明的保存试管苗）。

图5为对照试管苗与采用本发明方法获得的保存试管苗分别移栽大棚获得的对照株与再生植株的对照图（左：对照株，右：再生植株）。

图6为引物扩增的rapd图谱（1、采用实施例一保存的试管苗获得的红掌；2、采用实施例二保存的试管苗获得的红掌；3、采用实施例三保存的试管苗获得的红掌；4、对照组；5、100bpdna分子量标记）。

具体实施方式

下面参照附图说明本发明的具体实施方式。

一种红掌种质资源离体保存的方法，包括以下步骤：

1)外植体选择和消毒：以去除叶片后的红掌粗壮吸芽作为外植体，先在自来水下冲洗干净，之后用72～75%酒精对该外植体表面进行消毒45～60秒，再用无菌水冲洗1次，然后用0.1%升汞处理该外植体10～12分钟，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干备用；其中，采用“皇冠”红掌粗壮吸芽为外植体；并以采用72%酒精为最佳；

2)无菌试管苗获得：将步骤1处理后的外植体切割成带节的茎段并接种到酸碱度为5.6～5.8的芽诱导培养基中以温度24～26℃、光照强度1500～2000lux、光照时间16小时/天的条件培养45天，之后将萌发的腋芽转接到酸碱度为5.6～5.8的增殖培养基上以温度24～26℃、光照强度1500～2000lux、光照时间16小时/天的条件进行扩繁40天获得丛生苗；其中，芽诱导培养基：white+1.5～2.5mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；增殖培养基：white+0.5～1.0mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；具体的，芽诱导培养基和增殖培养基的酸碱度均以5.8为最佳，并且芽诱导培养基的最佳组成为white+2.0mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；增殖培养基的最佳组成为white+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；

3)试管苗保存：将步骤2中获得的丛生苗分切成单株并转入酸碱度为6.1～6.5的离体保存培养基中以温度18～25℃、光照强度1200～1500lux、光照时间6小时/天的条件进行保存；其中，离体保存培养基：white+0.1～0.2g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；具体的，有三个实施例，其中，

实施例一

离体保存培养基：white+0.1g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；

实施例二

离体保存培养基：white+0.15g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；

实施例三

离体保存培养基：white+0.2g/lc6h5na3o7+30g/l蔗糖+5g/l琼脂粉；

4)参照图1、图2、图3。保存材料后代的遗传稳定性鉴定：将“皇冠”试管苗放在未添加c6h5na3o7（柠檬酸三钠）的对照离体保存培养基上生长3个月后，植株充满组培瓶，大部分叶片变黄（如图1所示），到5个月后，植株衰老枯死。而将“皇冠”试管苗放在添加了柠檬酸三钠的离体保存培养基上生长缓慢，6个月后植株生长正常（如图2所示），16个月后植株长高叶长大（如图3所示），植株茎干绿色，只有下部少量叶片枯黄，整个植株茎可用；由此可见，添加了柠檬酸三钠的离体保存培养基大大延长了试管苗继代培养时间，使继代间隔由平时2个月继代1次转为16个月继代一次，且16个月后试管苗的存活率均为100%，比对照延长存活了11个月；

参照图4、图5和图6。将在步骤3中保存16个月后的试管苗，与传统的2个月继代1次正常培养保存的对照试管苗分别转接至增殖培养基上，培养45天后本发明的保存试管苗分化出形态正常的不定芽，且与对照试管苗相比分化能力相当，表明本发明的保存试管苗恢复正常生长（如图4所示）；60天后把再生的不定芽转接到1/2ms+0.3mg/lnaa+1g/l活性炭生根培养基上；15天后转入温室大棚进行炼苗，7天后移栽到泥炭土：珍珠岩=8:2的基质中进行育苗；待小苗高20厘米时，上150mm规格杯栽培；6个月后，生长正常，在植物学性状上与对照株相比没有差异（如图5所示）；同时，从心叶提取红掌总dna，经过rapd分子标记检测未发现有特异性条带（如图6所示）。以上结果表明，培养基中添加柠檬酸三钠保存16个月红掌种质保持了良好的遗传稳定性。

参照图6。经过rapd分子标记具体实验方法如下：①材料及dna提取：植株心叶直接用液氮速冻后提取基因组dna，-20℃保存备用，红掌基因组dna提取方法采用改良的ctab法；②rapd标记扩增：pcr反应体系：2xpcrreagent(天根生化kt207)10μl、rapd引物(10μm)1μl、模板dna1μl、ddh2o补至20μl。反应程序：pcr反应程序为：94℃5min，40个循环（94℃1min，56℃30s，72℃30s）；最后72℃延伸10min。取扩增产物10μl于含0.5μg•ml^-1eb的1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。rapd引物由上海生工合成；③结果与分析：离体保存材料的后代植株其引物67rapd扩增的条带与对照一致，没有特异性条带产生（如图6所示），说明离体保存培养基添加柠檬酸三钠保存16个月的红掌种质在分子水平上没有发生遗传变异。

本发明利用在培养基中添加柠檬酸三钠保存红掌试管苗，试管苗保存16个月后存活率仍为100%，且植株生长正常，而常规培养基上的试管苗仅能存活4个月。此外，保存16个月的红掌试管苗，其后代植物学性状和rapd扩增谱带不会有差异，保存材料稳定，不会发生遗传变异，可防止种性退化和病毒感染，保证种质优良特性。并且与传统的设施大棚种植保存相比，可节省保存空间，减少工作量，且减少了生产中继代接种工作，减少生产操作过程中不必要的人力、物力资源的浪费，从而节约了生产成本，提高了经济效益。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。