一种甘蓝型油菜抗旱种质的培育方法与流程

本发明涉及油菜育种技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜抗旱种质的培育方法。

背景技术：

干旱被认为是对全球作物生产影响最大的单一非生物胁迫因子。世界水资源的严重匮乏及其在全球时空的分布不均，造成包括中国在内的80多个国家严重缺水，全球64％的面积受到干旱影响。干旱使植物体内水分失衡，导致细胞膨压下降、气孔关闭、细胞增长减慢、叶片表面积减小，最终导致光合能力下降、呼吸激活，对产量造成严重影响。

油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一，也是最主要的植物蛋白及植物油来源。中国是油菜主产国，种植面积约670万hm²，产量占世界总产量的1/3。中国油菜种植面积主要分布在西北、长江流域及中部地区。西北地区常年缺水，长江流域季节性干旱，都会严重影响中国油菜生产。由于干旱导致的油菜产量损失年均达到20％以上；若在播种期出现干旱，减产比例甚至达到25-32％。干旱对油菜产量的影响受基因型、干旱强度和持续时间、天气状况以及油菜的发育阶段影响。严重干旱缩短油菜殖生长时间。开花期油菜对干旱最敏感。开花期和角果成熟阶段的干旱会导致严重的产量损失。缺水会限制油菜繁殖器官分化，降低每角果粒数、全株角果数和千粒重。严重干旱还会降低油菜种子含油量。油菜种子发育阶段的干旱至少会导致10％甘油三酯的损失。培育抗旱节水、高产稳产油菜品种是减小旱灾损伤、扩展油菜种植区域、发展节水农业的有效途径之一。

芝麻菜是十字花科里重要的抗性资源，具有极强的耐盐碱、耐旱涝、耐寒、耐瘠薄的特性，对环境要求低，在印度、巴基斯坦、中国干旱和半干旱地区作为油料作物栽培，同时具有一定的药用价值及营养价值。在长期种植过程中，经过自然选择和人工选择，形成了丰富的芝麻菜种质资源。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种甘蓝型油菜抗旱种质的培育方法，该方法为利用抗旱芝麻菜创造油菜抗旱种质打下了良好基础。

本发明提供一种甘蓝型油菜抗旱种质的培育方法，包括以下步骤：

s1，选择亲本：

选择甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系和芝麻菜为杂交亲本，选择待改良甘蓝型油菜为回交亲本；

s2，远缘杂交：

以甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系为杂交母本，以芝麻菜为杂交父本，收集芝麻菜的花粉对甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系进行授粉；

s3：子房与胚胎培养：

收集授粉后的子房和膨大角果，对子房和膨大角果分别进行消毒处理，然后分别接种到培养基上进行初代培养，再依次进行继代培养和生根培养，得到杂种幼苗，将杂种幼苗移栽至试验田；

s4：杂种鉴定：

对试验田中的杂种幼苗进行形态学鉴定、分子生物学鉴定和细胞学鉴定，筛选出甘蓝型油菜与芝麻菜的真杂种；

s5：回交：

s5.1，播种甘蓝型油菜与芝麻菜的真杂种和待改良甘蓝型油菜，收集待改良甘蓝型油菜的花粉对甘蓝型油菜与芝麻菜的真杂种进行授粉，收获回交一代的种子及待改良甘蓝型油菜的种子，播种；

s5.2，收集待改良甘蓝型油菜的花粉对回交一代进行授粉，收获回交二代的种子及待改良甘蓝型油菜的种子；

s6：抗旱性筛选：

选取回交二代的种子及待改良甘蓝型油菜的种子接种到含有peg6000溶液的培养皿中培养，测根长、苗长、鲜重及种子萌发率，将根长、苗长、鲜重优异的单株幼苗移栽至试验田中，继续回交；

s7：重复步骤s6直至得到抗旱性稳定的甘蓝型油菜抗旱种质。

进一步地，所述待改良甘蓝型油菜包括甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系和普通甘蓝型油菜品系。

进一步地，步骤s2中，远缘杂交的授粉过程中需要对甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系和芝麻菜进行套袋处理。

进一步地，步骤s3中，消毒处理的过程为：先用75％酒精消毒处理，时间最长不超过1分钟，后用0.1％氯化汞处理20-30分钟，再用无菌水清洗3遍，每次5分钟。

进一步地，步骤s3中，初代培养和继代培养使用的培养基为ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基，生根培养使用的培养基为ms+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基。

进一步地，步骤s4中，甘蓝型油菜与芝麻菜的真杂种的体细胞染色体数目为杂交亲本配子染色体数之和。

进一步地，步骤s5中，回交的过程中对植株进行套袋处理。

进一步地，步骤s6中，所述抗旱性筛选的具体过程为：

在培养皿中平铺吸水纸和滤纸，加入peg6000溶液；

选取种子多的回交后代和待改良甘蓝型油菜的种子在75％酒精溶液中浸泡45秒，然后在自来水下冲洗10分钟；

将消毒后的种子接种到加有peg6000溶液的培养皿中；

室温光照下培养7天后，测根长、苗长、鲜重及种子萌发率；

将回交后代中根长、苗长、鲜重特别优异的单株幼苗移栽至育苗穴盘中；

待单株幼苗长出2-3片真叶时移栽至试验田。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明建立了通过远缘杂交结合生物技术创造甘蓝型油菜抗旱种质的技术；本发明充分利用了存在于芝麻菜的抗旱基因；通过本发明的育种方法创造了甘蓝型油菜抗旱种质，为下一步抗旱杂交油菜组合配制奠定了良好基础。

附图说明

图1是本发明实施例1抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016的培育方法的流程示意图。

图2是本发明子房培养与胚胎培养的示意图。

图3是本发明杂种be1503、母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690及父本芝麻菜的形态示意图。

图4是本发明母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、父本芝麻菜、杂种be1503的分子标记电泳图。

图5是本发明杂种be1503的体细胞染色体图。

图6是本发明回交后代抗旱植株移栽至育苗穴盘的示意图。

图7是本发明实施例2培育抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690时的回交过程和抗旱性筛选过程。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。

实施例1：培育抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016

参考图1，本发明实施例1的抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016的培育方法包括以下步骤：

步骤s1，选择亲本：

选择甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690和芝麻菜为杂交亲本，选择普通甘蓝型油菜品系hubu-2016为回交亲本。

步骤s2，远缘杂交：

以甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690为杂交母本，以芝麻菜为杂交父本，选择生长良好、即将开花的植株分别进行套袋，上午9点到12点收集正在散粉的芝麻菜花朵，人工将其花粉涂于甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690花柱上，封袋；一天后重复授粉一次。

步骤s3，子房与胚胎培养：

步骤s3.1，取授粉后7-10天的子房，在超净工作台上用75％酒精消毒处理45秒，后用质量浓度为0.1％的氯化汞处理20-30分钟，再用无菌水清洗3遍，每次5分钟；将消毒后的子房置于ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基上培养，待子房膨大后，在超净工作台上取出子房，在无菌的培养皿上用无菌的镊子取出幼胚，接种到ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基上培养，幼胚生长成苗后将苗转移到ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基上进行继代快繁；

步骤s3.2，杂交授粉2到3周后，收取膨大角果，在超净工作台上用75％酒精消毒处理，时间最长不超过1分钟，后用0.1％氯化汞处理20-30分钟，再用无菌水清洗3遍，每次5分钟；在无菌的培养皿上用无菌的镊子划开角果，将幼胚取出，接种到ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基上室温培养，幼胚生长成苗后转移至ms+6-ba1-3.0mg/l+naa0.1-0.2mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l培养基上进行继代快繁；

步骤s3.3，9月份，将上述步骤s3.1和s3.2扩繁得到的苗移入ms+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖1-3％+琼脂8g/l生根培养基中生根培养约20天，待根系生长约1-2cm时，取出杂种幼苗，洗清杂种幼苗根上的培养基(避免移栽入土壤后长菌)，栽入混有蛭石的土壤中，并用透明袋子将杂种幼苗罩住以减少水分蒸发，3-5天后慢慢揭开透明袋子，天气良好时将杂种幼苗移栽到田间。

步骤s3中，子房培养、幼胚培养、幼胚生长成苗、杂种幼苗扩繁培养的记录过程见图2，图2中，图2a为子房培养的示意图，图2b为幼胚培养的示意图，图2c为幼胚生长成苗的示意图,图2d为杂种幼苗扩繁培养的示意图。

步骤s4,杂种鉴定:

步骤s4.1，形态学鉴定：

将扩繁生根所得的杂种幼苗转移入试验田，对其形态学特征进行观察，并与母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690及父本芝麻菜进行比较，发现杂种植株多表现多母本形态，少数具有类似于父本性状，具体表现在叶色、叶边缘和花型上，如花色浅、花瓣窄、叶色深、叶上具有较深的缺刻，其中杂种be1503的植株形态上大体类似于母本油菜，但茎杆、茎生叶、花蕾均呈褐色，与父本芝麻菜形态相似，叶片具有较深的缺刻，杂种花色浅，花瓣较窄，呈双亲中间形态；杂种be1503与母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690及父本芝麻菜的形态学观察结果见表1；杂种be1503、母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690及父本芝麻菜的形态示意图见图3，图3a为母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690的幼苗拍摄图，图3b为杂种be1503的幼苗拍摄图，图3c为父本芝麻菜的幼苗拍摄图，图3d为母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、杂种be1503及父本芝麻菜的叶片拍摄图，图3e为母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、杂种be1503及父本芝麻菜花的拍摄图，图3d和3e中从左至右分别为母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、杂种be1503、父本芝麻菜。

表1：杂种be1503、母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690及父本芝麻菜形态学观察

步骤s4.2，分子生物学鉴定：

图4显示母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、父本芝麻菜、杂种be1503在ssr11引物(agttggccccatttcattgttat；atcttgacggcctccatctcca)下pcr扩增产物电泳图，图4中由左至右分别为母本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690、父本芝麻菜、杂种be1503的电泳图，由图4中可看出杂种be1503含有亲本双方条带，初步判定杂种be1503为真杂种。

步骤s4.3，细胞学鉴定：

本实验所用母本材料甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育系p690的体细胞染色体数目为38条，父本芝麻菜体细胞染色体数目为22条,其中杂种be1503经鉴定，其体细胞染色体数目为30条(见图5)，为亲本配子染色体数之和，证实杂种be1503为真杂种。

步骤s5，回交：

步骤s5.1，10月将甘蓝型油菜与芝麻菜的杂种be1503和回交父本普通甘蓝型油菜品系hubu-2016播种至田间,第二年春天选择生长良好、花序较多、即将开花的杂种be1503和回交父本植株分别进行套袋，待套袋的植株开花时，上午9点至12点采取正在散粉的父本花朵，人工授粉于套袋的母本甘蓝型油菜与芝麻菜杂种be1503柱头上，授粉完成后封上袋口，第二天同样时间对新开花朵进行授粉，可重复授粉，收获回交一代的种子及回交父本普通甘蓝型油菜品系hubu-2016的种子，于10月播种于田间，第二年继续回交；

步骤s5.2，收集普通甘蓝型油菜品系hubu-2016的花粉对回交一代进行授粉，收集回交二代的种子及普通甘蓝型油菜品系hubu-2016的种子。

步骤s6，抗旱性筛选：

因回交一代获得种子不多，从回交二代开始进行抗旱性筛选：

步骤s6.1，在直径11厘米培养皿中平铺8层吸水纸、1层滤纸，加入15ml质量浓度为15％的peg(polyethyleneglycol，聚乙二醇)6000溶液。

步骤s6.2，选取种子较多的回交后代和回交父本普通甘蓝型油菜品系hubu-2016的种子在75％酒精溶液中浸泡45s，然后迅速在自来水下冲洗10分钟；

步骤s6.3，消毒后的种子放在有peg6000溶液的培养皿中；

步骤s6.4，在室温25°的光照下培养7天后，测根长、苗长、鲜重以及种子萌发率；

步骤s6.5，将回交后代中根长、苗长、鲜重特别优异的单株幼苗移栽至育苗穴盘中；图6为回交后代抗旱植株移栽至育苗穴盘的示意图；

步骤s6.6，待幼苗长出2-3片真叶时移栽至试验田里，继续以普通甘蓝型油菜品系hubu-2016为父本进行回交，依次得到回交三代、回交四代等其他回交后代。

步骤s7，重复步骤s6四到五次对得到的回交后代进行抗旱性筛选，直到得到抗旱性稳定的抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016。

普通甘蓝型油菜品系hubu-2016与抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016peg胁迫7天后幼苗各项指标平均值见表2。

表2普通甘蓝型油菜品系hubu-2016与抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016peg胁迫7天后幼苗各项指标平均值

从表2看出在peg模拟干旱胁迫下，抗旱甘蓝型油菜不育系r-hubu-2016的种子萌发率、根长、苗长和鲜重都显著高于普通甘蓝型油菜品系hubu-2016。

实施例2：培育抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690

本发明实施例2与实施例1的区别仅在于选择甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690为回交父本；其余则与实施例1相同。参考图7，本发明实施例2培育抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690时的回交过程和抗旱性筛选过程为：

回交：

10月将甘蓝型油菜与芝麻菜的杂种be1503和回交父本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690播种至田间,第二年春天选择生长良好、花序较多、即将开花的杂种be1503和回交父本植株分别进行套袋，待套袋的植株开花时，上午9点至12点采取正在散粉的父本花朵，人工授粉于套袋的母本甘蓝型油菜与芝麻菜杂种be1503柱头上，授粉完成后封上袋口，第二天同样时间对新开花朵进行授粉，可重复授粉，收获回交一代的种子及回交父本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690的种子，于10月播种于田间，第二年继续回交；

收集甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690的花粉对回交一代进行授粉，收集回交二代及甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690的种子。

抗旱性筛选：

因回交一代获得种子不多，从回交二代开始进行抗旱性筛选：

在直径11厘米培养皿中平铺8层吸水纸、1层滤纸，加入15ml质量浓度为15％的peg(polyethyleneglycol，聚乙二醇)6000溶液。

选取种子较多的回交后代和回交父本甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690的种子在75％酒精溶液中浸泡45s，然后迅速在自来水下冲洗10分钟；

消毒后的种子放在有peg6000溶液的培养皿中；

在室温25°的光照下培养7天后，测根长、苗长、鲜重以及种子萌发率；

将回交后代中根长、苗长、鲜重特别优异的单株幼苗移栽至育苗穴盘中；图6为回交后代抗旱植株移栽至育苗穴盘的示意图；

待幼苗长出2-3片真叶时移栽至试验田里，继续以甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690为父本进行回交，依次得到回交三代、回交四代等其他回交后代。

重复四到五次对得到的回交后代进行抗旱性筛选，直到得到抗旱性稳定的抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690。

本发明实施例2得到的抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690与甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690peg胁迫7天后幼苗各项指标平均值见表3。

表3抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690与甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690peg胁迫7天后幼苗各项指标平均值

从表3看出在peg模拟干旱胁迫下，抗旱甘蓝型油菜不育恢复系rr690的种子萌发率、根长、苗长和鲜重都显著高于原始甘蓝型油菜ogura细胞质雄性不育恢复系r690。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。