一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法。

背景技术：

中国是世界上拥有杜鹃花种类最多的国家，中国西南地区是世界公认的杜鹃花的故乡。杜鹃花常用作园林景观植物或园艺盆栽植物，供公共园林环境及室内外色绿化美化，具有极高的观赏价值。目前国内对杜鹃花的研究集中于资源考察、形态学分类、孢粉学、生态与分布及植物化学等领域，分子生物学方面的研究进展缓慢。遗传转化体系的建立对于推动杜鹃花分子生物学的发展意义重大。已报道的杜鹃花遗传转化主要是通过农杆菌介导的遗传转化侵染茎段和通过基因枪法转化叶片。使用茎段作为外植体进行遗传转化时愈伤形成和植株再生效率较低，基因枪法仪器设备要求高且成本较高。

本发明提供一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，提高转化效率，降低转化成本，为杜鹃花的分子生物学研究提供便利。

技术实现要素：

本发明针对现有杜鹃花遗传转化效率低、成本高的问题，提供一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法。该方法用叶片作为外植体，外植体经消毒和与培养后直接进行农杆菌侵染转化，相较于获得愈伤组织后再用农杆菌侵染愈伤组织更为节省时间。外植体消毒后的预培养、共培养、选择培养过程使用愈伤组织诱导培养基有助于愈伤组织形成和再分化，且从愈伤组织形成、丛芽分化到丛芽增殖使用同一培养基，省去了组培过程中配置不同培养基的繁琐程序，节约了组培时间、人力和物力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，于以杜鹃花叶片作为外植体，将已消毒的叶片切成小块置于愈伤诱导培养基上预培养后，取出叶片进行农杆菌侵染，之后再进行共培养、选择培养和继代选择培养，经生根培养后进行移栽和转基因植株的鉴定。

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下步骤：叶片采集及消毒、预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、继代选择培养、生根培养及移栽、转基因植株鉴定。

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取杜鹃花幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗30～50min，用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45s，无菌水清洗两遍；在100ml0.1wt%的升汞(hgc12)中浸泡6～8min，用无菌水清洗5～6遍后浸入于无菌水中，将叶片在无菌水中切成0.5cm×0.5cm方块，之后在叶片中部划2-3道切口。

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面在上接种于愈伤组织诱导培养基上，4℃暗培养2～3天。

（3）农杆菌侵染：取携带有表达载体的gv3101农杆菌菌液，按1vol％～2vol％的比例加入含终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec的液体lb培养基里，28℃、180rpm培养至od600为0.8，将菌液转入50ml无菌离心管中，于室温条件下，4000rpm离心5min，去上清，菌体用ph5.6的bme液体培养基重悬，稀释至od600为0.5~0.8，同时加入终浓度的为20mg/l的as，用于转化，在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的叶片外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20min，用无菌滤纸吸除表面菌液。

（4）共培养：将步骤（3）已侵染过的叶片接种在垫有一层无菌滤纸的叶片愈伤组织诱导培养基上，25℃暗培养2-3天。

（5）选择培养：将步骤（4）共培养后的叶片用含有终浓度为600mg/lcef的无菌水清洗3次，每次5min，再用无抗生素的灭菌水冲洗两次用滤纸吸干水，转移到含终浓度为60mg/lkan的愈伤组织诱导培养基上，暗培养15天后再光照培养40~50天，此时外植体分化出抗性不定芽且叶片已开始展开，培养温度为25℃。

（6）继代选择培养：将步骤（5）分化出的抗性不定芽转入新的含有终浓度为60mg/lkan的选择培养基中进行继代扩繁培养，培养温度为25℃，每30天继代一次，继代2~3次后进行生根培养。

（7）生根培养及移栽：待步骤（6）继代选择培养的不定芽长到2cm以上时，切下并插入含有终浓度为60mg/lkan的生根培养基上进行生根培养，培养温度为25℃，14~20天长出不定根。

（8）转基因植株鉴定：生根培养4~8周后，打开培养瓶盖，炼苗2天后将组培苗移栽至栽培基质中，通过pcr、gus染色和gfp观察检测转基因是否成功。

上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基为：bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6。

上述方法中，所述生根培养基为bme+1mg/liaa，ph5.6。

进一步的，上述方法中，步骤（3）中所述的表达载体，携带有gus基因和gfp基因，以及kan抗性基因。

本发明的有益效果：

1.该方法使用叶片作为外植体，且不需组织培养获得，来源广泛。外植体经消毒和与培养后直接进行农杆菌侵染相较于获得愈伤组织后再用农杆菌侵染愈伤组织更为节省时间。

2.外植体消毒后的预培养、共培养、选择培养过程使用愈伤组织诱导培养基有助于愈伤组织形成和再分化，且在这些过程中使用同一种培养基，省去了组培过程中配置不同培养基的繁琐程序，节约了组培时间、人力和物力。

附图说明：

图1抗性植株生根情况。

图2转基因植株检测结果。a图为gus染色结果，最右图为非转基因对照；b图gfp观察结果，1为转基因植株，2为非转基因对照，箭头所指为非转基因叶片边缘；c图为电泳检测结果，m为dl2000marker，1-10为待检测的抗性植株；-为负对照，+为阳性对照，h为水对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取‘状元红’杜鹃幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗45min。用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45s，无菌水清洗两遍；在100ml0.1wt%的升汞(hgc12)中浸泡7min，用无菌水清洗5遍后浸入于无菌水中。将叶片在无菌水中切成0.5cm×0.5cm方块，之后在叶片中部划2道切口。

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面在上接种于在愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，4℃暗培养2天。

（3）农杆菌侵染：取携带有pk7fwg2-gus表达载体（该载体携带有gus基因和gfp基因，以及kan抗性基因）[karimi,m.;inze,d.;depicker,a.gatewayvectorsforagrobacterium-mediatedplanttransformation.trendsplantsci.2002,7,193–195.]的gv3101农杆菌菌液，按1.5vol％的比例加入液体lb培养基(含有终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec)里，28℃、180rpm培养至od600为0.8。将菌液转入50ml无菌离心管中，于室温条件下，4000rpm离心5min，去上清，菌体用bme液体培养基（ph5.6）重悬，稀释至od600为0.6，同时加入终浓度为20mg/l的as，用于转化。在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20min，用无菌滤纸吸除表面菌液。

（4）共培养：将步骤（3）已侵染过的叶片接种在垫上一层滤纸的叶片愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，25℃暗培养3天。

（5）选择培养：将共培养后的叶片用含有终浓度为600mg/lcef的无菌水中清洗3次，每次5min，再用无抗生素的灭菌水冲洗3次用滤纸吸干水，转移到加有终浓度为60mg/lkan的愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上。暗培养15天后再光照培养，培养温度为25℃。45天后外植体分化出抗性不定芽且叶片已开始展开。

（6）继代选择培养：将步骤（5）分化出的抗性不定芽转入新的含有终浓度为60mg/lkan的选择培养基中（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）进行继代扩繁培养，培养温度为25℃，每30天继代一次，继代2次后进行生根培养。

（7）生根培养及移栽：待步骤（6）继代选择培养的不定芽长到2cm时，切下并插入含有终浓度为60mg/lkan的生根培养基（bme+1mg/liaa，ph5.6）上进行生根培养，培养温度为25℃，18天长出不定根（图1）。

（8）转基因植株鉴定：生根培养4周后，打开培养瓶盖，炼苗2天后将组培苗移栽至栽培基质中。通过pcr、gus染色和gfp观察检测转基因是否成功。pcr检测结果显示通过该方法能获得转基因植株，gus染色和gfp观察结果也均证实转基因植株为阳性，检测结果见图2。

实施例2

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取‘状元红’杜鹃幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗30min。用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45s，无菌水清洗两遍；在100ml0.1wt%的升汞(hgc12)中浸泡6min，用无菌水清洗6遍后浸入于无菌水中。将叶片在无菌水中切成0.5cm×0.5cm方块，之后在叶片中部划2道切口。

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面在上接种于在愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，4℃暗培养2天。

（3）农杆菌侵染：取携带有pk7fwg2-gus表达载体（该载体携带有gus基因和gfp基因，以及kan抗性基因）[karimi,m.;inze,d.;depicker,a.gatewayvectorsforagrobacterium-mediatedplanttransformation.trendsplantsci.2002,7,193–195.]的gv3101农杆菌菌液，按1vol％的比例加入液体lb培养基(含有终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec)里，28℃、180rpm培养至od600为0.8。将菌液转入50ml无菌离心管中，于室温条件下，4000rpm离心5min，去上清，菌体用bme液体培养基（ph5.6）重悬，稀释至od600为0.5，同时加入终浓度为20mg/l的as，用于转化。在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20min，用无菌滤纸吸除表面菌液。

（4）共培养：将步骤（3）已侵染过的叶片接种在垫上一层滤纸的叶片愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，25℃暗培养3天。

（5）选择培养：将共培养后的叶片用含有终浓度为600mg/lcef的无菌水中清洗3次，每次5min，再用无抗生素的灭菌水冲洗3次用滤纸吸干水，转移到加有终浓度为60mg/lkan的愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上。暗培养15天后再光照培养，培养温度为25℃。40天后外植体分化出抗性不定芽且叶片已开始展开。

（6）继代选择培养：将步骤（5）分化出的抗性不定芽转入新的含有终浓度为60mg/lkan的选择培养基中（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）进行继代扩繁培养，培养温度为25℃，每30天继代一次，继代2次后进行生根培养。

（7）生根培养及移栽：待步骤（6）继代选择培养的不定芽长到3cm时，切下并插入含有终浓度为60mg/lkan的生根培养基（bme+1mg/liaa，ph5.6）上进行生根培养，培养温度为25℃，15天长出不定根。

（8）转基因植株鉴定：生根培养4周后，打开培养瓶盖，炼苗2天后将组培苗移栽至栽培基质中。通过pcr、gus染色和gfp观察检测转基因是否成功。pcr检测结果显示通过该方法能获得转基因植株，gus染色和gfp观察结果也均证实转基因植株为阳性。

实施例3

一种以叶片为外植体的杜鹃花转基因方法，包括以下具体步骤：

（1）叶片采集与消毒：取‘状元红’杜鹃幼嫩且带有叶片的枝条，自来水冲洗50min。用滤纸将表面水滴吸干后装入烧杯，在超净工作台中用75vol%的酒精消毒45s，无菌水清洗两遍；在100ml0.1wt%的升汞(hgc12)中浸泡8min，用无菌水清洗5遍后浸入于无菌水中。将叶片在无菌水中切成0.5cm×0.5cm方块，之后在叶片中部划3道切口。

（2）预培养：将步骤（1）切好的叶片叶面在上接种于在愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，4℃暗培养2天。

（3）农杆菌侵染：取携带有pk7fwg2-gus表达载体（该载体携带有gus基因和gfp基因，以及kan抗性基因）[karimi,m.;inze,d.;depicker,a.gatewayvectorsforagrobacterium-mediatedplanttransformation.trendsplantsci.2002,7,193–195.]的gv3101农杆菌菌液，按2vol％的比例加入液体lb培养基(含有终浓度为100μg/mlkan、50μg/mlrif和100μg/mlspec)里，28℃、180rpm培养至od600为0.8。将菌液转入50ml无菌离心管中，于室温条件下，4000rpm离心5min，去上清，菌体用bme液体培养基（ph5.6）重悬，稀释至od600为0.8，同时加入终浓度为20mg/l的as，用于转化。在超净工作台中，取出步骤（2）预培养过的外植体到无菌小培养皿中，倒入备好的重悬菌液，浸泡20min，用无菌滤纸吸除表面菌液。

（4）共培养：将步骤（3）已侵染过的叶片接种在垫上一层滤纸的叶片愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上，25℃暗培养3天。

（5）选择培养：将共培养后的叶片用含有终浓度为600mg/lcef的无菌水中清洗3次，每次5min，再用无抗生素的灭菌水冲洗3次用滤纸吸干水，转移到加有终浓度为60mg/lkan的愈伤组织诱导培养基（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）上。暗培养15天后再光照培养，培养温度为25℃。50天后外植体分化出抗性不定芽且叶片已开始展开。

（6）继代选择培养：将步骤（5）分化出的抗性不定芽转入新的含有终浓度为60mg/lkan的选择培养基中（bme+10mg/lzt+10mg/liaa，ph5.6）进行继代扩繁培养，培养温度为25℃，每30天继代一次，继代3次后进行生根培养。

（7）生根培养及移栽：待步骤（6）继代选择培养的不定芽长到2.5cm时，切下并插入含有终浓度为60mg/lkan的生根培养基（bme+1mg/liaa，ph5.6）上进行生根培养，培养温度为25℃，20天长出不定根。

（8）转基因植株鉴定：生根培养4周后，打开培养瓶盖，炼苗2天后将组培苗移栽至栽培基质中。通过pcr、gus染色和gfp观察检测转基因是否成功。pcr检测结果显示通过该方法能获得转基因植株，gus染色和gfp观察结果也均证实转基因植株为阳性。

由上可以看出，使用叶片为外植体进行杜鹃花转基因，可以在6个月内获得转基因植株，且转化效率较高，是一种比较高效的杜鹃花转基因方法。