一种油樟叶精油抑菌方法与流程

本发明涉及一种植物源杀菌剂，尤其涉及一种油樟叶精油抑菌方法。

背景技术：

植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(fao)统计，每年因植物病害而造成的减产平均损失为总产量的10％～15％(吴传万等，2004)。目前，防治植物病害的主要方法为化学杀菌剂。但由于化学农药潜在的对人类健康的危害、对环境的污染、对非靶标生物的影响及植物病原菌抗性的发展等问题，使得化学农药的发展受到了来自各方面的限制(赵继红和李建中，2003)。由于植物精油具有来源于天然，对人体相对安全、与环境友好、生物活性多样等特点，因此，从天然植物中寻找广谱、高效、低毒的杀菌剂已成为科研人员及农药使用人员的共同目标。据统计，目前国际上生物农药产品已超过100多种，但90％以上是生物杀虫剂，有专家预测第二个重要的商业化的生物农药将是植物源杀菌剂。

樟树是我国天然香料树种之一，它的根、茎、叶、果实等部位均可以提炼分离出精油来。根据枝叶精油的主成分不同，将樟树进一步划分为五个化学型类型：芳樟醇型(芳樟型)、龙脑型(龙樟型)、桉油素型(油樟型)、脑樟型(樟脑型)、异橙花叔醇型(异樟型)。

樟树精油含有芳樟醇、桉叶油醇、松油醇等广谱抗菌活性成分，能够防抑制多种细菌，其对于真菌也是有一定的抑菌作用。现有技术公开了异樟叶精油的抗真菌活性(胡文杰；李冠喜；曹裕松；柯坫华；周升团；异樟叶精油的抑菌活性及其化学成分[j]；林业科技开发；2014年06期)，但是对于油樟叶精油抑制真菌活性却鲜有报道。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种油樟叶精油抑菌方法，以期替代化学农药来防治作物病害，具有低毒、低残留和环境友好的优点，为植物源杀菌剂提供了更广泛的选择。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种油樟叶精油抑菌方法，包括以下步骤：

1)油樟叶精油的提取：以油樟叶为原料，采用水蒸气蒸馏法或同时蒸馏萃取法提取精油，蒸馏出的液体，经过油水分离，油部分用无水硫酸钠干燥，得到油樟叶精油；

2)以步骤1)获得的油樟叶精油为有效成分进行抑制植物病原真菌。

进一步的，步骤1)中，水蒸气蒸馏法的水料比为12.5∶1ml·g^-1。

进一步的，步骤1)中，同时蒸馏萃取法的水料比为10∶1ml·g^-1，萃取剂料比为2∶1ml·g^-1，萃取剂为无水乙醚，萃取温度为40℃。

进一步的，步骤2)中，植物病原真菌为尖孢镰刀菌、七叶树壳梭孢和拟茎点霉。

进一步的，步骤1)中，提取功率为1200w，提取时间为65min。

进一步的，步骤2)中，抑菌使用时，油樟叶精油的体积比为1-7∶25。

进一步的，油樟叶精油的体积比为7∶25，对尖孢镰刀菌、七叶树壳梭孢和拟茎点霉的抑菌率分别不低于80％、90％和61％。

进一步的，步骤1)中，水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油，所含化学成分包括：烯烃类化合物，醇类化合物，酯类化合物，醛类化合物，烷烃类化合物。

进一步的，步骤1)中，同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油，所含化学成分包括：烯烃类化合物，醇类化合物，酯类化合物，烷烃类化合物。

有益效果：与现有技术相比，油樟叶精油对尖孢镰刀菌、七叶树壳梭孢和拟茎点霉具有明显的抑菌效果。当油樟叶精油的体积比为7∶25时，对病原真菌的抑制效果均最为明显，对3种植物病原真菌的抑菌率分别不低于80％、90％和61％。替代化学农药来防治作物病害，具有低毒、低残留和环境友好的优点。为植物源杀菌剂提供了更广泛的选择。

附图说明

图1是水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油的总离子流图；

图2是水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油的抑菌效果图；

图3是同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油的总离子流图；

图4是同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油的抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的供试菌株与培养基如下：

七叶树壳梭孢(fusicoccumaesculi)、拟茎点霉(phomopsismacrospora)和尖孢镰刀菌(fusariumoxysporium)均由南京林业大学提供。

马铃薯培养基(zpd)：马铃薯200g，mgso4·7h2o1.5g，葡萄糖20g，kh2po43g，琼脂20g，vb10.05g，蒸馏水1000ml。

实施例1水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油抑菌活性

1)油樟叶精油的提取

油樟叶采自江西吉安。采用水蒸气蒸馏法提取油樟鲜叶精油，水料比为12.5∶1ml·g^-1，提取功率为1200w，提取时间为65min，得油率为1.64％，用无水硫酸钠干燥后保存在棕色瓶中，4℃冷藏备用。

2)油樟叶精油的成分的测定

色谱柱选用elite-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱。分流比10∶1，进样量0.5μl。进样口温度280℃，柱温50℃保持2min，以3℃.min^-1升至180℃，保持2min，再以8℃·min^-1升至240℃保持5min，共运行60min。载气为he，流速1.0ml·min^-1。

质谱分析条件：ei离子源温度180℃，接口温度260℃，扫描范围50～620m/z。

对油樟叶精油进行gc-ms分析，得到油樟叶精油总离子流图，如图1所示。其化学成分及含量如表1所示，从油樟叶精油中共鉴定出37种成分，占精油总量的94.515％，主要化合物类别为：烯烃类化合物23种，占精油总量的24.168％；醇类化合物10种，占精油总量的68.986％；酯类化合物2种，占精油总量的0915％；醛类化合物1种，占精油总量的0.008％；烷烃类化合物1种，占精油总量的0.438％。在这些化学成分中，1，8-桉叶油醇、β-水芹烯、α-松油醇、α-蒎烯、左旋β-蒎烯和萜品醇-4等化合物含量较高。

表1水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油的化学成分及其含量

3)油樟叶精油对真菌的抑菌活性测定

取水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油1、3、5、7ml与25mlzpd混合倒平板，制得油樟叶精油浓度为1∶25、3∶25、5∶25和7∶25(体积比)的zpd培养基，并以纯zpd倒平板作对照。分别将病原菌菌丝块接种到培养皿中央，重复3次，25℃恒温培养4d后观察拍照，计算抑菌率。其中接种在对照平板上的病原菌菌落平均直径为do，接种在含油樟叶精油平板上的病原菌菌落平均直径为dx，则

抑菌率＝(do-dx)/do×100％。

表2水蒸气蒸馏法提取的油樟叶精油的抑菌活性

由图2和表2可知，油樟叶精油对尖孢镰刀菌、七叶树壳梭孢和拟茎点霉均具有一定的抑制效果，且随着异樟叶精油浓度的增大，抑制效果更加明显。当浓度7∶25时对病原真菌的抑制效果均最为明显，对3种植物病原真菌的抑菌率分别达到85.93％、92.83％和65.30％，油樟叶精油对七叶树壳梭孢的抑制率分别为尖孢镰刀菌和拟茎点霉1.32和1.42倍。

实施例2同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油抑菌活性

1)油樟叶精油的提取

同时蒸馏萃取：称取处理好的油樟叶样品30g，置于500ml圆底烧瓶中，加入300ml蒸馏水，装在同时蒸馏萃取装置的一端，加热至微沸；同时蒸馏萃取装置的另一端装60ml无水乙醚于250ml圆底烧瓶中，用40℃恒温水浴加热，同时蒸馏萃取3.5h，所得提取物用无水na2so4干燥，用旋转蒸发器除去无水乙醚，即得到淡黄色具芳香气味的油樟叶精油，得油率为1.95％。并4℃冷藏保存备用。

2)油樟叶精油的成分的测定

色谱柱选用elite-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱。分流比10∶1，进样量0.5μl。进样口温度280℃，柱温50℃保持2min，以3℃·min^-1升至180℃，保持2min，再以8℃·min^-1升至240℃保持5min，共运行60min。载气为he，流速1.0ml·min^-1。

质谱分析条件：ei离子源温度180℃，接口温度260℃，扫描范围50～620m/z。

对油樟叶精油进行gc-ms分析，得到油樟叶精油总离子流图，如图3所示。其化学成分及含量如表3所示，从油樟叶精油中共鉴定出37种成分，占精油总量的94.023％，主要化合物类别为：烯烃类化合物22种，占精油总量的22.749％；醇类化合物13种，占精油总量的71.068％；酯类化合物1种，占精油总量的0.006％；烷烃类化合物1种，占精油总量的0.200％。在这些化学成分中，1，8-桉叶油醇、β-水芹烯、α-松油醇、1r-π蒎烯、左旋β-蒎烯和萜品醇-4等化合物含量较高。

表3同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油的化学成分及其含量

3)油樟叶精油对真菌的抑菌活性测定

取同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油1、3、5、7ml与25mlzpd混合倒平板，制得油樟叶精油浓度为1∶25、3∶25、5∶25和7∶25(体积比)的zpd培养基，并以纯zpd倒平板作对照。分别将病原菌菌丝块接种到培养皿中央，重复3次，25℃恒温培养4d后观察拍照，计算抑菌率。其中接种在对照平板上的病原菌菌落平均直径为do，接种在含油樟叶精油平板上的病原菌菌落平均直径为dx，则

抑菌率＝(do-dx)/do×100％。

表4同时蒸馏萃取法提取的油樟叶精油的抑菌活性

由图4和表4可知，油樟叶精油对尖孢镰刀菌、七叶树壳梭孢和拟茎点霉均具有一定的抑制效果，且随着异樟叶精油浓度的增大，抑制效果明显。当浓度7∶25时对病原真菌的抑制效果均最为明显，对3种植物病原真菌的抑菌率分别达到80.17％、90.85％和61.25％，油樟叶精油对七叶树壳梭孢的抑制率分别为尖孢镰刀菌和拟茎点霉1.12和1.48倍。