一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用的制作方法

本发明属于植物保护领域，具体为一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用。

背景技术：

新疆野苹果是天山野果林中面积最大的野生种质资源，然而由于自然和人为因素的共同作用，近年来野苹果出现严重退化现象。调查发现，在伊犁新源县野果林中，麻叶荨麻分布不断在扩张，植株高度、阔度也增加明显，正在占据越来越大的生态位，尤其是在野苹果树周围，这对野苹果等珍贵的种植资源有很大的冲击，也对物种多样性、生态环境稳定性、和水土保持等有很大影响。除麻叶荨麻具有适应当地生境的生理机制等原因外，我们推测麻叶荨麻通过释放化感物质的方式不断占据生态位，影响周围野苹果树的生长。

麻叶荨麻(urticacannabinal.)，又名焮麻、哈拉盖等，为荨麻科(urticaceae)荨麻属(urtica)多年生草本植物，广泛分布于北半球温带地，在我国甘肃、河北、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、宁夏、青海、陕西、山西、四川、新疆等地均有分布，主要生长于海拔800～2800m的丘陵性草原、坡地、河滩、河谷、溪旁、干燥山坡或沙坡等处，生长适应性强。其茎直立、多分枝、叶和茎上有螫毛，4月底返青、7-8月开花、9月成熟。

目前防控麻叶荨麻的主要手段有放牧、人工割草和化学防治。野果林生境脆弱、野苹果生长情况较差，不适合放牧；人工割草只能在较短时间、较小范围起作用，且费时费力；化学除草剂不具备良好的专性选择性，会对其他植物造成杀灭，而且也有可能对生境中的动物造成伤害，另外，由于自然界中缺乏将其分解的微生物，会对环境造成污染；而生物农药因其来源于自然，可被微生物降解，对环境较为友好，适应可持续发展的需求。因此，开展生物防治是目前防治麻叶荨麻最具潜力的和开发前景的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，该致病菌株分类命名为木贼镰刀菌(fusariumequisetai)，是从新疆伊犁州新源县野果林中的麻叶荨麻自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的真菌木贼镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素，再将制备的病原菌菌丝和粗毒素喷洒在麻叶荨麻植株上，对恶性杂草麻叶荨麻具有很强的防治效果。本发明培养操作简单、培养基质材料易获得、所得到的病原菌菌丝和粗毒素稳定性强，获取工艺简单，可大批量生产，生产周期短，易于推广应用；以其在茎叶喷洒，使用方便，可有效杀灭目标杂草麻叶荨麻，具有较高的环境安全性。

本发明所述的一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，该真菌木贼镰刀菌fusariumequisetai是从新疆伊犁州新源县野果林中的麻叶荨麻自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的木贼镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素，再将制备的病原菌菌丝和粗毒素均匀喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，其中：

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5-1:10溶解，按10-200g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，3-7天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂；

或将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:10-1:1000溶解，按10-200g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，3-7天后植株出现明显的死亡症状。

所述木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5溶解，按100g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，5天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

所述木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，4天后植株出现明显的死亡症状。

所述一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，病原菌菌丝的野外实施量为10-200g/亩，粗毒素的野外实施量为10-200g/亩。

本发明所述的一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，该真菌木贼镰刀菌(fusariumequisetai)是从新疆伊犁州新源县野果林中的麻叶荨麻自然发病植株叶片上分离纯化获得的，采集时间为2016年7月。

本发明所述的一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为木贼镰刀菌。

本发明所述的一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，其中真菌木贼镰刀菌的分离鉴定为：

麻叶荨麻强致病菌株的分离纯化：在新疆伊犁州新源县野果林采集麻叶荨麻自然发病植株，通过马铃薯蔗糖培养基(pda)分离纯化得到多种真菌，并用柯赫氏法则验证，经过致病性试验的比较筛选，获得了这株对麻叶荨麻有很强致病作用的除草病原真菌木贼镰刀菌,其所对应的rdnaits基因片段，详见序列表，已上传至在genbank，登录号为mg214845，名称为木贼镰刀菌；

菌株的致病性：把经灭菌的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入2ml灭菌蒸馏水。剪取生长健壮无病斑的麻叶荨麻叶片，用清水冲洗干净后，用浓度70％酒精擦洗1遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用，在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在pda上培养的大小约为0.5×0.5cm²的菌块，置于伤口处，用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存5天，5天后叶片出现明显病斑，病菌直径达1-3cm；

菌株的形态特征鉴定：在pda培养基上，温度25℃培养5天，见图1，病菌菌落呈圆形，表面气生菌丝较发达，白色，短絮状，呈辐射状扩展，菌丝无色；

菌株的分子鉴定：提取菌株的基因组dna，采用rdnaits通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3)，its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3)进行rdnaits序列的pcr扩增，获得长度为480bp(rdnaits)基因片段，从ncbiblast检索与目标序列同源性高的dna序列，与本试验所测序列进行种内比对，由比对结果确定真菌与木贼镰刀菌(fusariumequisetai)是同一个种；

菌株的最佳培养条件和接种侵染条件：该真菌菌落生长的最适培养基为马铃薯葡蔔糖琼脂(pda)，合适温度为25-28℃，合适酸碱度为ph6-7，在这些条件下，菌落生长快；病菌侵染致病时，接种后保湿和暗光5天，并在整个侵染时期保持温度25-28℃。

木贼镰刀菌菌丝的野外喷施：木贼镰刀菌在水稻培养基中结束培养后，将水稻和菌体进行机械粉碎，按100g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，粉剂与水的质量比为1:10，5天后叶片出现明显的病斑，见图2-a；

木贼镰刀菌粗毒素的野外喷施：将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，4天后植株出现明显的死亡症状，见图2-b。

木贼镰刀菌菌株生物防治物质的制备和应用：

菌株菌丝的制备和应用：

首先将该菌接种至6个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，按10-200g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，粉剂与水的比例为1:5-1:10；

粗毒素的制备和应用：

用灭菌竹签挑取已纯化木贼镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:10-1:1000溶解，按10-200g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，3-7天后植株出现明显的死亡症状；

木贼镰刀菌菌丝、粗毒素制剂的应用及其优点：将所得病原菌菌丝按100g/亩，粗毒素按20g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，对麻叶荨麻有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。

本发明所述的一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用，其木贼镰刀菌的rdnaits序列：

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附图说明

图1为本发明木贼镰刀菌培养5天后的菌落形态；

图2为本发明麻叶荨麻的发病情况：a为菌丝喷洒5天后的情况；b为粗毒素喷洒4天后的情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

该真菌木贼镰刀菌fusariumequisetai是从新疆伊犁州新源县野果林中的麻叶荨麻自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的木贼镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素。

实施例1

木贼镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至6个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到木贼镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5溶解，按100g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，5天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂，见图2-a。

实施例2

木贼镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至6个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到木贼镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:8溶解，按50g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，7天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

实施例3

木贼镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至6个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到木贼镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:10溶解，按200g/亩喷洒到杂草麻叶荨麻叶面上，3天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

实施例4

木贼镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化木贼镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，4天后植株出现明显的死亡症状，见图2-b。

实施例5

木贼镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化木贼镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:10溶解，按10g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，3天后植株出现明显的死亡症状。

实施例6

木贼镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化木贼镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:1000溶解，按200g/亩喷洒在杂草麻叶荨麻植株上，7天后植株出现明显的死亡症状。

序列表

<110>中国科学院新疆生态与地理研究所

<120>一种木贼镰刀菌在防控杂草麻叶荨麻中的应用

<130>2019

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>480

<212>dna

<213>木贼镰刀菌(fusariumequisetai)

<400>1

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