一种铁线莲增殖组培方法与流程

本发明涉及铁线莲的组培方法，特别涉及一种铁线莲增殖组培方法。
背景技术：
：铁线莲(学名：clematisfloridathunb)，别名铁线牡丹、番莲、金包银、山木通、番莲、威灵仙；为毛茛科、铁线莲属植物，多数为落叶或常绿草质藤本，花期从早春到晚秋(也有少数冬天开花的品种)，果期夏季。有若干个种、变种及其品种和杂交种，可栽培供园林观赏用。铁线莲享有“藤本花卉皇后”之美称，花期6～9月，花色一般为白色，花有芳香气味，铁线莲可作展览用切花，可用于攀缘常绿或落叶乔灌木上，可用作地被；以根及全草入药。利尿，理气通便，活血止痛。用于小便不利，腹胀，便闭；外用治关节肿痛，虫蛇咬伤。现有技术中以铁线莲品种‘avant-garde’为材料，进行了植物组织培养和快速繁殖试验，采用全因子设计。通过比较试验发现，使用wpm作为基本培养基的效果优于ms培养基。通过方差分析和邓肯测验，发现较高质量浓度(≥2.0mg/l)的6-ba会抑制芽苗的生长；幼苗生根率随着naa质量浓度(0.05-0.15mg/l)的升高而变化。试验筛选得到芽增殖最佳培养基配方为wpm+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba，增殖系数为2.83；最佳生根培养基配方为1/2wpm+0.15mg/lnaa+0.2mg/liba，生根率达到50％。在铁线莲“乌托邦”组织培养及褐化抑制实验中也明确提出“增殖系数随着6-ba浓度的增加呈先升高后下降的趋势，当6-ba浓度为1.2mg/l时，增殖系数虽然最大为3.17，但是植株矮小，发育畸形。目前铁线莲“可觅”clematiskermesina的组织培养增殖系数较低、植株矮小、发育畸形、继代培养基配方不够合理。技术实现要素：发明目的：本发明目的是提供一种增值系数高、植株长势较好的铁线莲组培方法。技术方案：本发明提供一种铁线莲增殖组培方法，包括如下步骤：a、外植体的选择：选择枝叶上无水的时候剪取铁线莲当年生带3到5节芽的嫩茎，除去叶片修剪成带芽茎段，用洗衣粉和自来水的混合液浸泡除去杂质，流水冲洗后用消毒液浸泡外植体；b、外植体的灭菌：将初步消毒好的外植体移至超净工作台，首先使用酒精浸泡外植体后用无菌水冲洗，再用含有吐温的氯化汞溶液浸泡1.5-6min，后再次用无菌水冲洗，之后剪去茎段切口处的部分茎段，最后将修剪好的外植体形态学下端向下，接入初代培养基中，进行初代培养，获取无菌苗；c、继代增殖培养：将长势良好、芽饱满的无菌苗茎段加入继代培养基中，每隔10-12d记录一次生长情况，计算苗木生长的褐化率、增值率、苗高和苗粗。进一步地，所述步骤a中芽茎段为上端0.5cm、两侧叶柄0.5cm、芽下端1cm的带芽茎段。进一步地，所述步骤a中消毒液为多菌灵、百菌清和自来水的混合液。进一步地，所述步骤b中初代培养基配方为：1/2ms+0.2mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.05mg/lnaa+1.5％蔗糖，ph值为5.8至6.0之间。进一步地，所述步骤c中继代培养基中生长调节剂的配方为：2.0mg/l6-ba、0.5mg/lkt、0.01mg/lnaa。进一步地，所述初代培养条件为：每天16小时白炽灯光照，组培室温度设定为25℃，每星期对培养室架子用75％的酒精擦拭。进一步地，所述铁线莲的品种为可觅。有益效果：本发明的铁线莲组培方法，培养基配方合理，增殖率高，植株的长势好。附图说明图1为c1外植体生长情况：褐化严重、长势极差；图2为c2外植体生长情况：组内生长差异极大；图3为c3外植体生长情况：增殖率低、苗木低矮；图4为c4外植体生长情况：增殖率低、苗木低矮；图5为c5外植体生长情况：增殖率高、叶色淡黄、组内差异大；图6为c6外植体生长情况：增殖率高、褐化率低、长势一般；图7为c7外植体生长情况：增殖率低、褐化严重、长势差；图8为c8外植体生长情况：组内差异大、个别长势优良；图9为c9外植体生长情况：褐化严重、长势弱、组内差异大；图10为c10外植体生长情况：增殖率低、褐化严重；图11为c11外植体生长情况：褐化率高增资系数大、长势良好；图12为c12外植体生长情况：褐化率高、长势一般、组内差异大；图13为c13外植体生长情况：增殖率低、褐化率高；图14为c14外植体生长情况：增殖率高、长势健壮；图15为c15外植体生长情况：增殖率高、长势健壮；图16为c16外植体生长情况：增殖率高、长势健壮。具体实施方式1、材料与方法1.1实验材料试验材料取自江苏农林职业技术学院本部南校区花房，在春季截取铁线莲“可觅”健壮无病虫害的当年生枝条上的带芽嫩茎段作为外植体进行组织培养。1.2试验方法1.2.1外植体剪取和初步消毒(1)外植体的选择：选择铁线莲“可觅”枝叶上无水珠的时间剪取铁线莲“可觅”当年生带3到5节芽的嫩茎，除去叶片修剪成大约芽上端0.5cm、两侧叶柄0.5cm、芽下端1cm的带芽茎段。全部的带芽外植体修剪完成后放入容器中，用20g洗衣粉加入1l自来水浸泡10min除去外植体上的浮尘杂质，接着用流水冲洗60min。最后用1g多菌灵(消灭外部菌)和1g百菌清(消灭内部菌)分别加入800ml自来水依次浸泡外植体10min。(2)外植体的灭菌：将初步消毒好的铁线莲“可觅”外植体放入无菌瓶中移至超净工作台，首先使用75％的酒精(穿透力最强)浸泡外植体20s后用无菌水冲洗3至4次，再用0.1％的氯化汞(含1mg/l吐温)溶液浸泡1.5-6min(视带芽茎段的木质化程度而定，木质化程度越深，浸泡时间越长)后再次用无菌水冲洗3次。之后用剪刀剪去带芽茎段4个切口的一小部分，以防消毒过程中升汞侵入外植体对其产生伤害。最后将修剪好的外植体形态学下端向下，接入初代培养基中1/2ms+0.2mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.05mg/lnaa+1.5％蔗糖，ph值为5.8至6.0之间完成初代培养，获取无菌苗。(3)继代增殖培养：当初代苗培养一段时间后(一般在7d左右)，将长势良好，性状基本相似的无菌苗剪切成长短、粗细相同、芽饱满的茎段，分别加入3种不同浓度激素6-ba、naa、kt的继代培养基(见表1)中，共16种处理，每种处理分3组，每组10颗苗。之后每隔10d记录一次生长情况，最后根据苗木生长的褐化率、出芽率、芽高和苗粗，观察不同植物生长调节剂添加量对铁线莲“可觅”的增殖影响。对比确定出铁线莲“可觅”最佳培养基配方。表1铁线莲增殖培养三种激素水平正交方案1.2.2带芽茎段的初代培养外植体的选择以及接种到培养基中的形式是进行组织培养建立无菌体系以及植株再生的关键。实验以1/2ms+0.2mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.05mg/lnaa+20g/l1.5％蔗糖+7.5g/l琼脂的配方做基本培养基，(灭菌前ph调至5.8左右)，培养4d-7d。1.2.3继代增殖培养将初代培养出的无菌苗接种到添加不同浓度6-ba(0.2、0.5、1.0、2.0mg/l)、naa(0、0.5、1.0、2.0mg/l)、kt(0.01、0.05、0.1、0.5mg/l)的1/2ms培养基上，组成16个梯度，每个梯度接种3瓶，每瓶接种5株苗，之后每隔10d观察统计外植体生长状况，30d后统计出芽率、丛生芽数、苗高和苗粗。1.2.4接种后组培室的环境设定将接种好的铁线莲放在培养架上，每天16小时白炽灯光照，组培室温度设定为25℃，每星期对培养室架子用75％的酒精擦拭。1.3数据统计与分析1.3.1外植体污染、褐化情况外植体的褐化情况可作为定量评价消毒效果的指标。褐化率＝褐化的外植体株数/接种数×100％。1.3.2不定芽增殖及生长情况计算不定芽接种30d后增殖系数，根据生长势和生长速率定性评估生长状况。测量出苗高、苗粗。进行定量统计。增殖率＝增殖个数/接种数×100％。2、结果及分析1、不同激素浓度对“可觅”丛生芽增殖培养的影响选取在初代培养基中长势基本一致的铁线莲无菌苗，在同一时期接种至不同浓度植物生长调节剂6-ba、naa、kt的1/2培养基上进行增殖培养，30d后察看增殖状况，结果见表2。由表2可知，c14、c15、c6、c16对铁线莲不定芽增殖具有较强的促进作用，增殖率分别达到了1.70、1.66、1.63、1.50；c11、c8、c9、c5对铁线莲的不定芽的增殖作用相比较于前4个梯度稍微较弱，但是增殖率叶都大于1；其余8种植物生长调节剂配比都表现出对铁线莲增殖具有一定的抑制作用，增殖率皆小于1。通过表3可以看出，c16、c6、c15、c14这四种处理的外植体褐化率较低，分别为7％、10％、13％、20％，节间生长量较多，分别为71节、59节、55节、64节，并且在第10d时丛生芽均长出超过1cm，苗生长最好，丛生芽多，叶片翠绿，生长速度快；c8、c5、c12、c2生长量一般，生长稳定，平均丛生芽数在15个，生长速度一般。剩余的8种处理苗木长势不一，褐化情况比较严重，都达到50％以上，并且苗木细弱，叶色稍淡黄色，生长缓慢。从表4的方差分析情况可以得出结论，不同浓度的激素对铁线莲“可觅”的增殖有极显著性差异(p＜0.01)，从铁线莲的生长率、生长速度、外观颜色和长势综合分析得知(见图1-16)，c6组内苗高差异显著，极差相较于c14、c15、c16较大，达到7.4cm；而c15平均苗高很小，仅3.28cm；所以最佳培养基应在c14、c16中选择，由表3可知，c16相较于c14，褐化率，丛生芽数，平均节间数均略优。综上所述，铁线莲“可觅”在添加6-ba2.0mg/l的培养基上生长效果最理想，在这种培养基上，平均增殖率达到167.3％，每种培养基平均苗高达到7.58cm，c161/2ms+2mg/l6-ba+2mg/lkt+0.05mg/lnaa的激素配比增殖系数较好，平均增殖系数为162.5％，并且此激素浓度配比下，方差较小，增殖稳定。此外，当6-ba浓度为0.5mg/l时的平均增殖率为1.05，当6-ba浓度为1mg/l时的平均增殖率为0.925，当6-ba处于低浓度0.2mg/l时，增殖率普遍较低，平均值为0.45，苗木生长情况参差不齐，由此可知，铁线莲“可觅”适宜在高浓度6-ba的培养基中增殖。表2：铁线莲“可觅“正交实验结果表3：铁线莲“可觅”继代培养情况统计表处理接种数(株)褐化数(株)褐化率％丛生芽(个)总节间(个)平均节间数(个)c130155011240.80c23082715321.07c3309309190.63c4307239170.57c53082712371.23c63031028591.97c730165310120.40c830165315391.30c930217019240.80c1030248014170.57c1130165314270.90c1230165318331.10c1330175712210.70c143062034642.13c153041325551.83c16302738712.37表4：铁线莲“可觅”节间数方差分析表差异源ssdfmsfp-valuefcrit组间307.1915.0020.482.330.012.17组内1266.50144.008.80---总计1573.69159.00-----2、不同激素浓度对“可觅”丛生芽增高、增粗的影响选取在初代培养基中长势一致的铁线莲无菌苗，在同一时期接种至不同浓度植物生长调节剂6-ba、naa、kt的1/2培养基上进行增殖培养，30d后测量其丛生芽高和苗粗情况。通过表6可知，不同植物生长调节剂对铁线莲继代培养时的苗高生长有极显著的影响(p＜0.01)，表5可以看出，c1、c14、c11、c5、c16平均苗高值较大，达到7.89cm，但是其中c5苗高方差较大，长势不稳定；c1从表3可知，褐化情况严重，达到50％，增殖率很低，仅30％；c11长势一般，褐化率达到50％，增殖率为116.67％，平均苗高达到7.82，苗高方差较大；c14、c16长势优良，c14褐化率为20％，苗高方差小，仅为4.3，c16褐化率为7％，苗高方差仅为3.35，生长稳定。通过表7可知，不同植物激素对铁线莲“可觅”的苗粗生长有极不显著性差异，所以认为本实验的激素浓度配比对铁线莲“可觅”苗粗生长无太大关联。在苗高、苗粗测定中，未将褐化情况统计在内，个别梯度会出现苗高均值虚高的现象。通过表8铁线莲“可觅”增殖数极差分析表可知，最佳激素配比为2.0mg/l6-ba、0.5mg/lkt、0.01mg/lnaa，仅与c16激素kt的浓度上存在细微差别，此激素配比(2.0mg/l6-ba、0.5mg/lkt、0.01mg/lnaa)可以在后期的实验中进一步验证。表5：铁线莲“可觅”苗高、苗粗情况统计表注：同列标注不同小写字母的的处理间差异显著(p＜0.05)，标注不同大写字母的处理间差异极显著(p＜0.01)。表6：不同激素浓度对铁线莲“可觅”高度的方差分析表7：不同激素浓度对铁线莲“可觅”粗度的方差分析差异源ssdfmsfp-valuefcrit组间3.1815.000.213.210.012.33组内4.2364.000.07---总计7.4079.00----表8：铁线莲“可觅”增殖数极差分析表处理6-bamg/lktmg/lnaamg/l平均增殖数(个)c10.200.010.8c20.20.50.051.07c30.210.10.63c40.220.50.57c50.500.051.23c60.50.50.011.97c70.510.50.4c80.520.11.3c9100.10.8c1010.50.50.57c11110.010.9c12120.051.1c13200.50.7c1420.50.12.13c15210.051.83c16220.012.37k1＝(k1/10)3.073.536.04-k2＝(k2/10)4.95.745.23-k3＝(k3/10)3.373.764.86-k4＝(k4/10)7.035.342.24-极差3.962.213.8-最优方案20.50.01-最终获得的最佳增殖配方是c16：1/2ms+2mg/l6-ba+2mg/lkt+0.01mg/lnaa，增殖率高达163.33％。并且褐化率低，仅为7％，同时这一浓度激素配比下，对苗高生长有明显的促进作用，平均苗高达到了7.16cm。当前第1页12