一种浙江安息香离体胚诱导丛生芽快速繁殖方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种极小种群植物——浙江安息香离体胚诱导丛生芽快速繁殖方法，属于林木种苗培育技术领域。

(二)

背景技术：

浙江安息香(styraxzhejiangensis)，灌木或小乔木，为安息香科安息香属下的一个种，是浙江省特有的极小种群野生植物，其树形优美，花朵芳香，盛开时美丽下垂，繁花似雪，是珍稀的观赏植物，其花、果实、木材均具有重要的经济价值，可用于园林绿化、药用保健以及能源利用等方面。目前仅发现于浙江建德林场泷江林区桃花坞，由于其分布区域极为狭窄，数量稀少，濒临灭绝，2018年调查数量仅为106丛，属极其濒危，已被列为浙江省珍稀濒危野生植物及省级重点监测物种。因而除了加强保护，还必须积极开展迁地保护和人工繁育工作，扩大浙江安息香的种群数量是拯救这一极小种群的关键措施。

浙江安息香种子有一定的自然繁殖能力，但在自然条件下，落花落果严重，有明显的结种大小年，种皮较厚，需要在厚的腐殖质层休眠才可萌发，且传播扩散能力弱，此外，种子含油，鸟兽喜食，因此自然更新小苗可萌发的极少。浙江安息香生长较慢，成年植株年高生长量仅10～20cm，加之株数极少，采用扦插繁殖，穗条数量获得有限，生根率亦不理想。目前，国内外尚无关于浙江安息香快速繁育方法的报道。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种浙江安息香离体胚直接诱导丛生芽的快速繁育方法。

本发明采用的技术方案是：

一种浙江安息香离体胚诱导丛生芽快速繁殖方法，所述方法包括：

(1)取材：取当年生籽粒饱满的种子，用湿纱布包好，4℃保藏备用；

(2)种子脱毒处理：将带壳种子置于含有洗洁精和吐温(吐温80，质量浓度0.1～0.3％)的水溶液中浸泡0.5～1h，之后用流水冲洗0.5～1h，再转入1～5％(w/w)高锰酸钾中浸泡20～30min，再用无菌水冲洗3～5次，之后于无菌水中浸泡48～72h；将述浸泡过的种子于超净台内用剥壳器去除坚硬的外种皮，再用尖嘴镊去掉贴在胚乳上的内种皮，用75％(v/v)酒精处理30s后倒去酒精，加入0.1％(w/w)升汞溶液处理15min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗3～5遍后，置于铺有消毒滤纸的培养皿中，待种胚表面水分吸干，用眼科镊和解剖刀将胚乳彻底剥离，获得完整饱满的胚；

(3)离体胚的预处理：将步骤(2)获得的完整胚接于胚预处理培养基上，置于16h光照/8h黑暗、25±2℃条件下的人工气候箱培养10～15天，获得胚轴膨大的离体胚；所述胚预处理培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，1～3％(w/w)蔗糖，0.1～0.3mg·l^-1tdz(噻苯隆，脲类植物生长调节剂，具有细胞激动素活性)，溶剂为1/2wpm培养基；

(4)丛生芽诱导培养：将步骤(3)处理的胚轴膨大的离体胚转移到丛生芽诱导培养基上，置于16h光照/8h黑暗、25±2℃条件下的人工气候箱培养40～50天，获得丛生芽；所述丛生芽诱导培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，1～3％(w/w)蔗糖，2.0～5.0mg·l^-16-ba，0.1～0.3mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基；

(5)丛生芽增殖培养：将步骤(4)培养产生的丛生芽转移到丛生芽增殖培养基上，置于16h光照/8h黑暗、25±2℃条件下的培养室培养50～60天，获得丛生芽聚集体；所述丛生芽增殖培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，1～3％(w/w)蔗糖，0.3～0.6g·l^-1水解酪蛋白，1.0～5.0mg·l^-16-ba，0.1～0.3mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基；

(6)壮苗培养：将生长良好的单株从步骤(5)培养获得的丛生芽聚集体上整株切离，转移到壮苗培养基中，置于16h光照/8h黑暗、25±2℃条件下的培养室培养4～6周，相同条件和培养基继代2～3次，获得可用于移植的芽苗；所述壮苗培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，1～3％(w/w)蔗糖，1.0～5.0mg·l^-16-ba，0.5～2.0mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基。

本发明采用组织培养技术，由离体胚直接诱导产生不定芽，可以打破种子休眠，缩短繁育周期，实现快速繁育。

所述1/2wpm培养基为wpm培养基母液中大量元素含量减半，其余元素含量不变。

wpm培养基母液组成如下：

优选的，步骤(3)中胚预处理培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，0.25mg·l^-1tdz，溶剂为1/2wpm培养基。

步骤(4)中丛生芽诱导培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，3.0mg·l^-16-ba，0.2mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基。

步骤(5)中丛生芽增殖培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，0.5g·l^-1水解酪蛋白，3.0mg·l^-16-ba，0.2mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基。

步骤(6)中壮苗培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，3.0mg·l^-16-ba，1.0mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm培养基。

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法以浙江安息香的成熟离体胚为外植体，经过预处理，直接诱导离体胚产生丛生芽，再经过芽增殖培养和壮苗培养，可获得大量生长健壮的芽苗。本发明可以打破浙江安息香种子休眠，缩短丛生芽产生时间，2个月丛芽平均增殖系数达6.5倍，对于短期内扩大浙江安息香这一极小种群植物数量，建立安息香属植物组培体系具有重要作用。

(四)附图说明

图1为浙江安息香种子；

图2为浙江安息香成熟种子离体胚；

图3为将离体胚接种于预处理培养基上2周后生长状态；

图4为将预处理后胚接种于丛生芽诱导培养基上6周后生长状态；

图5为丛生芽增殖前(图a)、后(图b)生长状态；

图6为切离单株接种于壮苗培养基后初代(图a)和继代2次后(图b)芽苗生长状态。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

浙江安息香当年生种子(于建德市建德林场泷江桃花坞采收)。

1.1.2试剂

基本培养基包括wpm、ms、b5、n6成分，植物激素包括naa、6-ba、iba、tdz和ga，其它试剂包括蔗糖、水解酪蛋白和水晶洋菜。

1.2方法

1.2.1种子脱毒

将带壳种子(图1)于洗洁精+吐温80(其中洗洁精添加量约为0.5wt％，吐温80添加量约为0.2wt％)的溶液中浸泡0.5～1h，之后用流水冲洗0.5～1h，转于3％高锰酸钾中浸泡30min，再用无菌水冲洗3～5次，之后于无菌水中浸泡48～72h；将上述处理过的种子于超净台内用剥壳器去除坚硬的外种皮，并用尖嘴镊去掉贴在胚乳上的内种皮，用75％酒精处理15～45s后倒去酒精，加入0.1％升汞溶液处理10～20min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗3～5遍后，置于铺有消毒滤纸的培养皿中，待种胚表面水分吸干，用眼科镊和解剖刀剥离胚乳，获得完整的胚。将离体胚接种于1/2wpm基本培养基上，每处理接种14～16瓶，在25±2℃，16h光照/8h黑暗的人工气候箱培养2week，统计污染率和胚萌发率(表1)。

污染率＝污染外植体数/接成熟胚数×100％

胚萌发率＝萌发外植体数/接成熟胚数×100％

1.2.2离体胚的预处理

采用1.2.1筛选获得方法进行种子脱毒，将离体胚接种到不同基本培养基配制的胚预处理培养基上，置于16h光照/8h黑暗，25±2℃，人工气候箱培养2week后统计胚萌发率和生长状态(表2)；所述胚预处理培养基为：不同基本培养基成分+30g·l^-1蔗糖+2.3g·l^-1水晶洋菜。

采用上述筛选获得基本培养基，设计添加不同浓度tdz的预处理培养基pt1～pt4，将离体胚于预处理培养基上培养2week后，将预处理后的植物组织转至bi2芽诱导培养基上培养6week后，统计预处理后胚的萌发率和丛生芽诱导率(表3)。

1.2.3丛生芽诱导培养

将经pt2培养基预处理2week后的外植体材料接种于含有不同激素种类和浓度的bi1～bi9丛生芽诱导培养基上(表4)，6week后统计愈伤诱导率和丛芽诱导率。

愈伤诱导率＝产生愈伤的外植体数/接种的外植体数×100％

丛芽诱导率＝产生丛芽的外植体数/接种的外植体数×100％

1.2.4丛生芽增殖培养

将经过诱导培养产生的丛芽从基部切离，成为小簇或单独的芽体，接种于芽增殖培养基bp1-bp4上，置于16h光照/8h黑暗，25±2℃，培养室培养8week后统计芽增殖率和生长状态(表5)。

芽增殖系数＝产生丛生芽数/接芽数

1.2.5壮苗培养

将带有2～4片叶子，株高1～2cm，生长良好的单株从丛生芽聚集体上整株切离，由芽增殖培养基转移至壮苗培养基中，置于16h/8h光照/黑暗，25±2℃，培养室培养4～6周，相同条件和培养基继代2～3次。所述壮苗培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，3.0mg·l^-16-ba，1.0mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm基本培养基。

2结果

2.1种子脱毒

离体胚脱毒组合和处理效果如表1所示：以离体胚为外植体进行脱毒总体污染率较低，处理ⅲ和处理ⅳ污染率为0，萌发率分别为62.5％和50％，延长0.1％升汞处理时间可以显著抑制污染率，但会造成对胚的毒害，降低萌发率，酒精使用亦然。平衡控制污染和降低毒害，种子脱毒的最佳处理组合为：去掉种皮后，用75％酒精处理30s，倒去酒精，再加入0.1％升汞处理15min，之后用无菌水冲洗3～8遍，去除胚乳后接种(图2)。

表1：不同脱毒处理对胚培养效果影响

2.2离体胚预处理

2.2.1基本培养基筛选

基本培养基筛选结果如表2所示：除n6外，于其它基本培养基上培养的离体胚均能正常萌发，仅生长状态稍有不同，其中，于1/2wpm基本培养基上培养离体胚可获得萌发率高(71.4％)，生长速度快，发育正常的再生植株。

表2：基本培养基对离体胚发育的影响

2.2.2离体胚预处理

添加激素tdz对离体胚的萌发和丛生芽的诱导有重要影响，离体胚预处理培养基成分和处理效果如表3所示：tdz预处理降低了供试离体胚的萌发率，且随着tdz浓度的升高，胚萌发率逐渐降低；但是tdz预处理显著提高了离体胚产生丛生芽的诱导率，当tdz浓度为0.25mg·l^-1时，可获得最高丛生芽诱导率。

表3：不同浓度tdz预处理对离体胚萌发和丛生芽诱导率影响

综合比较，浙江安息香离体胚预处理培养基优选组合组成如下：1/2wpm+0.25mg·l^-1tdz+30g·l^-1蔗糖+2.3g·l^-1水晶洋菜。

2.3丛生芽诱导培养

将经pt2预处理后的植物材料(图3)转移至丛生芽诱导培养基上，诱导培养基中不同大量元素含量、激素种类、浓度及配比对浙江安息香离体胚芽诱导有重要影响。如表4所示：除bi3(添加1.0mg·l^-1ga3可使预处理的胚停止生长)外，其它诱导培养基均能不同程度的诱导胚产生愈伤组织，但只有特定的激素种类组合和浓度配比才能诱导产生丛芽。当添加3.0mg·l^-1ba和0.2mg·l^-1iba时，丛生芽的诱导率最高，为47.4％，其余激素组合的丛芽诱导率均低于这一组合。

综合比较，浙江安息香丛生芽诱导培养基优选组合组成如下：1/2wpm+3.0mg·l^-1ba+0.2mg·l^-1iba+30g·l^-1蔗糖+2.3g·l^-1水晶洋菜。

表4：芽诱导培养基成分及处理效果

2.4丛生芽增殖培养

将经bi2诱导后产生的丛芽(图4)切离后(图5左)接于丛生芽增殖培养基上，芽增殖培养基中不同激素种类和有无添加水解乳蛋白(lh)(becton，dickinsonandcompany，usa)对芽的增殖系数和生长状态有显著影响。如表5所示：于bi2和bp2培养基内诱导芽增殖均无愈伤产生，直接分化芽，且二者的增殖系数无显著差异，增殖系数在6.3～6.6之间，但bp2中培养的芽生长速度更快(图5右)；添加tdz的培养基可诱导芽产生愈伤组织(bp3、bp4)，芽分化但生长缓慢，单独使用0.75mg·l^-1tdz可导致芽逐渐玻璃化(bp3)。

综合比较，浙江安息香丛生芽增殖培养基优选组合组成如下：1/2wpm+3.0mg·l^-1ba+0.2mg·l^-1iba+500mg·l^-1lh+30g·l^-1蔗糖+2.3g·l^-1水晶洋菜。

表5：芽增殖培养基成分及处理效果

2.5壮苗培养

如图6所示，将增殖培养后获得的芽苗切离后，转入壮苗培养基中培养，每6周继代一次，经2～3次继代后，芽基部逐渐停止分化芽，芽苗开始展叶，并进行正常高生长(图6)。

以上所述壮苗培养基成分组成为：1/2wpm+3.0mg·l^-1ba+1mg·l^-1iba+30g·l^-1蔗糖+2.3g·l^-1水晶洋菜。

3结论

优化后的方法如下：

(1)取材方法：选取当年生籽粒饱满的种子，采摘后用湿纱布包好，暂存于4℃种子冷藏柜。

(2)种子脱毒处理：将带壳种子置于洗洁精+吐温的溶液中浸泡0.5～1h，之后用流水冲洗0.5～1h，转于3％高锰酸钾中浸泡30min，再用无菌水冲洗3～5次，之后于无菌水中浸泡48～72h；将上述浸泡过的种子于超净台内用剥壳器去除坚硬的外种皮，在用尖嘴镊去掉贴在胚乳上的内种皮，用75％酒精处理30s后倒去酒精，加入0.1％升汞溶液处理15min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗3～5遍后，置于铺有消毒滤纸的培养皿中，待种胚表面水分吸干，用眼科镊和解剖刀将胚乳彻底剥离，获得完整饱满的胚。

(3)离体胚的预处理：将经步骤(2)获得的完整胚接于胚预处理培养基上，置于16h/8h光照/黑暗，25±2℃，人工气候箱培养2week；所述胚预处理培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，0.25mg·l^-1tdz，溶剂为1/2wpm基本培养基；所述1/2wpm基本培养基为大量元素含量减半，其余元素含量不变，下同。

(4)丛生芽诱导培养：将经步骤(3)处理的胚轴膨大的离体胚转移到丛生芽诱导培养基上，置于16h光照/8h黑暗，25±2℃，人工气候箱培养6week；所述丛生芽诱导培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，3.0mg·l^-16-ba，0.2mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm基本培养基。

(5)丛生芽增殖培养：将经步骤(4)培养产生的丛生芽转移到丛生芽增殖培养基上，置于16h光照/8h黑暗，25±2℃，培养室培养8week；所述丛生芽增殖培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，0.5g·l^-1水解酪蛋白，3.0mg·l^-16-ba，0.2mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm基本培养基。

(6)壮苗培养：将经步骤(5)培养获得的生长良好的单株从丛生芽聚集体上整株切离，带有2～4片叶子，株高1～2cm，转移到壮苗培养基中，置于16h光照/8h黑暗，25±2℃，培养室培养4～6周，相同条件和培养基继代2～3次。所述壮苗培养基组成如下：2.1～2.5g·l^-1水晶洋菜，3％蔗糖，3.0mg·l^-16-ba，1.0mg·l^-1iba，溶剂为1/2wpm基本培养基。

4讨论

本发明方法以浙江安息香离体胚为外植体材料，通过“种子脱毒分离—基本培养基筛选—离体胚预处理—芽诱导培养—芽增殖培养—壮苗培养”这一流程实现了浙江安息香丛芽的快速繁殖，是浙江安息香无性快繁体系建立的重要组成部分。本发明的关键点在于处理材料的选择、各阶段激素种类和浓度的选择以及处理时间长短的控制。

本发明以浙江安息香离体胚为外植体材料，一方面，是因为离体胚摆脱了种皮和胚乳对胚萌发造成的抑制作用；另一方面，浙江安息香离体胚在未萌发展叶前对植物激素表现出很强的敏感性，便于进行外源激素调控。具体表现在：将离体胚接种于不添加任何激素的1/2wpm上，4周后即可形成完整的小植株，而带种皮或带胚乳的外植体材料接种3个月都无萌发迹象，且离体胚在添加6-ba、tdz、iba、naa或ga的培养基中培养均不能形成正常植株。

植物激素在诱导丛芽分化和增殖的过程中起关键作用。tdz具有很强的类细胞分裂素活性，可通过去除顶端优势促进不定芽或侧芽形成。本发明中，tdz对浙江安息香离体胚诱导丛生芽有非常显著的效果，tdz短期预处理离体胚，后去掉tdz，转入含6-ba和iba的诱导培养基，可以加速诱导胚分化直接产生丛生芽。值得注意的是，在浙江安息香的组织培养中，激素tdz和6-ba对诱导芽增殖表现出不同的诱导途径，tdz是经由愈伤组织产生芽，而6-ba则直接诱导产生丛芽。有研究发现虽然tdz对芽的诱导起作用，但也存在不利于芽延长、生根困难等问题，本发明中出现了相同的情况，在使用0.75mg·l^-1tdz处理丛生芽时，丛芽产生愈伤组织，芽的分化率降低，生长亦受到抑制。本发明中采用tdz短期诱导组织细胞分裂素与生长素自主合成，高浓度6-ba促进芽继续分化和生长的方法建立再生体系，产生了较好的芽诱导和增殖效果。