一种沙地云杉人工种子的合成方法与流程

本发明属于林业无性繁殖技术领域，特别是涉及一种沙地云杉人工种子的合成方法。

背景技术：

沙地云杉(piceamongolica)是世界稀有珍贵树种，是分布在干旱、半干旱沙地唯一的云杉属树种，由于其生存年代久远且具有很强的固沙能力，被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”。它的天然林仅分布于我国浑善达克沙地东缘，以克什克腾旗的白音敖包自然保护区最为集中，是内蒙古沙地特有乡土树种之一。沙地云杉林的存在，对我国三北防护林的建设、防风固沙、控制土地沙漠化以及改善浑善达克沙地东部边缘的农牧区环境均具有无可替代的作用。

由于沙地云杉天然更新出苗率低，死亡率高，且种子生产易受大小年、倒春寒及重齿小蠢虫害等原因影响，使得沙地云杉物种资源不断减少，分布范围不断缩小，甚至已逐渐趋于灭绝。沙地云杉林的保护和恢复己迫在眉睫，而沙地云杉由于资源贫乏，结实间隔期长，天然更新苗生长量低，为实生繁殖和造林带来了很大的困难。扦插繁殖己有研究并得到了可喜成果，但是，对有限的母树来说，其采穗过程中的破坏是极其严重的，并且其扦插繁殖也有很大的障碍，如随着采穗母树年龄的增高，出现了扦插苗生根率降低，根系质量下降和造林早期生长迟缓等老化效应，即生长点的加龄作用；另一种不利现象是高龄母树穗条的位置效应，即母树不同冠层、不同方位枝条内源激素含量和营养物质含量不同，所采穗条的生根力有差异，从而使入选的优树难以继续大量投入生产。

这些都致使沙地云杉繁殖受到阻碍，此外，天然种子繁殖苗木易发生性状分离，影响优良性状的遗传和保持。因此，系统的研究沙地云杉胚性愈伤组织诱导、增殖和萌发的影响因素，建立成熟的沙地云杉体细胞胚胎发生体系，发展人工种子快繁技术，对其种群的稳定性、延续性以及我国沙地绿色可持续发展建设，具有十分重要的生态意义和经济意义。

沙地云杉人工种子合成技术主要是基于沙地云杉体细胞胚胎发生体系的建立，将离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体，就形成了沙地云杉“人工种子”。如公开号为cn105165618a的专利公开了“沙地云杉体细胞胚胎发生的方法”，但是该专利技术是“人工种子”的“胚”的发生部分，并且只是属于实验室工艺方法，难以实现工厂化的大规模生产。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提出一种沙地云杉人工种子合成方法，以提高体细胞胚的萌发率，增强再生植株的适应性使之有较高的移栽成活率，利用生物反应器进行体细胞胚大量培养，从而进行人工种子的制作，最终实现保存和快速繁殖沙地云杉。

为实现上述目的，本发明提供了一种沙地云杉人工种子的合成方法，所述合成方法包括如下步骤：

a、选择优良植株上的未成熟种子进行预处理，将经预处理过的未成熟种子切出幼胚后接种在第一培养基中，培养8～12d后直至诱导出胚性愈伤组织；

b、将诱导的胚性愈伤组织切下接种于第二培养基中，在胚性愈伤组织大量增殖后将所述胚性愈伤组织切成小块接种于分化培养基中，培养45～55d后获得大量的体细胞胚；

c、将所述体细胞胚通过干化后作为包埋物，制得人工种胚；

d、采用1/4lm、0.5mg/l的iba以及20g/l的蔗糖制得人工胚乳；

e、将获取的人工种胚放入质量百分浓度为2～3％的海藻酸钠溶液中，夹出后放入质量百分浓度为1.5～2.5％的cacl2中反应15min，形成沙地云杉人工种皮，用无菌水漂洗3次，吸取表面水分得到人工种子。

优选地，在步骤a中，未成熟种子进行预处理的步骤包括：将优良植株上的未成熟种子在水中泡2h，之后对未成熟种子用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗2～4次，再用2％naclo消毒5～8min，再次用无菌水冲洗3～5次。

优选地，在步骤a中，所述第一培养基为基本培养基、2，4-d1.8～2.7mg/l以及6-ba1.2～2.7mg/l的混合培养基或基本培养基、2，4-d1.8～2.7mg/l、6-ba1.2～2.7mg/l、kt0.3～1.0mg/l、蔗糖20g/l、凝胶2.5g/l、水解酪蛋白1g/l以及肌醇0.2g/l的混合培养基，其中基本培养基为lm、1/2lm或1/4lm。

优选地，在步骤b中，所述第二培养基为1/2lm、2，4-d2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、蔗糖20g/l、凝胶2.5g/l、水解酪蛋白1g/l以及肌醇0.2g/l的混合培养基；所述分化培养基为基本培养基、aba18～30mg/l、蔗糖30g/l、凝胶4.5g/l、水解酪蛋白1g/l、肌醇0.8g/l的混合培养基，其中基本培养基为lm、1/2lm或1/4lm。

优选地，所述体细胞胚干化步骤包括:

将液体悬浮培养的体细胞胚胎在1/2lm培养基、60g/l的peg4000、0.5g/l的水解络蛋白下进行固体培养3～5天；

将固体培养得到的体细胞胚胎置于滤纸上，通过滤纸容器法进行体细胞胚干化，干化3～5天后将体细胞胚进行包埋处理。

优选地，在所述步骤a和步骤b中，培养基的ph控制在5.75～5.80，培养条件为温度23±1℃、暗培养。

本发明还提供了一种沙地云杉人工种子，包括人工种胚、人工胚乳及包覆在所述人工种胚和人工胚乳外的人工种皮，所述人工种胚采用愈伤组织诱导出的体细胞胚，所述体细胞胚一部分直接进行包埋，所述体细胞胚另一部分通过干化后作为包埋物，所述人工胚乳包括1/4lm、0.5mg/l的iba以及20g/l的蔗糖，所述人工种皮为将人工种胚和人工胚乳浸入人工种皮液后固化制成，所述人工种皮液包括质量百分浓度为2～3％海藻酸钠以及质量百分浓度为1.5～2.5％的cacl2。

优选地，所述体细胞胚干化步骤包括:将液体悬浮培养的体细胞胚胎在1/2lm培养基、60g/l的peg4000、0.5g/l的水解络蛋白下进行固体培养3～5天；

将固体培养得到的体细胞胚胎置于滤纸上，通过滤纸容器法进行体细胞胚干化，干化3～5天后将体细胞胚进行包埋处理。

优选地，所述人工种胚和人工胚乳浸入人工种皮液中的时间为15min。

优选地，所述人工种皮液包括质量百分浓度为2.5％海藻酸钠以及质量百分浓度为2％的cacl2。

基于上述技术方案，本发明的优点是：

本发明的沙地云杉人工种子的合成方法，通过繁育的人工种子用于沙地云杉大规模化种植用的种苗需求，该方法制备的人工种子，可以使繁殖后的苗株遗传性好、不发生突变，提高发芽率，从而保护了沙地云杉的优良品质。本发明将沙地云杉体细胞胚胎作为人工种子的外植体，可以使繁殖后的沙地云杉种苗生长性较为一致、不发生突变，进一步改善了种苗的品质。

本发明方法合成的沙地云杉人工种子不受季节限制，人工种子加入特殊成分，具有更好的营养供应和抗病能力。沙地云杉人工种子的合成将解决沙地云杉种子产量低、苗木短缺和资源保护及优良性状的保持等重大问题，其还有便于运输，使沙地云杉更好的应用于沙地治理等生态建设和营造用材林。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为沙地云杉人工种子合成方法流程图；

图2为沙地云杉人工种子合成示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

本发明提供了一种沙地云杉人工种子，包括人工种胚、人工胚乳及包覆在所述人工种胚和人工胚乳外的人工种皮，所述人工种胚采用愈伤组织诱导出的体细胞胚，所述体细胞胚一部分直接进行包埋，所述体细胞胚另一部分通过干化后作为包埋物，所述人工胚乳包括1/4lm、0.5mg/l的iba以及20g/l的蔗糖，所述人工种皮为将人工种胚和人工胚乳浸入人工种皮液后固化制成，所述人工种皮液包括质量百分浓度为2～3％海藻酸钠以及质量百分浓度为1.5～2.5％的cacl2。

沙地云杉人工种子由3个部分组成，即人工种胚、人工胚乳及人工种皮。

人工种胚是人工种子的核心，沙地云杉人工种子制备选择的是体细胞胚作为人工种胚，选取愈伤组织诱导出的体细胞胚，一部分直接进行包埋，一部分通过干化后作为包埋物。优选地，所述体细胞胚干化步骤包括:将液体悬浮培养的体细胞胚胎在1/2lm培养基、60g/l的peg4000、0.5g/l的水解络蛋白下进行固体培养3～5天，有利于体细胞胚的萌发；将固体培养得到的体细胞胚胎置于滤纸上，通过滤纸容器法进行体细胞胚干化，干化3～5天后将体细胞胚进行包埋处理。

人工胚乳即为人工种胚提供营养物质和激素，是促进人工种胚的萌发和生长发育的物质，通常包含基本培养基、植物生长调节剂、糖类以及其他添加物等。人工胚乳的选择关乎人工种子的萌发，本发明在进行人工胚乳制备时，分别选用ms、1/2ms、lm、1/2lm、1/4lm作为基本培养基，添加不同浓度iba(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/l)，蔗糖(15、20、25g/l)或麦芽糖(15、20、25g/l)，活性炭(0.1、0.5、0.8mg/l)以及多菌灵(0.1、0.5、0.8mg/l)。经过理论分析并结合实际试验，发现添加活性炭后，人工胚乳变硬，不利于均匀包裹人工种胚和容易开裂。通过研究筛选确定沙地云杉人工种子的最佳人工胚乳配方为1/4lm+iba0.5mg/l+蔗糖20g/l。

人工种皮是指包裹在人工种胚和人工胚乳外的膜，其作用是和天然种皮一样起保护作用。人工种皮既要避免种子内的水分和营养丧失，又要保证其通气性和抵抗外来压力的冲击。本发明选用了具有生物活性、成本低、无毒、工艺操作简单的海藻酸钠作为人工种皮的主要成分。

本发明在进行人工种皮制备时，首先使海藻酸钠溶液(1.0、2.0、2.5、3.0％)与cacl2溶液(1.0、2.0、3.0、4.0％)进行不同反应时间(5、10、15、20min)。经过理论分析并结合实际试验，发现2.5％海藻酸钠在2％cacl2溶液中反应15min，人工种皮效果最好，其颜色透明，富有弹性，无尾，种子均匀较圆，硬度适中。

本发明还提供了一种沙地云杉人工种子的合成方法，如图1、图2所示，所述合成方法包括如下步骤：

a、选择优良植株上的未成熟种子进行预处理，将经预处理过的未成熟种子切出幼胚后接种在第一培养基中，培养8～12d后直至诱导出胚性愈伤组织；

b、将诱导的胚性愈伤组织切下接种于第二培养基中，在胚性愈伤组织大量增殖后将所述胚性愈伤组织切成小块接种于分化培养基中，培养45～55d后获得大量的体细胞胚；

c、将所述体细胞胚通过干化后作为包埋物，制得人工种胚；

d、采用1/4lm、0.5mg/l的iba以及20g/l的蔗糖制得人工胚乳；

e、将获取的人工种胚放入质量百分浓度为2～3％的海藻酸钠溶液中，夹出后放入质量百分浓度为1.5～2.5％的cacl2中反应15min，形成沙地云杉人工种皮，用无菌水漂洗3次，吸取表面水分得到人工种子。

具体地，所述沙地云杉人工种子合成方法的具体流程步骤如下：

(1)以未成熟种子为外植体，在水中泡个2h；在超净工作台中，将未成熟种子用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用2％naclo消毒6min，用无菌水冲洗3～5次。

(2)将经步骤(1)处理过的未成熟种子切出里面的幼胚，接种于下列第一培养基中：1/2lm+2，4-d2.4mg/l+6-ba1.2mg/l+蔗糖20g/l+凝胶2.5g/l+水解酪蛋白1g/l+肌醇0.2g/l，ph控制在5.75～5.80、温度为23±1℃、暗培养，培养10d后开始诱导出愈伤组织，诱导率82％。

(3)当步骤(2)中诱导的胚性愈伤组织，切下接种于以下第二培养基中：1/2lm+2，4-d2.0mg/l+6-ba1.0mg/l+蔗糖20g/l+凝胶2.5g/l+水解酪蛋白1g/l+肌醇0.2g/l，ph控制在5.75～5.80、温度为23±1℃、暗培养，此培养过程中诱导的胚性愈伤组织增殖更多。

(4)当步骤(3)所述的胚性愈伤组织增殖更多时，切成小块接种于以下分化培养基中：1/2lm+aba22mg/l+蔗糖30g/l+凝胶4.5g/l+水解酪蛋白1g/l+肌醇0.8g/l，ph控制在5.75～5.80、温度为23±1℃、暗培养，50d后获得大量的体细胞胚胎。

(5)人工种胚的获取：当步骤(4)所述的选取愈伤组织诱导出的体细胞胚，一部分直接进行包埋，一部分通过干化后作为包埋物。干化步骤包括，①液体悬浮培养，在1/2lm+peg400060g/l+酸水解络蛋白0.5g/l下进行固体培养3～5天；②滤纸容器法，通过滤纸容器法进行体细胞胚干化，干化3～5天后将体细胞胚进行包埋制备人工种子。

(6)人工种皮制备:选用不同浓度海藻酸钠溶液(1％、2％、2.5％、3％、4％)与不同浓度的cacl2溶液(1.5％、2％、2.5％)进行反应，其结果如下所示：

由上表发现，2.5％海藻酸钠在2％cacl2溶液中反应15min，人工种子效果最好，其颜色透明，富有弹性，无尾，种子均匀较圆，硬度适中。

(7)人工胚乳制备:分别选用ms、1/2ms、lm、1/2lm、1/4lm作为基本培养基，添加不同浓度iba(0.3mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l)，蔗糖或麦芽糖、活性炭以及多菌灵进行培养，发现添加多菌灵和活性炭后，人工种子变硬，最终确定最佳人工胚乳为1/4lm+iba0.5mg/l+蔗糖20g/l。

(8)人工种子的包埋：将步骤(5)获取的人工种胚放入2.5％海藻酸钠溶液中，再用镊子夹出后放入2％cacl2中反应15min，形成沙地云杉人工种皮，用无菌水漂洗3次，吸取表面水分得到沙地云杉人工种子。

本发明的沙地云杉人工种子的合成方法，通过繁育的人工种子用于沙地云杉大规模化种植用的种苗需求，该方法制备的人工种子，可以使繁殖后的苗株遗传性好、不发生突变，提高发芽率，从而保护了沙地云杉的优良品质。本发明将沙地云杉体细胞胚胎作为人工种子的外植体，可以使繁殖后的沙地云杉种苗生长性较为一致、不发生突变，进一步改善了种苗的品质。

本发明方法合成的沙地云杉人工种子不受季节限制，人工种子加入特殊成分，具有更好的营养供应和抗病能力。沙地云杉人工种子的合成将解决沙地云杉种子产量低、苗木短缺和资源保护及优良性状的保持等重大问题，其还有便于运输，使沙地云杉更好的应用于沙地治理等生态建设和营造用材林。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。