一种二倍体野生甘薯Ipomoea.trifida植株再生体系构建方法与流程

本发明属于植物细胞培养领域，具体涉及一种二倍体野生甘薯ipomoea.trifida植株再生体系构建方法。
背景技术：
：甘薯属包含了600-700个甘薯近缘野生种，近缘野生种具有丰富的遗传多样性和重要的基因资源，将高淀粉、抗旱、抗病、高干率、耐病毒等这些优良基因导入甘薯栽培种中，能为解决甘薯遗传基础狭窄，有效资源匮乏，品种遗传改良缓慢等问题提供解决办法(陆漱韵等,1998,甘薯育种学)。近缘野生种二倍体具有基因组相对简单、基因拷贝数低的特点，许多基因组序列研究集中在二倍体，如ipomoeatrifida(h.b.k.)g.don、ipomoeatriloba的基因组测序已经完成(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/new.shtml)。ipomoeatrifida(i.trifida)同甘薯栽培种的亲缘关系最近，是栽培甘薯的祖先种之一，在遗传学、细胞学和生理学上它被分析认为是甘薯的模式植物。以往对甘薯近缘野生材料根的研究主要集中在trifida的须根(fr)、铅笔根(pr)或粗根(tr)，很少有关于储藏根的研究报道，这可能是由于缺乏具有储藏根的二倍体野生材料。大部份的野生二倍体i.trifida块根不膨大，申请人完成了能够形成膨大块根的二倍体i.trifidavar.y22的基因组测序及分析工作，得到了62.27gb的基因组分析数据，共预测到了30227个基因模型，其中79.76％的基因得到了来自叶、花、柱头、花粉、茎、根和种子等7个不同组织，所有基因模型中有84.75％具有同源性。通过对基因家族进化，根比较转录组，qtl作图，qpcr的综合分析，我们发现了新的基因bmy11，它与淀粉酶1的同源性为47.12％，可能在储藏根形成过程中所扮演了重要的角色。同时我们发现在y22块根发育过程中，bmy11、储藏蛋白以及参与碳水化合物代谢和木质化等块根发育的关键基因的表达模式与栽培甘薯中相似，这表明甘薯块根发育基因可在i.trifida中来进行鉴定。因此具有膨大的储藏根的甘薯近缘野生型二倍体i.trifidavar.y22，可以作为研究基因组复杂的六倍体栽培甘薯块根发育的理想模式植株。利用已获得的i.trifidavar.y22基因组序列来进行块根发育的基因和块根发育机制的研究，对了解近缘野生二倍体甘薯、栽培甘薯的发育机制及甘薯复杂的进化史有重要的意义。高效的二倍体再生技术是利用基因工程手段将二倍体作为模式植物对甘薯基因进行功能研究的重要前提。目前甘薯某些栽培种的再生转化体系已经得到了突破性的进展，但近缘野生种种类较多，块根膨大的野生种较少，直接用野生种进行遗传转化的研究也相对较少，其研究远远落后于甘薯栽培种。上世纪90年代对甘薯野生近缘种的研究稍多，主要集中在植株再生和原生质体的融合，刘庆昌等对甘薯品种高系14号及其近缘野生种1.triloba和i.lacunosal进行了原生质体植株再生研究，从离体培养植株的叶柄分离出原生质体，将其培养在含有0.05mg/l2，4-d和0.5mg/l激动素(kt)的ms培养基中，获得了高频率的愈伤组织。将直径达2-3mm的小愈伤组织转移到添加0.05mg/l2，4-d的ms培养基上，3-6周后，将愈伤组织进一步转移到添加iaa和bap的ms培养基上，一些愈伤再生出了植株。刘庆昌等用peg融合法融合甘薯品种高系14号(6x)及其近缘野生种i.pomoeatrilobac(2x)的原生质体，将融合原生质体培养在含有0.05mg/l2,4-d和0.5mg/l激动素(kt)的改良ms培养基中诱导愈伤组织，将其中的37个愈伤组织转移到添加0.2mg/liaa和1.0mg/lbap的ms培养基上，2个愈伤组织再生出植株。将未再生植株的35个愈伤组织培养在ms基本培养基上，17个愈伤组织再生出植株。王家旭以甘薯(l.batatas)品种高自1号及其近缘野生种1.trifida(2x)和1.trifida(4x)的花药为外植体，接种在含有不同植物生长调节物质配比的ms培养基上，其中1.trifida(2x)和1.trifida(4x)在ms+2mg/l2,4-d+2mg/lkt+2mg/liaa的培养基上愈伤组织诱导率分别为40％，40.4％。在分化培养基上，高自1号和1.trifida(2x)的愈伤组织有根的分化，根分化率分别达到14.3％和18.9％。李丽等用聚乙二醇(peg)融合法融合甘薯地方品种兴义薯和二倍体近缘野生种三浅裂野牵牛(1.trifida)这2个品种的原生质体，将融合原生质体培养在含有0.05mg/l2,4-d和0.5mg/lkt的改良ms培养基中，得到小愈伤并增殖。张冰玉将甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞原生质体和近缘野生种1.triloba的叶柄原生质体用peg融合法融合后，培养在含有0.05mg/l2,4-d和0.5mg/lkt的改良ms液体培养基中。将愈伤组织培养在添加2.0mg/lbap的ms培养基上，形成了不定根，将具有不定根的愈伤组织进一步培养在ms基本培养基上，共获得137株再生植株。song等(2004)以beniazuma的茎段、叶柄和盘为外植体，通过农杆菌介导法，侵染外植体通过器官发生途径再生，经鉴定获得包含nptii-gusa-hpt的转基因植株。王晶珊等从bitambi的胚性愈伤组织分离得到的原生质体，培养在含有0.05mg/l2,4-d和0.5mg/lkt的改良ms培养基中。将形成的小愈伤组织转移到添加0.05-0.2mg/l2,4-d和0-0.5mg/lkt的ms培养基上增殖，进一步转移到ms基本培养基上时，愈伤组织再生出植株，再生率达50.0％。翟红等利用甘薯近缘野生种i.triloba叶片诱导愈伤组织研究植株再生，诱导培养基为ms+0.2mg/l2,4-d，愈伤组织放置于添加1mg/lbap的ms培养基上进行培养，2-3周后愈伤组织表面形成淡绿色的不定根。将愈伤组织连同其上的不定根一起转移到ms基本培养基上，得到再生植株。刘爱华等对甘薯近缘野生种1.littoralisblune愈伤组织植株再生进行研究。将叶片、叶柄外植体培养在添加0.02-0.05mg/l2,4-d和0.5-2.0mg/l激动素(kt)的ms培养基上将形成的愈伤组织转移到ms基本培养基上3-4周后，观察到植株再生。叶片、叶柄愈伤组织再生植株频率分别达55.5％和50.0％。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种甘薯近缘野生二倍体植株再生体系的建立方法。本发明的技术方案为：一种二倍体野生甘薯ipomoea.trifida植株再生体系构建方法，包括如下步骤：(1)甘薯二倍体无菌苗的培养：晴天中午采取甘薯野生近缘种i.trifidvar.y22外植体靠顶端外植体，清水冲洗后用多菌灵溶液浸泡，随后用蒸馏水清洗，然后用酒精消毒，再然后用naclo3消毒，最后用无菌水清洗，将外植体切成茎段放置于灭菌后的ms培养基上进行组培苗的培养。(2)甘薯二倍体愈伤的诱导：在无菌条件下采集经步骤(1)处理后的i.trifidavar.y22带顶芽的茎段，在显微镜下剥离茎尖，放于含有0.05mg/l2,4-d的ms诱导培养基上诱导胚性愈伤组织。(3)无菌苗的分化：将步骤(2)得到的的愈伤组织放置于分化培养基中进行植株分化再生，分化培养基为含有3mg/l6-ba、1mg/lkt、0.2mg/liaa的ms培养基。进一步地，步骤(1)的具体方法为：晴天中午采取甘薯野生近缘种i.trifidavar.y22外植体靠顶端外植体，自来水冲洗后用多菌灵溶液浸泡2小时，随后用蒸馏水清洗，在超净工作台上用75％酒精消毒4分钟，然后用1％的naclo3消毒4分钟，然后用无菌水清洗6次，将外植体切成3-4cm长带节的茎段放置于灭菌后的ms培养基上进行组培苗的培养。甘薯近缘野生种种类繁多，遗传背景丰富，相同的培养基配方但不一定适合不同的材料，翟红等利用甘薯近缘野生种i.triloba叶片诱导愈伤组织研究植株再生中所用的材料i.triloba与本发明中所用材料i.trifida是不同的野生近缘种，利用该文献没有解决本发明中i.trifidavar.y22材料的再生。且方法一中的用的外植体为叶片，本发明利用茎尖诱导愈伤组织。刘爱华等对甘薯近缘野生种1.littoralisblune愈伤组织植株再生进行研究中所用的外植体不是茎尖而是甘薯近缘野生种1.littoralisblune的叶片、叶柄外植体，且近缘野生种1.littoralisblune与i.trifida也是不同的野生种，利用该技术对本专利中的i.trifidavar.y22进行此方案的操作，大部分的外植体生出大量的根，不形成愈伤，少量能膨大的愈伤转移ms培养基上也未得到植株。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的i.trifidavar.y22的有效植株再生体系得以建立，植株的诱导率为60％，使得的trifida基因组中的发掘的大量基因能够开展后续的研究。附图说明图1.i.trifidavar.y22茎尖愈伤组织；图2.i.trifidavar.y22茎尖愈伤组织植株再生。具体实施方式1、甘薯二倍体无菌苗的培养晴天中午采取甘薯野生近缘种i.trifidavar.y22外植体靠顶端外植体，自来水冲洗后用多菌灵溶液浸泡2小时，随后用蒸馏水清洗，在超净工作台上用75％酒精消毒4分钟，然后用1％的naclo3消毒4分钟，然后用无菌水清洗6次，将茎段切成3-4cm长带节的茎段放置于灭菌后的ms培养基上进行组培苗的培养。2、甘薯二倍体愈伤的诱导在无菌条件下采取i.trifidavar.y22带顶芽3cm长的茎段，在显微镜下剥离茎尖，放于6种含有不同2,4-d浓度的ms诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，6种培养基2,4-d的浓度分别为0.01mg/l、0.02mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l、1mg/l的。每种培养基上茎尖个数为20个。结果表明当茎尖放置于0.05mg/l2,4-d的ms培养基上时，半月后能见到质地紧密的乳白色胚性愈伤组织逐渐生成，见图1。跟甘薯栽培种诱导的黄色胚性愈伤有较大的区别，愈伤诱导率为80％，而其他几种培养基上则没有愈伤组织的生成。3、无菌苗的分化将茎尖置于0.05mg/l2,4-d的ms培养基上诱导愈伤组织，一个月后将乳白色的愈伤组织放置于配置的8种不同的诱导培养基上，进行植株分化再生。8种培养基具体的配比成分含量见表1，每种培养基放置30粒愈伤。分析结果发现1、3、4、7、8号培养基中，均为胚性愈伤长大变绿并出现大量根的分化，见图2中a；2号培养基不产生愈伤直接分生出多株植株，见图2中b；4号及6号培养基出现叶片分化，未形成植株，见图2中c；5号培养基出现植株的分化，图2中e、f、g为5号培养基y22愈伤植株再生的过程，先有植株分化，再有根的生成，继而有多株植株的生成，植株的诱导率为60％。因此i.trifidavar.y22的最佳分化培养基组成是ms+3mg/l6-ba+1mg/lkt+0.2mg/liaa。表18种培养基成分含量序号6-bamg/lktmg/labamg/liaamg/lbapmg/l122332420.15310.2620.570.2180.22本发明的i.trifidavar.y22的有效植株再生体系得以建立，使得的trifida基因组中的发掘的大量基因能够开展后续的研究。当前第1页12