一种新型小鼠原位胰腺癌模型及其建立方法与流程

本发明专利属于医疗技术领域，具体涉及到一种新型的小鼠原位胰腺癌模型及其建立方法。

背景技术：

胰腺癌是一个进展性的致命肿瘤，每年有216,000例新发患者；其预后很差，诊断后1年生存率大约为23％，而5年生存率不超过5％。在美国，大约有46,000例新发的胰腺癌患者，而39,590例死于胰腺癌。因此，研究胰腺癌的发病机制、寻找胰腺癌的新型治疗靶点对于胰腺癌的诊治具有重大意义。然而，目前国内可以使用的原位胰腺癌模型缺乏，严重制约着胰腺癌发病机制和诊治新策略的进一步研究。

技术实现要素：

本发明专利的目的是提供一种新型的小鼠原位胰腺癌模型建立的方法。该方法能够稳定地建立一种小鼠的原位胰腺癌模型，用于胰腺癌发病机制的研究、胰腺癌新型治疗策略的研发和胰腺癌新型治疗方法预后的判断。

为实现上述目的，本新型发明专利采取的具体技术方案为：

一种新型小鼠原位胰腺癌模型的建立方法，将100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞的溶液注入近胰腺乳头的胰管端，所述溶液由成熟稳定的胰腺癌细胞株和凝胶液体组成。

优选的，

成熟稳定的胰腺癌细胞株和基质胶的体积比为1:4。

所述凝胶液体为基质胶(美国corning公司)。

具体步骤为：对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，在16倍显微镜下，将靠近胰腺处的胆总管利用黄金夹夹住，封闭胆管；在小肠壁上找到胰腺乳头，将胰腺乳头近胰腺端的胰管利用黄金夹夹住，封闭胰管；利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞，从近胰腺乳头的被夹住的胰管端注射胰腺癌细胞进入胰腺内，使其充分进去胰腺，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胰管针孔封闭；20分钟后，先打开胰腺乳头处的黄金夹，使胰管被夹处畅通后，打开胆总管端的黄金夹，胆道通畅；利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立。

具体的，准备好现有成熟稳定的胰腺癌细胞株和20％基质胶(防止细胞回流)，对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胰腺及胆管。在16倍显微镜下，将靠近胰腺处的胆总管利用黄金夹夹住，封闭胆管。在小肠壁上找到胰腺乳头，将胰腺乳头近胰腺端的胰管利用黄金夹夹住，封闭胰管。利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞，在16倍显微镜下，从近胰腺乳头的被夹住的胰管端注射胰腺癌细胞进入胰腺内，使其充分进去胰腺，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胰管针孔封闭。将注射有胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，使细胞沉淀在胰腺内。20分钟后，先打开胰腺乳头处的黄金夹，使胰管被夹处畅通后，打开胆总管端的黄金夹，胆道通畅。胰管胆管通畅后，观察针孔处是否有破裂溢出胰液。若没有溢出，利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立。

将注射有胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，再打开胰腺乳头处的黄金夹。

优选的，在16倍显微镜下进行。

另外，本发明还提供了一种小鼠原位胰腺癌模型，其建立方法为，将100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞的溶液注入近胰腺乳头的胰管端，所述溶液由成熟稳定的胰腺癌细胞株和基质胶(美国corning公司)组成，成熟稳定的胰腺癌细胞株和基质胶的体积比为：1:4。

对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，在16倍显微镜下，将靠近胰腺处的胆总管利用黄金夹夹住，封闭胆管；在小肠壁上找到胰腺乳头，将胰腺乳头近胰腺端的胰管利用黄金夹夹住，封闭胰管；利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞，从近胰腺乳头的被夹住的胰管端注射胰腺癌细胞进入胰腺内，使其充分进去胰腺，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胰管针孔封闭；20分钟后，先打开胰腺乳头处的黄金夹，使胰管被夹处畅通后，打开胆总管端的黄金夹，胆道通畅；利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立。

具体的，准备好现有成熟稳定的胰腺癌细胞株和20％基质胶(防止细胞回流)，对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胰腺及胆管。在16倍显微镜下，将靠近胰腺处的胆总管利用黄金夹夹住，封闭胆管。在小肠壁上找到胰腺乳头，将胰腺乳头近胰腺端的胰管利用黄金夹夹住，封闭胰管。利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞，在16倍显微镜下，从近胰腺乳头的被夹住的胰管端注射胰腺癌细胞进入胰腺内，使其充分进去胰腺，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胰管针孔封闭。将注射有胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，使细胞沉淀在胰腺内。20分钟后，先打开胰腺乳头处的黄金夹，使胰管被夹处畅通后，打开胆总管端的黄金夹，胆道通畅。胰管胆管通畅后，观察针孔处是否有破裂溢出胰液。若没有溢出，利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立。

将注射有胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，再打开胰腺乳头处的黄金夹。

优选的，在16倍显微镜下进行。

另外，本发明还提供了一种制作小鼠原位胰腺癌模型的溶液，由成熟稳定的胰腺癌细胞株和凝胶液体组成；胰腺癌细胞株和凝胶液体的体积比为：1:4。优选的，所述凝胶液体为基质胶。

本发明采用小鼠胰管内逆向注射(从胰头向胰尾方向沿胰管注射)胰腺癌细胞的方法构建小鼠的原位胰腺癌模型。本发明提供的方法简单有效，本发明建立的小鼠模型能够为临床医生和科研工作者的基于动物模型的科学研究提供条件。本发明所述溶液20％凝胶液体防止细胞回流，便于模型建立。

附图说明

图1本发明模型建立的材料及具体过程图。

图2本模型胰腺癌的自然发展过程的模型解剖症状及胰腺肿瘤的组织病理学结构图。

具体实施方式

(1)实验材料准备：超净工作台，无影灯，16倍显微镜(图1a)，4％水合氯醛，裸鼠固定板，纱布片，棉签，消毒酒精，胰岛素针，普通1ml注射器，眼科剪1把，显微眼科弯镊2把，显微持针钳1把，持针器1把，3-0的关腹线，医用胶带纸，眼科撑开器，黄金夹2个(图1b)，胰腺癌细胞(图1c中由美兰代替)。balb/c-nu裸小鼠(图1d)。

(2)本模型所采用的技术方案：准备好现有成熟稳定的胰腺癌细胞株和20％凝胶液体(防止细胞回流)，对balb/c-nu裸小鼠全身麻醉固定，酒精消毒腹部，沿腹中线破开腹部，充分暴露胰腺及胆管(图1e)。在16倍显微镜下，将靠近胰腺处的胆总管利用黄金夹夹住，封闭胆管(图1f)。在小肠壁上找到胰腺乳头，将胰腺乳头近胰腺端的胰管利用黄金夹夹住，封闭胰管(图1g)。利用胰岛素针抽取100微升含200-500万单位的胰腺癌细胞，在16倍显微镜下，从近胰腺乳头的被夹住的胰管端注射胰腺癌细胞进入胰腺内(图1h)，使其充分进去胰腺，利用棉签压迫住进针处，然后退出胰岛素针，并始终保持压迫，直至胰管针孔封闭(图1i)。将注射有胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠静置20分钟，使细胞沉淀在胰腺内(图1j)。20分钟后，先打开胰腺乳头处的黄金夹，使胰管被夹处畅通后，打开胆总管端的黄金夹，胆道通畅。胰管胆管通畅后，观察针孔处是否有破裂溢出胰液(图1k)。若没有溢出，利用3-0的关腹线将免疫缺陷小鼠腹部缝合，完成模型建立(图1l)。

(3)本模型胰腺癌的自然发展过程：该模型建立后，模型鼠从肿瘤生长至死亡，时间约为1个月左右。后期消瘦，精神状态直线下滑，多数伴有黄疸等症状。模型自然死亡后，解剖结构和症状如图2a-2c所示，胰腺肿瘤的组织病理学结构如图2d所示。