一种产生不育后代的方法与流程
政府权利声明
本文所述工作的各个方面得到了美国农业部国家食品和农业研究所2019-67030-29002拨款的支持。美国政府可能对这些发明拥有某些权利。
本发明普遍涉及对淡水和海水生物进行绝育的方法。
背景技术：
以下段落并不承认其中讨论的任何内容是过往技术或本领域技术人员的知识的一部分。
面对野生渔业产量的下降，全球粮食供应将不得不更多地依赖养殖业，以满足日益增长的公众对海产品的需求。与动物养殖不同，在水产养殖中，许多物种在生产过程中性成熟，导致数十亿美元的生产力损失和产品质量下降。此外，养殖鱼类可以逃逸，并对水生生态系统产生负面影响。因此，水产养殖业应首选养殖水生物种的绝育。
鱼类绝育的一种方法是诱导三倍体。三倍体诱导是生产不育鱼类最常用和研究最多的方法。一般来说，三倍体鱼是通过对受精卵施加温度或压力冲击，迫使第二极体结合，产生具有三个染色体组(3n)的细胞而产生的。三倍体鱼不能发育正常的性腺，因为额外的染色体组会干扰减数分裂。对于工业规模，对成批鱼卵可靠地施加压力或温度冲击的过程是复杂的，而且成本高昂。物理处理诱导三倍体的另一种方法是遗传诱导三倍体，它是四倍体与二倍体杂交的结果。然而，由于胚胎存活率低和生长缓慢，四倍体鱼很难繁殖。在一些例子中，三倍体雄性产生一些正常的单倍体精子细胞，从而使雄性授精鱼卵，尽管其效率降低。此外，在一些物种中，负性表现特征与三倍体表型有关，包括降低发育和对疾病的敏感性。
另一种对鱼进行绝育的方法是激素处理。然而，在许多情况下，包括密集的长期处理，这些过程没有理想的不育效果，并且/或与鱼类生长死亡率的下降有关。此外，涉及合成类固醇的处理可能导致更高的死亡率。
另一种使鱼类绝育的方法是暂时沉寂控制生殖系发育的基因，包括将反义修饰的寡核苷酸微注射到单个卵子中，以清除原始生殖细胞。然而，单独微注射卵子在商业规模上是不可行的。
另一种使鱼类绝育的方法是使用转基因技术，其中包括整合一个转基因的步骤，该转基因会导致生殖细胞死亡或干扰其迁移模式，导致其在发育中的胚胎中被切除。然而，转基因除了沉寂外，还受到位置效应的影响。因此，此类方法在被认为可用于商业用途之前，必须经过扩展的监管审查程序。
另一种使鱼绝育的方法是用膜渗透性反义寡核苷酸或小分子抑制剂进行卵浴处理，这需要体外受精。然而，在水硬化过程或早期胚胎发育过程中处理卵子可能会产生机械、热和/或化学应力，这可能会对卵子和/或胚胎的生存能力产生负面影响。此外，未配备卵浴设备的孵化场将增加生产成本。
在生产不育鱼类、甲壳类动物或软体动物方面的改进是可取的。
技术实现要素：
以下的介绍旨在向读者介绍本规范，但不定义任何发明。一项或多项发明可存在于下文或本文件其他部分所述的方法组成部分或方法步骤的组合或子组合中。发明人不会仅由于在权利要求书中不描述此类其他发明而放弃或公开否认其对本规范中公开的任何一项或多项发明的权利。
前述的一种或多种淡水和海水生物绝育的方法可能会导致：(1)绝育效果不足，例如，对卵子和/或发育中的胚胎施加机械、热和/或化学应力；(2)运行成本增加，例如，在养殖业时间中实施大量改变，不能跨多个物种转移，增加生产时间，增加不育生物的百分比，降低发育和增加对疾病的敏感性，增加不育生物的死亡率，或以上情况的结合；(3)基因通过培养的非本地物种流向野生种群和新的栖息地；(4)绝育效率不足，例如，通过微量注射无效地去除原始生殖细胞；或(5)以上情况的结合。
本发明提供了通过破坏其原始生殖细胞发育但不损害其到达成体阶段的能力来生产不育淡水和海水生物的方法。本发明可包括以下一个或多个实用例：(1)通过例如利用自然交配过程而不是体外受精来提高绝育的效率；(2)通过例如减少商业规模的昂贵设备或处理来降低操作成本，可在多个物种间转移，减少饲料，减少生产时间，增加达到性成熟的有机体的百分比，增加性成熟有机体的物理尺寸，或以上情况的组合；(3)减少培养的非本地物种的基因流向野生种群和新栖息地；(4)通过例如减少性腺发育的能量损失来提高养殖效能；(5)通过例如减少或避免位置效应和沉寂和/或b)导致产生不育后代的发生来提高绝育效率；或(6)与一种或多种先前提出的用于淡水和海水生物绝育的方法相比，以上情况的组合。
本发明还讨论了培育用于生产不育淡水和海水生物的亲鱼淡水和海水生物的方法，以及亲鱼本身。
本发明提供一种产生不育鱼、甲壳动物或软体动物的方法。该方法包括以下步骤：繁殖(i)可育的半合子突变的雌性鱼类、甲壳类动物或软体动物和(ii)可育的半合子突变的雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物，通过基因型选择选择纯合子的雌性前体，并且繁殖纯合子雌性前体以产生不育的鱼类、甲壳类动物或软体动物软体动物。突变可能破坏原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，并且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
突变可包括：pgc发育基因的顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变；编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因中的突变；参与运输或形成种质的基因中的突变；参与生殖细胞突指定、维持或迁移有关的基因突变；或其组合。
编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因可能包括：hnrnpab,elavl1,ptbp1a,igf2bp3,tia1,tiar,rbpms42,rbpms24,khsrp或dhx9。参与种质运输或形成的基因可编码含有多都铎结构域的蛋白质、驱动蛋白样蛋白质或衔接蛋白。含有多都铎结构域的蛋白质可能是tdrd6。衔接蛋白可能是hook2。生殖细胞分化、维持或迁移的基因可能是表达非编码rna的基因。非编码rna可能是mir202-5p。
顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变可能破坏pgc发育基因的母体活性，并且在发育后期不会破坏pgc发育基因的功能。pgc发育基因可以是nanos3、dnd1或piwi样基因。
本发明还提供了一种可育的纯合突变雌性鱼类、甲壳类动物或软体动物，用于生产不育鱼类、甲壳类动物或软体动物。这种突变破坏了原始生殖细胞(pgc)发育基因的转录后调控，从而降低了pgc发育基因的母体效应，并且不会损害该基因的体细胞功能。
突变可包括：pgc发育基因顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变；编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因中的突变；参与运输或形成种质的基因中的突变；生殖细胞突变与生殖细胞的指定、维持或迁移有关的基因突变；或其组合。编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因可为：hnrnpab,elavl1,ptbp1a,igf2bp3,tia1,tiar,rbpms42,rbpms24,khsrp或dhx9。参与种质运输或形成的基因可编码含有多都铎结构域的蛋白质、驱动蛋白样蛋白质或衔接蛋白。含有多都铎结构域的蛋白质可能是tdrd6。衔接蛋白可能是hook2。生殖细胞分化、维持或迁移的基因可能是表达非编码rna的基因。非编码rna可能是mir202-5p。顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变可能破坏pgc发育基因的母体活性，并且在发育后期不会破坏pgc发育基因的功能。pgc发育基因可以是nanos3、dnd1或piwi样基因。
本发明还提供了一种培育可育纯合子突变雌性鱼类、甲壳类动物或软体动物以产生不育鱼类、甲壳类动物或软体动物的方法。该方法包括以下步骤：用野生型雄性鱼类、甲壳纲动物或软体动物、半合子突变雄性鱼类、甲壳纲动物或软体动物或纯合子突变雄性鱼类、甲壳纲动物或软体动物培育可育纯合子突变雌性鱼类、甲壳纲动物或软体动物，以产生不育鱼类、甲壳纲动物或软体动物。突变可能破坏原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，并且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
突变可包括：pgc发育基因顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变；编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因中的突变；参与运输或形成种质的基因中的突变；生殖细胞突变与生殖细胞的指定、维持或迁移有关的基因突变；或其组合。编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因可以是：hnrnpab,elavl1,ptbp1a,igf2bp3,tia1,tiar,rbpms42,rbpms24,khsrp或dhx9。参与种质运输或形成的基因可编码含有多都铎结构域的蛋白质、驱动蛋白样蛋白质或衔接蛋白。含有多都铎结构域的蛋白质可能是tdrd6。衔接蛋白可能是hook2。生殖细胞分化、维持或迁移的基因可能是表达非编码rna的基因。非编码rna可能是mir202-5p。
顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变可能破坏pgc发育基因的母体活性，并且在发育后期不会破坏pgc发育基因的功能。pgc发育基因可以是nanos3、dnd1或piwi样基因。
本发明还提供了一种培育可产生不育鱼类、甲壳类动物或软体动物的可育纯合子突变雌性鱼、甲壳类动物或软体动物的方法。所述方法步骤包括：繁殖(i)可育的半合子突变的雌鱼、甲壳类动物或软体动物和(ii)可育的半合子突变的雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物或纯合子突变的雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物，并通过基因型选择选择纯合子的雌性祖先。突变可能破坏原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，并且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
突变可包括：pgc发育基因顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变；编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因中的突变；参与运输或形成种质的基因中的突变；生殖细胞突变与生殖细胞的指定、维持或迁移有关的基因突变；或其组合。编码参与pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因可能是:hnrnpab,elavl1,ptbp1a,igf2bp3,tia1,tiar,rbpms42,rbpms24,khsrp或dhx9。参与种质运输或形成的基因可编码含有多都铎结构域的蛋白质、驱动蛋白样蛋白质或衔接蛋白。含有多都铎结构域的蛋白质可能是tdrd6。衔接蛋白可能是hook2。生殖细胞分化、维持或迁移的基因可能是表达非编码rna的基因。非编码rna可能是mir202-5p。
顺式作用的5'或3'utr调控序列中的突变可能破坏pgc发育基因的母体活性，并且在发育后期不会破坏pgc发育基因的功能。pgc发育基因可以是nanos3、dnd1或piwi样基因。
本发明的其他方面和特征对于本领域的普通技术人员将在结合附图查看以下具体示例的描述后变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图仅以示例的方式描述当前公开的方法和生物体的示例。
图1是示出产生不育鱼类、甲壳类动物或软体动物并繁殖突变系的方法示例的流程图。
图2a和b是说明本文所述的诱变策略的概述的流程图，该流程用于识别影响pgc发育和所选突变等位基因的进一步繁殖的母体效应突变体。
图3的a至d是罗非鱼f0代不同生长阶段的照片，包括双等位基因敲除。
图4的a和b是罗非鱼多基因打靶后的照片。
图5的a至c是在原始生殖细胞中表达绿色荧光蛋白(gfp)的稳定转基因罗非鱼系的表示和照片。zpc5:egfp:tnos3’utr结构:罗非鱼zpc5启动子是卵母细胞特异性启动子，在第一次减数分裂前的卵子发生过程中活跃。因此，来自杂合子转基因雌性的所有胚胎(图5之b)都继承了基因egfp:tnos3’utrmrna，通过顺式作用rna要素在其3'utr(罗非鱼纳米3'utr)中的作用，定位并在pgc中专一表达(图5之c)。
图6是向dna序列引入定制核苷酸改变的过程的图示。mhdr＝微同源定向修复；ha＝同源臂。剪刀符号代表预期被切割的目标部位。该方法用于编辑图35所示的dnd13’utr中的保守基序。
图7是说明f0突变体识别和选择策略的图示和图。突变等位基因通过荧光pcr和基因特异性引物进行鉴定，目的是扩增靶位点周围的区域(120-300bp)。对于荧光pcr，在反应中加入基因特异性引物和两个带有荧光团6-fam或ned的正向寡核苷酸。使用野生型dna的对照反应来确认每个基因座上是否存在单峰扩增。结果扩增子通过毛细管电泳(ce)和添加的liz标记的大小标准来确定精确到碱基对分辨率(retrogen)的扩增子大小。原始跟踪文件在峰值扫描软件(thermofisher)上进行分析。相对于野生型峰对照的峰大小决定突变的性质(插入或缺失)和长度。峰的数目表示镶嵌程度。我们选择了携带最少突变等位基因(最好2-4峰)的f0镶嵌首建者。
图8显示的是熔融曲线图，该图允许可视化杂合子、纯合子突变体和野生型样品的基因型。绘制了荧光负变化与温度(-df/dt)的关系曲线。每个轨迹代表一个样本。本例中野生型等位基因的熔化温度为～81℃(野生型峰)，纯合突变产物的熔化温度(纯合缺失峰)为～79℃。剩余轨迹表示杂合子。
图9的a和b是nanos33’utr基因座突变的图示。图9a是nanos3基因的示意图。外显子1显示为阴影框；翻译起始和终止位点分别为atg和taa。图9b是野生型参考序列和来自nanos33'utr突变罗非鱼不同后代的7个种系突变等位基因的序列。删除和插入分别用破折号和突出显示的大写字母表示。
图10是f3纯合kif5bδ1/δ1突变体中颅面和尾部畸形的照片。箭头表示骨骼畸形。
图11的a至d是图解说明来自tiar、kshrp、tia1、dhx9、igf2bp3、elavl1、elavl2、cxcr4a、ptbp1a、hnrnpab、rbm24、rbm42、tdrd6、hook2、mir-202-5p突变f0雌性的母性效应不育表型的图表和照片。图11的a和b显示了f0突变雌性4天龄胚胎(≥12个胚胎)中pgc的平均数量。与野生型对照雌性胚胎后代比较，差异显著(p≤0.01)。竖条显示标准偏差。图11c代表雌性转基因系tg
(zpc5:egfp:nos3'utr)的4个dpf罗非鱼胚胎后代，显示正常pgc计数。gfp(+)生殖细胞(n＝40)纵向聚集在肠道前部。图11d表示f0tg(zpc5:egfp:nos33'utr)雌性系后代的躯干区域，其携带靶向基因突变，并且在4dpf处显示不同的pgc计数(从n＝1到15)。箭头显示绿色荧光蛋白(+)细胞(绿色)。
图12的a至h是说明f0突变体雌性后代的母性效应不育表型的照片和图表。图12a显示了f0携带nos33'utr突变雌性(右侧)4个月大的罗非鱼雄性后代(4个月大)与年龄匹配的对照精巢相比的腹腔和萎缩精巢(箭头所示)。图12的b和c表示f0nos33'utr突变雌性的f1雄性后代的平均性腺体指数(n＝15/组)。显示平均值±标准差。图12d显示了f0nos33'utr突变雌性的6个月大的f1后代的解剖透明精巢。图12e显示了来自携带tia1突变的f0雌性的f1后代的解剖性腺。pgc计数低(<5pgc/胚胎)的子代在6个月龄时精巢透明，卵巢萎缩，而pgc计数高(>15pgc/胚胎)的f1子代生殖腺成熟。图12f代表pgc计数高或低的f1子代的平均性腺体指数。图12g显示了f1雌性后代的腹腔，这些后代来自携带rbms42突变的f0雌性(右侧)或雄性(左侧)。箭头指向卵巢，白色箭头指向萎缩的弦状卵巢。图12h显示了携带ptbp1a突变的f0雌性(下侧)或f0雄性(上侧)罗非鱼雌性后代的腹腔。
图13的a到c是在kif5ba基因座上选择的核酸酶诱导的缺失的图解。图13a是kif5b基因的示意图。外显子(e1-25)显示为阴影框；5'和3'非翻译区域显示为开放框。图13b是野生型参考序列(序列号(seqidno)：88)，其中来自kif5bf0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号：89)的序列显示1nt缺失(序列中的一个破折号)。据预测，这种移码会产生一种截短的蛋白质，其终止于氨基酸110而不是962。图13c是wt(序列号:90)和突变kif5b等位基因(序列号:91)的预测蛋白质序列，其中前110个氨基酸与野生型tiar蛋白质的相同。
图14的a到c是在tiar基因座上选择的突变等位基因的图解。图14a是tiar基因的示意图。外显子(e1-12)显示为阴影框，5'和3'非翻译区显示为开放框；翻译起始和终止位点分别为atg和taa。图14b是具有来自tiarf0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:93)的野生型参考序列(序列号:92)。这一11nt插入被预测会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸119而不是382位。图14c是wt(序列号:94)和突变型tiar等位基因(序列号:95)的预测蛋白质序列，其中前118个氨基酸与野生型tiar蛋白质的相同，具有一个以下错误编码的氨基酸。改变的氨基酸被突出显示。
图15的a至c是khsrp基因座上所选突变等位基因的图解。图15a是罗非鱼khsrp基因的示意图。外显子(e1-22)显示为阴影框，翻译起始和终止位点分别为atg和tga。箭头指向目标外显子。图15b显示了来自khsrpf0突变体罗非鱼后代的野生型参考(序列号:96)和所选突变体等位基因(序列号:97)。缺失用破折号表示。这些连续的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸410而不是695位。图15c是wt(序列号:98)和截短突变体khsrp蛋白质(序列号:99)的预测蛋白质序列，其中前387个氨基酸与野生型kshrp蛋白质的氨基酸相同，并且以下23个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图16的a至c是dhx9基因座上所选突变的图示。图16a是罗非鱼dhx9基因的示意图。外显子(e1-26)显示为阴影框；5'和3'未翻译区域显示为阴影框。箭头指向目标外显子。图16面板b是野生型参考序列(序列号:100)和来自dhx9f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:101)的序列。7个核苷酸缺失的位置用破折号表示。这种移码突变被预测会产生一个截短的蛋白质，其终止于氨基酸82而不是1286。图16c显示了wt(序列号:102)和截短突变体dhx9蛋白质(序列号:103)的预测蛋白质序列，其中前81个氨基酸与野生型dhx9蛋白质的氨基酸相同，并且以下氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图17的a到c是在tia1基因座上选择的突变的图示。图17a是罗非鱼tia1基因的示意图。外显子(e1-12)显示为阴影框，5'和3'非翻译区显示为开放框；翻译起始和终止位点分别为atg和taa。图17b显示来自tia1f0突变罗非鱼后代的野生型参考序列(序列号:104)和所选种系突变等位基因(序列号:105)的序列。序列中的破折号表示10个核苷酸的缺失。序列中的这种移码预计会产生一个截短的蛋白质，其终止于氨基酸27而不是387位。图17c是wt(序列号:106)和截短突变体tia1蛋白质的预测蛋白质序列，其中前15个氨基酸与野生型tia1蛋白质(序列号:107)的氨基酸相同，并且以下12个氨基酸是错误编码的。改变的氨基酸被突出显示。
图18的a至c是igf2pb3基因座上所选突变的图示。图18a是罗非鱼igf2pb3基因的示意图。外显子(e1-15)显示为阴影框。箭头指向目标外显子。图18b是野生型参考序列(序列号:108)和来自igf2bp3f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:109)的序列。插入的核苷酸用粗体字和下划线表示。据预测，这种移码会产生一种截短的蛋白质，其终止于氨基酸206而不是589位。图18c是预测的wt(序列号:110)和截断突变蛋白(序列号:111)的蛋白质序列，其中前173个氨基酸与野生型igfpbp3蛋白质的氨基酸相同，并且以下33个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图19的a至c是elavl1基因座上所选突变的图示。图19a是罗非鱼elavl1基因的示意图。外显子(e1-7)显示为阴影框；5'和3'未翻译区域显示为开放框。箭头指向目标外显子。图19b是野生型参考序列(序列号:112)和来自elavl1f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:113)的序列。3kb的缺失用破折号表示。据预测，这种移码会产生一种截短的蛋白质，终止于氨基酸105而不是359位。图19c是预测的wt(序列号:114)和截断突变蛋白(序列号:115)的蛋白质序列，其中前45个氨基酸与野生型elavl1蛋白质的氨基酸相同，并且以下60个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图20的a至c是elavl2基因座上所选突变的图示。图20a是罗非鱼elavl2基因的示意图。外显子(e1-7)显示为阴影框。箭头指向目标外显子。图20b是野生型参考序列(序列号:116)和来自elavl2f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:117)的序列。8个核苷酸的缺失用破折号表示。据预测，这种移码会产生一种截短的蛋白质，其终止于氨基酸40而不是372位。图20c是预测的wt(序列号:118)和截断突变蛋白(序列号:119)的蛋白质序列，其中前12个氨基酸与野生型elavl2蛋白质的氨基酸相同，并且以下28个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图21的a至c是cxcr4a基因座上所选突变的图示。图21面板a是罗非鱼cxcr4a基因的示意图。外显子(e1-2)显示为阴影框；5'和3'未翻译区域显示为开放框。箭头指向目标外显子。图21b是野生型参考序列(序列号:120)，具有来自cxcr4af0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:121)。8个核苷酸的缺失用破折号表示。据预测，这种移码会产生一种截短的蛋白质，其终止于氨基酸26而不是372位。图21c是wt(序列号:122)和截短突变蛋白(序列号:123)的预测蛋白质序列，其中前169个氨基酸与野生型cxcr4a蛋白质的氨基酸相同，并且以下8个氨基酸是错误编码的。改变的氨基酸被突出显示。
图22的a到c是ptbp1a基因座上所选突变的图示。图22a是罗非鱼ptbp1a基因的示意图。外显子(e1-16)显示为阴影框。5'和3'未翻译区域显示为开放框。箭头指向目标外显子。图22b是野生型参考序列(序列号：124)，其中包含来自ptbp1af0突变罗非鱼的所选种系突变等位基因序列(序列号：125和126)。13个核苷酸和1.5kb的缺失用破折号表示。据预测，这些移码突变会产生截短的蛋白质，终止于氨基酸80和346，而不是538位。图22c是wt(序列号:127)和截断突变蛋白(序列号:128和129)的预测蛋白质序列，其中前71和72个氨基酸与野生型ptbp1a蛋白质的氨基酸相同，并且以下9和274个氨基酸是错误编码的。改变的氨基酸被突出显示。
图23的a至c是nos3基因座上所选突变的图解。图23面板a是罗非鱼nos3基因的示意图。外显子(e1)显示为阴影框。箭头指向外显子1中的靶基因座。图23b是野生型参考序列(序列号:130)，其具有来自nos3f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:131)。用破折号表示的5个核苷酸的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸145而不是219位。图23c是预测的wt(序列号:132)和截短突变蛋白(序列号:133)的蛋白质序列，其中前140个氨基酸与野生型nanos3蛋白质的氨基酸相同，并且以下5个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图24的a至c是dnd1基因座上所选突变的图示。图24a是罗非鱼dnd1基因的示意图。外显子(e1-e6)显示为阴影框。5'和3'未翻译区域显示为开放框。箭头指向外显子6中的目标位点。图24b是野生型参考序列(序列号:134)，其具有来自dnd1f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:135)。用破折号表示的5个核苷酸的缺失预计会产生一个延长的蛋白质，其终止于氨基酸324而不是320位。图24c是预测的wt(序列号:136)和截断突变蛋白(序列号:137)的蛋白质序列，其中前316个氨基酸与野生型dnd1蛋白质的氨基酸相同，并且以下8个氨基酸是错误编码的。改变的氨基酸被突出显示。
图25的a至c是在hnrnpab的编码区中选择的突变的图示。图25a是罗非鱼hnrnpab基因的示意图。外显子(e1-e7)显示为阴影框。箭头指向目标基因座。图25b是野生型参考序列(序列号:138)，其具有来自hnrnpabf0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:139)。用破折号表示的8个核苷酸的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸29而不是332位。图25c是预测的wt(序列号:140)和截断突变蛋白(序列号:141)的蛋白质序列，其中前27个氨基酸与野生型hnrnpab蛋白质的氨基酸相同，并且以下2个氨基酸是错误编码的。改变的氨基酸被突出显示。
图26的a至c是在hermes(rbms)基因座上选择的突变的图示。图26a是罗非鱼hermes基因的示意图。外显子(e1-e6)显示为阴影框。箭头指向目标基因座。图26b是野生型参考序列(序列号:142)，其具有来自hermesf0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:143)。粗体字和下划线所示的16个核苷酸插入预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸61而不是174位。图26c是wt(序列号:144)和截断突变蛋白(序列号:145)的预测蛋白质序列，其中前52个氨基酸与野生型hermes蛋白的氨基酸相同，并且以下9个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图27的a至c是rbm24基因座上所选突变的图示。图27a是罗非鱼rbm24基因的示意图。外显子(e1-e4)显示为阴影框。箭头指向目标基因座。图27b是野生型参考序列(序列号:146)，具有来自rbm42f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:147)。用破折号表示的7个核苷酸的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸54而不是235位。图27c是wt(序列号:148)和截断突变蛋白(序列号:149)的预测蛋白质序列，其中前42个氨基酸与野生型rbm24蛋白质的氨基酸相同，并且以下12个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图28的a至c是在rbm42基因座上选择的突变的图示。图28a是罗非鱼rbm42基因的示意图。外显子(e1-e11)显示为阴影框。箭头指向目标基因座。图28b是野生型参考序列(序列号:150)，具有来自rbm42f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:151)。用破折号表示的7个核苷酸缺失预计将产生终止于氨基酸178而不是408位的截短蛋白质。图28c是wt(序列号:152)和截断突变蛋白(序列号:153)的预测蛋白质序列，其中前158个氨基酸与野生型rbm42蛋白质的氨基酸相同，并且以下20个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图29的a至c是tdrd6基因座上所选突变的图示。图29a是罗非鱼tdrd6基因的示意图。外显子(e1-e2)显示为阴影框。箭头指向目标基因座。图29b是野生型参考序列(序列号:154)，其具有来自tdrd6f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因的序列(序列号:155)。用破折号表示的10个核苷酸的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸43而不是1630位。图29c是wt(序列号:156)和截短突变蛋白(序列号:157)的预测蛋白质序列，其中前31个氨基酸与野生型tdrd6蛋白质的氨基酸相同，并且以下12个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图30的a至c是hook2基因座上选择的突变的图示。图30a是罗非鱼hook2基因的示意图。外显子(e1-e22)显示为阴影框。5'和3'未翻译区域显示为开放框。箭头指向目标基因座。图30b是野生型参考序列(序列号:158)和来自hook2f0突变罗非鱼后代的所选种系突变等位基因(序列号:159)的序列。用破折号表示的2个核苷酸的缺失预计会产生一个截短的蛋白质，终止于氨基酸158而不是708位。图30c是wt(序列号:160)和截断突变蛋白(序列号:161)的预测蛋白质序列，其中前102个氨基酸与野生型hook2蛋白的氨基酸相同，并且以下56个氨基酸被错误编码。改变的氨基酸被突出显示。
图31的a至c是mir-202基因座处所选突变的图示。图31a显示了forna(力定向rna)rna可视化工具(kerpedjiev，hammer等人著，2015年)预测的mir-202前罗非鱼(oreochromisniloticus)的二级结构。箭头指向两个成熟mir-202的第一个和最后一个核苷酸的位置。图31b显示了野生型(序列号:162)和所选突变体(序列号:163到165)的核苷酸序列比对，缺失由覆盖mir-202-5p区域的虚线表示。mir-202-5p序列加下划线一次，mir-202-3p序列加下划线两次。mir-202-5p的种子序列显示在点框中。图31c显示来自fornarna可视化工具的前mir-202突变等位基因(mir-202δ7/+,mir-202δ8/+)的二级结构。箭头表示两个成熟mir-202的第一个和最后一个核苷酸。
图32的a至c是显示不同硬骨鱼nos33’utr的模因分析结果的图示。图32a显示了不同硬骨鱼类(牙鲆(paralichthysolivaceus)(序列号：166)、斑点叉尾鲶(ictaluruspunctatus)(序列号：170)、虹鳟(oncorhynchusmykiss)(序列号：171)、斑马鱼(daniorerio)(序列号：168)、尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)(序列号：169)、美达卡(oryziaslatipes)(序列号：172)、鲤鱼(cyprinuscarpio)(序列号：167)、河豚(tetraodon)(序列号：173)nos3基因3’utr中保守基序分布的模因方块图。3'utr按比例绘制。保守基序1(17-nt长)和2(40-nt长)分别用黑色和灰色框表示。图32b显示了17个nt长标志的序列，显示了模因工具识别的顶部保守基序。字母的高度决定了出现在图案中某个位置的概率。一级序列以块格式排列，显示序列名称、链(+)、序列号、起始核苷酸位置和p值位点(按位置p值排序的位点)。图32c显示了40个nt长的标志序列，显示了模因工具识别的顶部保守基序。字母的高度决定了出现在图案中某个位置的概率。以块格式显示序列名称、链(+)起始核苷酸位置和p值位点(按位置p值排序的位点)的一级序列比对。
图33的a和b是罗非鱼nos33’utr保守的19nt基序1中选择的核酸酶诱导的缺失的图示。图33a是野生型参考序列(序列号:169)，具有来自nos33'utrf0突变罗非鱼后代的两个选择的种系突变等位基因(分别为8nt和32nt长缺失，序列号:188和189)的序列。用破折号表示的缺失可以部分或完全去除由模因识别的17nt长的保守基序1(如图32所示)。mir-430推测的靶序列gcacuu(giraldez，mishima等人著，2006年)显示在点框中。图33b显示了fornarna可视化工具预测的保守基序1的二级结构(kerpedjiev，hammer等人著，2015年)。箭头指向基序1的第一个和最后一个核苷酸。
图34的a至c是显示各种硬骨鱼dnd13'utr的模因分析结果的图示。图34a显示了从鱼类到青蛙(大西洋鲑鱼(salmosalar)(序列号174)、大西洋鳕鱼(gadusmorhua)(序列号175)、虹鳟(oncorhynchusmykiss)(序列号176)、尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)(序列号：177)、河豚(takifugurubripes)(序列号：178)、斑马鱼(daniorerio)(序列号：179)、海峡鲶(ictaluruspunctatus)(序列号：180)、非洲爪蟾(xenopustropicalis)(序列号：181))。3'utr按比例绘制。保守基序1和2分别用黑色和灰色框表示。图34b和c显示了与模因工具识别的两个顶部保守基序相对应的19nt和46nt长标志的序列。字母的高度决定了出现在图案中某个位置的概率。一级序列以块格式排列，显示序列名称、链(+)起始核苷酸位置和p值位点(按位置p值排序的位点)。
图35的a和b是罗非鱼dnd13’utr保守的19nt基序1中所选核酸酶诱导的核苷酸替换的图示。图35a是野生型参考序列(序列号:177)，其中保守的dnd1
19nt-基序1序列在黑框中突出显示，其预测的最小自由能(mfe)二级结构来自fornarna可视化工具(kerpedjiev，hammer等人著，2015年)。mir-23d假定靶序列agtgatt(mimat0043480)(eshel，shirak等人著，2014年)显示在点框中。图35b是用最保守的基序1核苷酸(序列号:190)替换等位基因替换(图6中描述的方法)后编辑的序列。rnafold网络服务器不能预测编辑的dnd1基序1的二级结构(fornarna可视化工具(kerpedjiev，hammer等人著，2015年))。
图36的a至c是显示不同硬骨鱼elavl23'utr的模因分析结果的图示。图36a显示了模因方块图，显示了从鱼类到青蛙(斑马鱼(daniorerio)(序列号：184)、鲶鱼(ictaluruspunctatus)(序列号：185)、尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)(序列号：183)、梅达卡(oryziaslatipes)(序列号：186)、大西洋鲑鱼(salmosalar)(序列号：182)，非洲爪蟾(热带爪蟾)(序列号：187))等不同物种的elavl2基因3’utr中保守基序的分布。3'utr是按精确的比例绘制的。保守基序1和2分别用黑色和灰色框表示。图36的b和c显示了由模因工具识别的30nt长的保守基序1和2的标志序列。字母的高度决定了出现在图案中某个位置的概率。块格式的主要序列比对显示：序列名称、链(+)、序列号、起始核苷酸位置和p值位点(按位置p值排序的位点)。
图37的a和b是说明对来自tiar、kshrp、tia1、dhx9、igf2bp3、elavl1、elavl2、cxcr4a、ptbp1a、hnrnpab、rbm24、rbm42、tdrd6、hook2、mir-202-5p突变f1雌性后代的pgc数量进行统计分析的图表。各列显示了f0突变雌性个体4天龄胚胎(≥12个胚胎)中pgc的平均数量。除khsrp和elavl1外，其余各组与野生型对照雌性后代相比，差异极显著(p≤0.01)。竖条显示标准偏差。
图38的a和b是图解和照片，显示了所选罗非鱼dnd1突变体的世代、基因型和相关表型。图38a：在细胞分裂阶段之前，通过将针对dnd1编码序列的工程核酸酶显微注射到罗非鱼胚胎的胚盘中产生dnd突变体。其中一只雄性首建者与一只野生型雌性交配，并在f1代产生杂合突变体。这些f1突变体dndδ5/+的交配产生f2代，其中约25％为纯合突变体(dnd敲除dndδ5/δ5)雄性，缺乏生殖细胞(通过解剖性腺分析证实)。图38b:1年龄(411克)dnd-敲除dndδ5/δ5中雄性性腺的形态，显示具有正常大小精巢的半透明精巢解剖结构。
图39的a和b是图解和照片，显示了所选罗非鱼nos3突变体的世代、基因型和相关表型。图39a:nos3突变体是通过在细胞分裂阶段之前将针对nos3编码序列的工程核酸酶显微注射到罗非鱼胚胎的胚盘中产生的。其中一只雄性首建者与一只野生型雌性交配，并在f1代产生杂合突变体。这些f1突变体nos3δ5/+的交配产生f2代，其中约25％是两性纯合突变体(nos3敲除nos3δ5/δ5)，雌性缺乏生殖细胞(通过解剖性腺分析证实)。图39b：与半合子同胞nos3δ5/+相比，nos3-敲除nos3δ5/δ5中雄性性腺的形态显示出弦状卵巢。
图40的a和b是图解和照片，显示了所选罗非鱼elavl2突变的世代、基因型和相关表型。图40a：在细胞分裂阶段之前，通过将针对elavl2编码序列的工程核酸酶显微注射到罗非鱼胚胎的胚盘中产生elavl2突变体。其中一只雄性首建者与一只野生型雌性交配，并在f1代产生杂合突变体。这些f1突变体elavl2δ8/+的交配产生f2代，其中约25％是两性纯合突变体(elavl2敲除elavl2δ8/δ8)，雌性缺乏生殖细胞(通过解剖性腺的分析证实)。图40b：与半合子同胞elavl2δ8/+相比，elavl2基因敲除elavl2δ8/δ8中雄性性腺的形态显示出弦状卵巢。
图41的a至d是示出dnd1到β-珠蛋白3’utr交换实验的图示和照片。图41a是靶向整合β-珠蛋白3'utr后罗非鱼dnd1基因的示意图。使用引物(箭头)确认β-珠蛋白3'utr盒整合到罗非鱼基因组中。图41b是来自不同处理鱼的gdnapcr产物的凝胶电泳。泳道1、3-5、7和9-14中的497bp特异性pcr扩增子表明成功整合了dnd1(死端1)开放阅读框下游的β-珠蛋白3'utr。图41c组显示了罗非鱼这种整合纯合物(dnd1bglo3’utr/bglo3’utr)腹膜腔内的半透明精巢。图41d是表明dnd1bglo3’utr/bglo3’utr罗非鱼的精巢中不存在vasa特异性rtpcr扩增子的凝胶。
图42的a和b是显示nos33'utr纯合雌性(nos33'utrδ32/δ32)后代的母性效应不育表型的照片和图表。图42a显示了6个月龄的后代的性腺解剖图，其雄性和雌性具有完全(透明的精巢和弦状卵巢)到部分不育表型。图42b：nos33'utrδ32/δ32雌性4日龄胚胎后代中pgc数量的统计分析。平均pgc数(≥12胚/柱)比对照组减少93％。
图43的a和b是显示tiar纯合子突变雌性(tiar-/-)后代的母性效应不育表型的照片和图表。图43a显示了6个月龄的雄性(左侧图像显示为腹膜腔)和雌性(右侧图像显示为腹膜腔)具有严重不育表型的子代的解剖性腺。图43b：tiar突变体雌性6个月龄后代性腺体指数的统计分析。平均pgc数(≥12胚/柱)比对照组减少93％。
图44的a至c是显示两组分系统(上位性)中母体效应突变相互作用性质的图。利用加性假设上位性，双ko系中上位性的缺失被认为是单ko效应的总和。我们用以下公式测量单个ko的总期望值：tpa＝la1+(1-la1)xla2，其中la1是ko#1引起的pgc消融水平，la2是ko#2引起的pgc消融水平。我们计算的总pgc消融水平与测量的消融水平相差几个百分点，表明没有上位性。计算的la与测量的la显示在每个图表下方的括号中。
图45是说明对来自tiar、kshrp、tia1、dhx9、elavl1、cxcr4a和nos33'utr纯合子突变f2雌性后代的pgc数量的统计分析的图表。各列显示了f0突变雌性个体4天龄胚胎(≥12个胚胎)中pgc的平均数量。各试验组与野生型对照雌性后代相比，差异极显著(p≤0.01)。竖条显示标准偏差。
具体实施方式
一般而言，本发明提供一种产生不育鱼类、甲壳动物或软体动物的方法。该方法包括繁殖(i)可育的半合子突变的雌鱼、甲壳类动物或软体动物，使用的是(ii)可育的半合子突变的雄鱼、甲壳类动物或软体动物，通过基因型选择选择纯合子的雌性祖先，并繁殖纯合子雌性祖先以产生不育的鱼、甲壳类动物或软体动物。这种突变破坏了原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
本发明还提供了一种培育可育纯合子突变雌性鱼类、甲壳类动物或软体动物以产生不育鱼类、甲壳类动物或软体动物的方法。该方法包括用野生型雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物、半合子突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物或纯合子突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物培育可育的纯合子突变雌性鱼类、甲壳类动物或软体动物以产生不育鱼类、甲壳类动物或软体动物。这种突变破坏了原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
本发明进一步提供了一种培育产生不育鱼类、甲壳动物或软体动物的可育纯合子突变雌性鱼、甲壳动物或软体动物的方法。该方法包括繁殖(i)可育的半合子突变的雌鱼、甲壳类动物或软体动物和(ii)可育的半合子突变的雄鱼、甲壳类动物或软体动物，或纯合子突变的雄鱼、雄鱼、甲壳类动物或软体动物，并通过基因型选择选择纯合子的雌性祖先。这种突变破坏了原始生殖细胞(pgc)发育基因的母体效应，且不会损害纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。
在本发明的上下文中，鱼类是指任何没有四肢和手指的有鳃有骨动物。鱼类的例子包括鲤鱼、罗非鱼、鲑鱼、鳟鱼和鲶鱼。在本发明的上下文中，甲壳动物是指任何节肢动物分类单元。甲壳类动物的例子包括螃蟹、龙虾、小龙虾和虾。在本发明的上下文中，软体动物是指具有软的未分割身体的任何无脊椎动物，通常被封闭在钙质壳中。软体动物的例子包括蛤蜊、扇贝、牡蛎、章鱼、鱿鱼和石鳖。半合子鱼类、甲壳类动物或软体动物是指任何二倍体的鱼、甲壳类动物或软体动物，其携带一个含有突变的染色体副本，但匹配的染色体没有突变。纯合子鱼类、甲壳类动物或软体动物是指任何携带两份含有突变的染色体的二倍体鱼类、甲壳类动物或软体动物。
不育鱼类、甲壳动物或软体动物是指与野生型鱼类、甲壳动物或软体动物相比，通过繁殖或杂交产生后代的能力减弱的任何鱼类、甲壳动物或软体动物；例如，不育鱼类、甲壳动物或软体动物可能具有降低了约50％、约75％、约90％、约95％的后代，或者100％产生后代的可能性。相比之下，可育的鱼类、甲壳动物或软体动物是指任何具有通过繁殖或杂交产生后代能力的鱼类、甲壳动物或软体动物。繁殖和杂交是指雄性物种和雌性物种交配产生后代的过程。
母体效应是指由于母体向卵母细胞提供rna、蛋白质或其组合，生物体的表型预期来自其母体的基因型的情况。破坏pgc发育基因的母体效应是指损害或废除在卵母细胞中母体表达的一个或多个基因的功能，以及在pgc发育、维持、迁移或其组合中的功能。在卵母细胞中母性表达的一个或多个基因的组合以及在pgc发育、维持、迁移或其组合中的功能的破坏，并不损害或废除与生存能力、性别决定、生育能力有关的一个或多个基因的合子功能，或携带所述损伤或废除基因功能的纯合祖细胞的组合。值得注意的是，在卵母细胞中母性表达的一个或多个基因的组合以及在pgc发育、维持、迁移或其组合中的功能的破坏可能损害或废除不涉及生存能力、性别决定、生育能力的一个或多个基因的合子功能，或纯合祖细胞的组合，例如，参与免疫、代谢、应激或疾病反应的祖细胞。破坏在卵母细胞中母性表达的一个或多个基因的组合，并在pgc的发育、维持、迁移或其组合中发挥功能，会破坏配子的形成，并可能导致不育和性未成熟的有机体。
种质基因已经过敲除实验，导致其失活。然而，在一些种质基因被敲除后，没有观察到预期的表型和/或检测到多效性表型，从而导致：1)发育成缺陷鱼，不能繁殖产生不育后代；或2)发育成不能产生存活后代的鱼。然而，其他种质基因被敲除，导致一个纯合突变体卵巢、精巢或两者发育受损，因此无法繁殖产生不育后代。发明人已经发现，通过引入一个或多个影响pgc功能的特定突变而不损害或废除突变生物体发育成性成熟成鱼的能力，即不损害其生存能力、性别决定、生育能力或其组合，允许产生一种可以用来产生不育后代的亲鱼。重要的是，一个或多个特异性突变破坏了pgc形成的母体功能，使得纯合子突变雌性的后代正常，但生殖细胞耗尽。
破坏pgc发育基因母性效应功能的突变，是指直接或间接损害或消除pgc发育基因母性效应功能的任何基因突变。直接或间接影响基因功能是指：(1)突变一个或多个pgc发育基因的编码序列；(2)突变对一个或多个pgc发育基因的转录或转录后调控至少有一定控制的非编码序列；(3)突变参与一个或多个pgc发育基因转录后调控的另一基因的编码序列；(4)突变参与种质的运送、形成或组合的另一基因的编码序列，例如一个或多个pgc发育基因的基因产物；(5)突变参与生殖细胞规范、维持、迁移或其组合的另一基因的编码序列；(6)突变参与一个或多个pgc发育基因表观遗传调控的另一基因的编码序列；或(7)其组合，从而破坏或消除pgc发育基因的功能。基因功能是指基因本身的直接功能和基因表达过程中产生的分子的功能，如rna和蛋白质的功能。损伤基因功能是指与基因的野生型对应物的功能相比，基因功能的数量减少约10％、约25％、约50％、约75％、约90％或约95％。废除基因功能，或功能丧失，是指与基因野生型对应物的功能相比，基因功能量减少100％。如本文所用，“野生型”通常指母体效应功能未被破坏的生物体。“野生型对应物”一般指同龄、同种等的正常生物。
突变可以是有利害关系的的核苷酸序列的任何类型的改变，例如，核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸替换。一个或多个pgc发育基因的编码序列中的优选突变是引起移码突变的核苷酸插入或核苷酸缺失，其可导致非功能性蛋白质的产生。
突变一个或多个pgc发育基因的编码序列是指对编码序列的任何类型的突变：(1)损害或消除参与pgc发育、维持、迁移或其组合的pgc发育基因的母体效应功能；(2)不损害或消除生存能力，携带所述突变的纯合祖细胞的性别决定、生育能力或其组合。原始生殖细胞发育基因的编码序列的突变的例子包括tia1、tiar、khsrp、dhx9、elavl1、igf2bp3、ptbp1a、tdrd6、hook2和hnrnpab的编码序列的突变。发明人发现，突变某些pgc基因的编码序列，损害或消除参与pgc发育、维持、迁移或其组合的pgc发育基因的母体效应功能，也损害或消除生存能力、性别决定、生育能力，或携带所述突变的纯合祖细胞的组合，例如hnrnph1、hermes、elavl2、kif5b。
令人惊讶的是，发明人发现突变：(1)在一个或多个pgc发育基因的转录或转录后调控中至少具有某种控制的非编码序列；(2)突变参与pgc发育基因转录后调控的另一个基因的编码序列；(3)突变另一个与生殖细胞运送、形成或组合有关的基因的编码序列；(4)突变另一个与生殖细胞规格、维持、迁移或组合有关的基因的编码序列；(5)突变其组合，可避免损害或废除携带所述突变的纯合祖细胞的活力、性别决定、生育能力或其组合。参见示例10-13和16-18。
突变至少对一个或多个pgc发育基因的转录或转录后调控具有某种控制的非编码序列是指非编码区的任何类型的突变，其：(1)损害或消除参与pgc发育、维持和发育的pgc发育基因的母体效应功能，迁移或其组合；以及(2)不损害或废除携带所述突变的纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。突变一个或多个pgc发育基因的非编码序列的实例包括：(1)一个或多个pgc发育基因的一个或多个顺式作用的5'utr调控序列；(2)一个或多个pgc发育基因的一个或多个顺式作用的3'utr调控序列的突变；(4)一个或多个pgc发育基因的启动子；或(4)其组合。顺式作用的5’utr调控序列的实例是nanos3、dnd1和piwi样基因(例如ziwi)的5’utr调控序列。顺式作用的3’utr调控序列的实例为nanos3、dnd1和piwi样基因的3’utr调控序列。
突变参与一个或多个pgc发育基因转录后调控的另一个基因的编码序列是指除一个或多个pgc发育基因之外的任何类型的基因突变，其：(1)损害或消除参与pgc发育的pgc发育基因的母体效应功能，维持、迁移或其组合；以及(2)不损害或废除携带所述突变的纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。突变参与一个或多个pgc发育基因转录后调控的另一个基因的编码序列的示例是突变编码参与一个或多个pgc发育基因转录后调控的rna结合蛋白的基因和突变编码参与一个或多个pgc发育基因转录后调控的microrna的基因一个或多个pgc发育基因的转录后调控。参与一个或多个pgc发育基因的转录后调控的rna结合蛋白的实例为hnrnpab、elavl1、ptbp1a、igf2bp3、tia1、tiar、rbpm42、rbpm24、khsrp和dhx9。
突变另一个参与种质的运送、形成或组合的基因的编码序列，是指除一个或多个pgc发育基因外的任何类型的基因突变：(1)损害或消除参与pgc发育、维持的pgc发育基因的母体效应功能，迁移或其组合；以及(2)不损害或废除携带所述突变的纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。突变参与所述种质的运送、形成或组合，所述另一个基因的编码序列的实例是编码含有多都铎结构域的蛋白质、类驱动蛋白或衔接蛋白的一个或多个基因。含有多都铎结构域的蛋白质的实例为tdrd6。衔接蛋白的实例为hook2。
突变参与生殖细胞规格、维持、迁移或其组合的另一基因的编码序列是指除一个或多个pgc发育基因之外的任何类型的基因突变，其：(1)损害或消除参与pgc发育的pgc发育基因的母体效应功能，维持、迁移或其组合；以及(2)不损害或废除携带所述突变的纯合子祖细胞的生存能力、性别决定、生育能力或其组合。突变另一个基因的编码序列的一个例子是突变表达非编码rna的基因，该基因涉及生殖细胞的规格、维持、迁移或组合。非编码rna的实例为mir202-5p。
图1示出了根据本发明的一个示例，该示例说明了如何维持或使用亲鱼来生产不育鱼类、甲壳类动物或软体动物。在步骤1中，将破坏一个或多个pgc发育基因的母体功能的一个或多个基因突变引入鱼类、甲壳类动物或软体动物的野生型胚胎中，以创建图1中由“pgcdgsm1-n”表示的f0镶嵌首建者。本领域技术人员已知的直接操纵生物体中一个或多个基因的任何生物技术可用于产生f0镶嵌首建者。f0镶嵌首建者可能是可育的，因为制造pgc所需的生物材料是由一个母体提供的，其基因组并未携带一个或多个突变。
在步骤2中，雄性f0镶嵌首建者与野生型雌性杂交产生f1后代。考虑到一个或多个pgc发育基因是由野生型母体提供的，后代可能是可育的。由于雄性f0镶嵌首建者在不同的细胞中携带不同类型的突变等位基因，则对后代进行筛选以定位携带所需突变的后代，其在图1中用“m1”指定。本领域技术人员已知的识别生物体中一个或多个基因突变的任何生物技术可用于筛选子代，例如，基因型选择。f0雄性镶嵌首建者也可与携带任何母体效应基因或母体效应基因组合的不超过一个突变等位基因的雌性杂交。例如，这种杂交可以用来加速双淘汰系的产生。
在步骤3中，步骤2中的半合子突变雄性f1和半合子突变雌性f1被鉴定为携带相同的相关突变，并杂交产生f2子代。考虑到半合子突变的雌性f1携带一个突变基因的野生型拷贝，后代可能是可育的。识别出一只f2纯合子突变雌性，其可用作纯合子亲鱼，由图1中的网纹轮廓确定。
在步骤4中，将f2纯合子突变雌性亲鱼与野生型雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物杂交以产生不育的f3子代，其可被称为不育种子库。或者，将f2纯合子突变雌性亲鱼与半合子突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物或纯合子突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物野生型雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物杂交以产生f3不育子代。后代的不育性源于f2母体的纯合突变，f2母体没有携带突变基因的野生型拷贝。更可取地，将f2纯合突变雌性亲鱼与野生型雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物杂交以产生f3后代，其不育是因为将f2纯合突变雌性亲鱼与半合突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物或纯合突变雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物，或野生型雄性鱼类、甲壳类动物或软体动物杂交可能产生50％或100％的突变纯合子f3后代。如果突变基因的多效性功能超出了其在pgc发育中的作用，f3子代可能会因代谢和免疫等替代功能受损。
在步骤5中，识别图1中的实心轮廓指定f2纯合突变雄性，并与已识别的f2半合突变雌性杂交以产生f3子代。考虑到半合子突变雌性f2携带一个突变基因的野生型拷贝，该f3后代是可育的。在第步骤4中，可识别纯合子突变雌性并将其用作亲鱼。一个f3半合子雄性和一个f3半合子雌性可被确定为半合子亲鱼，其可按步骤3杂交。
图2a和b是说明本文所述的诱变策略的概述的流程图，所述诱变策略用于识别影响pgc发育和所选突变等位基因的进一步繁殖的母体效应突变体。图2a是图示本文中用于在所选基因的期望位置诱导得失位的基因编辑技术的流程图。处理后的胚胎来自一个表达绿色荧光蛋白：nos33’utr来自卵母细胞特异性启动子。“m”是指任何种系突变，数字表明镶嵌f0中可能存在不同的得失位。在荧光显微镜下对f0雌体与wt雄体杂交的后代和f0雄体与转基因gfp雌体杂交的后代进行4dpf和gfp-pgcs评分并记录。比较每个f0杂交至少12个后代的平均pgc计数。选择并繁殖导致f0雌性后代pgc计数减少和f0雄性后代pgc计数正常的突变。图2b是说明对体细胞和种系发育均有效的突变的传播的流程图。将携带同一基因突变等位基因的f1鱼进行杂交，产生f2鱼。四分之一的f2被认为成为基因突变等位基因的纯合子。突变不影响发育，性别决定和生育能力，并产生纯合突变可育雌体。如果该突变仅仅破坏了pgc形成的母体功能，那么这些f2纯合雌性与任何遗传背景的雄性杂交的后代均应显示pgc消融表型。
实施例
实施例1–利用基因编辑工具诱导罗非鱼f0代双等位基因敲除
我们独立地靶向两个与色素沉着有关的基因，即编码酪氨酸酶(tyr)[1]和线粒体内膜蛋白mpv17(mpv17)[2]。我们发现50％和46％的注射胚胎在tyr和mpv17基因座上分别显示出高度突变(图3)。细胞功能等位基因的丧失自主地导致胚胎体(图3b)和视网膜色素上皮(图3c)中的无色素细胞团，产生从黑色素完全丧失到部分丧失和虹膜色素沉着的胚胎表型，易于与野生型表型相鉴别(图3a)。胚胎显示完全缺乏色素沉着(10-30％的处理鱼)被提高到3个月龄，所有缺乏野生型tyr和mpv17序列。这些鱼显示透明和白化表型(图3d)，表明功能研究可以在f0罗非鱼中进行。
实施例2–罗非鱼的多基因靶向
我们测试了罗非鱼基因组中多个基因座是否可以同时靶向，以及在一个基因座上测定的诱变效率是否可以预测其他基因座的突变。为了验证我们的假设，我们将tyr和dead-end1(dnd1)作为共同靶点。dnd1是一种pgc特异性rna结合蛋白(rbp)，可维持生殖细胞的命运和迁移能力[3]。注射程序化核酸酶后，我们发现两个基因靶点tyr和dnd1的突变高度相关。大约95％的abino(tyr；参见图4a中的成体表型)突变体也在dnd1位点携带突变，证明了色素沉着缺陷作为选择标记的适用性(图4)。在进一步分析10条白化鱼的性腺后，6条为半透明的无生殖细胞精巢(图4b)。vasa是一种在野生型精巢中强烈表达的生殖细胞特异性标记，在dnd1突变型精巢中明显未检测到表达。这一结果表明合子dnd1的表达对生殖细胞的维持是必要的，母系贡献的dnd1mrnaa和/或蛋白不能挽救该基因的合子缺失。
实施例3–f0突变体的产生
从基因组数据库和软件基序发现算法搜索[4-7]中，已在硅片中鉴定出nos-3和dnd13'utr中所选基因和顺式作用元素的罗非鱼直系同源物。为了提高相关的基因产生空突变的频率，我们同时靶向2个独立的外显子。除了相关的基因外，我们还将一个色素沉着基因作为突变选择标记。所有突变体都是在含有zpc5:egfp:nos3’utr结构的罗非鱼品系中产生的(图5)，靶向nos33'utr的除外。根据我们之前的工作，我们预计注射200个胚胎将产生20-60个完全色素沉着缺陷的胚胎。其中5个胚胎通过pcr片段分析进行了基因组修饰的定量分析[8]。此外，我们只培育了若干批在一个或两个细胞阶段产生突变的胚胎，即通过片段分析检测每个靶基因座的2个或4个突变等位基因。
实施例4–实施例3中各组突变体的表型分析
对选择的f0突变体进行形态畸形、发育迟缓和性别分化的筛选。如果突变鱼发育正常，则在4个月龄和6个月龄时，通过与zpc5:egfp:tnos3’utr罗非鱼杂交，分别评估3条雄鱼和3条雌鱼的可育性。对每个杂交组合，30个f1后代进行基因分型，另外20个进行荧光显微镜分析。由于这些鱼系在pgs中选择性地表达gfp，当所有pgc都迁移到生殖嵴时，标记的pgc可以在4dpf计数。用非配对t检验对f1代的pgc总数进行统计比较。如果基因工程突变的功能符合假设，我们预计f0雌鱼的f1胚胎具有减少或缺失的gfp-pgc计数。同样，如果突变确实是母体效应特异性的，我们期望f0雄鱼产生具有正常pgc计数的f1后代(～35+/-5pgc/胚胎)(见图2a)。
实施例5–从实施例4中生成f1和f2系
为了选择f1半合子(与不同遗传背景的wt鱼异交)和f2纯合子系，我们对跨越靶区的扩增子使用qpcr熔融分析(ma)(图8)。由于每个杂合病变产生一个特征性的熔融曲线，所以有可能重组和繁殖带有相同插入缺失标记的f1后代。为了充分鉴定上述插入缺失标记，我们对f1个体的pcr产物进行了测序。通过减去wt序列，可以从杂合序列中提取突变体读取。
实施例6–从实施例5的分子、细胞和形态水平确认不育性
对于每个rbp和3'utr靶点，从f2纯合子突变雄鱼和雌鱼与野生型亲鱼(n＝30/组)杂交产生f3胚胎，并饲养至2-3个月龄。对10条幼鱼的性腺进行了解剖，并利用生殖细胞特异性基因vasa对rna/cdna进行了qpcr筛选[9]。每个样本的q-pcr进行三次，vasa表达水平标准化为一组寄主管家基因[57](β-actin和ef1α)。我们预期vasa在不育鱼中不表达。在5个月龄时，我们期望不育的雄性有半透明的精巢，而不育的雌性会产生一个类似弦的卵巢。另一部分被解剖的性腺被固定在布因溶液中(n＝10/组)，脱水并用石蜡浸润进行切片。由于完全没有生殖细胞，不育性显见。
实施例7–对不育群体的生产性状和生长速率进行量化
为了为这些试验产生3个半同胞组，将使用已建立的孵化程序分别培育3个wt雄性与3个f2纯合子突变雌性(不育组)和3个wt雌性(可育组)杂交的胚胎。在1个月龄时，罗非鱼子代(n＝100/组)将称重，贴上鱼坑标签，并在保持在27℃的循环培养系统中的3x300公升的缸中放在一起。所有鱼将使用购买的商用生长饲料每天喂养两次，直至饱足。每条鱼将在24周内每4周进行一次单独称重和测量。在实验结束时，将鱼杀死，进行性别鉴定，采用非配对t检验对平均总鱼长、体重、鱼产量和生长曲线进行统计比较。
实施例8–材料和方法
核酸酶的产生及其策略:为了在特定的基因组位点产生dna双链断裂(dsb)，我们使用了工程化核酸酶。在大多数应用中，单个dsb在缺乏修复模板的情况下产生，导致非同源末端连接(nhej)修复途径的激活。在一定比例的案例中，nhej可能是一种不完善的修复过程，在靶点部位产生插入或缺失。插入缺失标记的引入可在基因编码区内产生移码或其调控区的改变，分别破坏基因翻译或其时空调控。为了提高相关基因产生空突变的频率，我们同时靶向2个独立的外显子，靶向nos3'utr和mir202的除外。除了相关的基因外，我们还将一个色素沉着基因作为突变选择标记。
在一些实施例中，为了向dna序列引入定制核苷酸改变，使用两个靶位点来切出要修饰的区域。这一策略需要一个供体载体，其中包含所需突变的双链dna，其两侧有两个靶位点以外的dna同源臂靶向区。这种策略激活微同源定向修复(mhdr)。最终结果是供体载体中包含的dna序列被整合到原生基因座中(图6)。
利用dna净化浓缩器-5柱(zymo研究机构)对工程化核酸酶的模板dna进行线性化和纯化。一微克线性化模板用于使用mmessagemmachinet3试剂盒(英杰生命)合成封端rna，使用qiaquick柱(德国凯杰)纯化，并在-80°下储存在最终浓度为800ng/μl的核糖核酸酶游离水中。
胚胎注射:所有动物饲养程序均按照iacuc批准的cat动物法案cat-003执行。所有注射均在含有zpc5:egfp:tnos3’utr结构或野生型罗非鱼中进行。将约10nl总体积的含有程序化核酸酶的溶液共同注射到单细胞期胚胎的细胞质中。注射200个胚胎通常产生10-60个完全色素沉着缺陷(白化表型)的胚胎。在注射后的第10-12天，监测胚胎/幼鱼存活情况。
首建者的选择:选择的白化f0突变体进行形态畸形、发育迟缓和性别分化的筛选。如果突变鱼发育正常，则在4个月龄和6个月龄时，通过与zpc5:egfp:tnos3’utr罗非鱼杂交分别评估3条雄鱼和3条雌鱼的可育性。用荧光显微镜对每个杂交组合的20个f1后代进行了分析。由于这些株系在pgc中选择性地表达gfp，当所有pgc都完成迁移到生殖嵴时，标记的pgc在4dpf计数(参见实施例9)。然后用非配对t检验对f1代的平均pgc总数进行统计比较。如果基因工程突变的功能符合假设，我们预计从f0雌鱼产生的f1胚胎具有减少或缺失的gfp-pgc计数。同样，如果突变确实是母体效应特异性的，我们期望f0雄鱼产生具有正常pgc计数的f1后代(～35+/-5pgc/胚胎)。
对于具有母体效应特异性pgc减少的突变系，通过荧光pcr片段分析对3-5条f0雄鱼进行基因组修饰的定量分析(基因特异性基因分型引物见表1和表2)。我们选择在一个或两个细胞阶段产生突变的雄鱼(通过片段分析检测每个靶基因座的2或4个突变等位基因)(图7)。
表1:引物
表2:引物
实施例9-早期胚胎pgc数量的测定
在转基因株系中，tg(zpc5:egfp:tnos3’utr)罗非鱼zpc5启动子是卵母细胞特异性启动子，在第一次减数分裂前的卵子发生过程中活跃。因此，来自杂合子或纯合子转基因雌性的所有胚胎都继承了egfp:tnos3’utrmrna，通过其3’utr(罗非鱼nos33’utr)中顺式作用rna元素的作用，定位并在pgc中专一表达。胚胎(受精后4天)经过量的甲基磺酸三钙(ms-222，200-300mg/l)安乐死，延长浸泡至少10分钟。备料用4g/l碳酸氢钠缓冲至ph7(碳酸氢钠与ms-222的比例为2:1)。将胚胎移到pbs玻璃表面，去除卵黄。在显微镜玻片和盖玻片之间挤压去卵黄的胚胎，并在配备成像照相机的荧光显微镜下进行分析。
f1基因分型:选定的雄性首建者与携带zpc5:egfp:tnos3’utr结构的雌性罗非鱼杂交。将其f1后代饲养到2月龄，浸泡在200mg/lms-222(三卡因)中麻醉，并用塑料勺转移到干净的表面。它们的鳍用剃须刀片夹好，放在孔中(带盖的96孔板上)。夹住鳍的鱼然后放置在单独的罐中，同时用荧光pcr法对鱼鳍dna进行分析。简言之，向每个孔中添加60μl含有9.4％chelex和0.625mg/ml蛋白酶k的溶液，用于在55℃培养箱中过夜组织消化和gdna提取。然后对板进行涡流和离心。然后用超净水将gdna提取液稀释10倍，以去除混合物中的pcr抑制剂。通常，我们分析了80条幼鱼/首建者，以选择并培养了若干批每批大约20条携带相同大小突变的幼鱼。
荧光pcr(见图7):pcr反应使用3.8μl水、0.2μl鳍dna和5μlpcr主混合物(德国凯杰multiplexpcr)以及1μl由以下三种引物组成的引物混合物：带有荧光标记的标记尾部引物(6-fam，ned)，带前尾的扩增子特异性正向引物(5′-tgtaaaacgacggccagt-3′和5′-taggagtgcagcaagcat-3′)，扩增子特异性反向引物(基因特异性引物列于表1和表2)。pcr条件如下：在95℃下变性15分钟，然后进行30个扩增周期(94℃30秒，57℃45秒，72℃45秒)，然后进行8个扩增周期(94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒)，最后在72℃下延长10分钟，并在4℃下无限期保持。
一至二微升1:10稀释的扩增子通过毛细管电泳(ce)进行分离，并添加liz标记的大小标准，以确定精确到碱基对分辨率的扩增子大小(retrogen公司，圣地亚哥)。原始跟踪文件在峰值扫描软件(thermofisher)上进行分析。相对于野生型峰对照的峰大小决定突变的性质(插入或缺失)和长度。峰的数目表示镶嵌程度。我们选择了携带最少突变等位基因(2-4峰最佳)的f0镶嵌首建者。
等位基因大小用于计算观察到的插入缺失突变。除了靶向基因的非编码序列中的突变外，通过测序选择不是3bp倍数的突变并因此预测为移码突变的突变进行进一步确认。优先选择大小大于8bp但小于30bp的突变，以便于通过qpcr熔融分析对后代进行基因分型。为了序列确认，将所选插入缺失标记的pcr产物进一步提交测序。pcr的测序层析显示两次同时读取表明存在插入缺失。缺失或插入的开始通常在读取的序列发散时开始。然后仔细分析双序列以检测独特的核苷酸读取。然后对照一系列通过逐步将野生型序列转移到自身而产生的人工单一读取模式对独特的核苷酸读取模式进行分析。
实施例10-突变鱼类胚胎存活率、发育畸形和成年雌雄同体的分析
对单基因杂合子突变体鱼两两交配产生的胚胎进行了体视显微镜(明亮光线和荧光灯)下的肉眼可见畸形分析。成批后代成长为成鱼(3-6月龄)。用chelex树脂对来自成年鱼的鳍夹进行处理以提取dna，并通过熔融分析进行基因分型：实施例10-f2和通过熔融分析的下一代基因分型(见下文)
实时qpcr得以实施，使用rotor-generg-3000实时pcr系统(corbett研究机构)。使用1μl基因组dna(gdna)模板(稀释至5-20ng/μl)，总体积为10μl，含有0.15μm浓度的正向和反向引物以及5μlqpcr2x主混合物(apex生物研究公司产品)。表1和表2中列出了所使用的qpcr引物(表2中的基因分型rt-pcr引物)。采用40个周期(95℃下15秒，60℃下60秒)进行qpcr，然后进行熔融曲线分析，以确认分析的特异性(67℃至97℃)。在这种方法中，包括相关区域的短pcr扩增子(约120–200bp)是从gdna样品产生的，经过温度依赖性分离(熔化曲线)。当诱导的插入缺失存在于半合子gdna中时，会形成异源双链以及不同的纯双链分子。通过熔体剖面图可以检测到多种形式的双相分子的存在，显示双相熔融是作为单个物种还是作为多个物种。通常，熔融曲线和熔融温度的对称性取决于dsdna序列及其长度的均一性。因此，纯合子和野生型(wt)表现出对称的熔融曲线，可通过不同的熔融温度来区分。熔融分析是通过与参照dna样品(来自对照组野生型dna)进行比较，并用相同的主混合反应平行扩增。简言之，熔体轮廓的变化区分了纯合、半合和wt-gdna产生的扩增子(见图8)。
基因分型数据用于分析存活的纯合子敲除鱼与纯合子wt和杂合子鱼的孟德尔比率。在无生活力选择的无效假设下，后代基因型应符合预期的孟德尔比1:2:1。使用拟合优度卡方统计分析检验纯合基因敲除的预期数量(25％)的偏差。
性别比测定:后代(n＝40/组)在3-4月龄时进行性别鉴定。雄性和雌性是根据其性别特异性的泌尿生殖突起进行视觉识别的。
性腺的形态和细胞分析:通过比较性腺的整体形态来评价不育性。将纯合子母子代(n＝20/杂交)的性腺结构与年龄匹配(3月龄)的父子代(可育对照)进行比较。为了分析性腺的细胞结构，我们将性腺固定在布因溶液中48小时。在乙醇脱水和甲苯清除后，用石蜡浸润、包埋和切片。每一切片都由两位评论员盲读。由于小管腔完全没有精子，雄性不育显见。雌性的不育表现为性腺退化为弦状结构，组织切片显示没有卵母细胞。
分子水平上的不育性确认:从解剖的性腺(来自每个父系和母系)中提取总rna，并筛选相应的cdna以定量表达生殖细胞特异性基因(罗非鱼vasa加入号ab03246766)和性腺特异性支持体细胞(罗非鱼sox9a和罗非鱼cyp19a1a，分别用于雄性和雌性性腺)。将q-pcrs分三次进行，并根据寄主管家基因(罗非鱼b-actin)对表达水平进行标准化。相对拷贝估计数是使用既定的程序生成的。我们预期在不育鱼中没有vasa的表达，但是相对于野生型精巢，sox9a的表达正常。
实施例11–与所选基因和调控序列突变相关的f0表型
为了测试所选基因的编码序列或调控序列是否对pgc的发育至关重要，我们利用有或没有供体dna的可编程核酸酶产生了罗非鱼突变体。为了提高nanos3(nos3)、deadend-1(dnd1)、tiar、tia1、khsrp、dhx9、elavl1、elavl2、igf2bp3、rbm42、rbms(hermes)、rbm24、hnrnph1、hnrmpab、tdrd6、hook2、ptbp1a、kif5b、cxcr4a基因产生空突变的频率，我们同时靶向每个基因的两个独立外显子。为了最大限度地减少功能缺失突变的发生，我们优先选择编码区前半部分的靶点。除了相关的基因外，我们还将一个色素沉着基因作为突变选择标记(图3)。此外，为了测试dnd1的3'utr是否为其合子功能所必需的，我们对dnd1编码序列下游的β-珠蛋白3'utr进行了靶向整合。进一步地，我们靶向nos33'utr和dnd13'utr中的进化保守基序，我们假设这些基序参与了卵母细胞和早期胚胎中相应mrna的时空调控(图9)。这些基序是基于i)它们在同源mrnas的3′utr上的联合存在ii)它们与假定的mirna结合序列的并置以及iii)二级结构分析(参见实例17中的细节)来确定和优先选择的。我们还靶向了一种定位于发育中胚胎pgc的mirna(mirna202-5p)(张，刘等人著，2017年)。
对f0处理的胚胎的存活率和畸形率进行了分析，并与未注射的对照组进行了比较。我们发现rbms和hnrnph1f0处理的胚胎存活率低，没有白化鱼恢复，这表明这些基因在胚胎形态发生中起着重要作用。同样，经kif5b处理的胚胎存活率也很低。然而，我们成功地恢复并繁殖了一个表现出严重形态畸形的f0kif5b突变株。
在其余17个靶基因的任何其他基因突变鱼中，我们没有观察到实验组和对照组在生存能力或明显的发育异常方面的显著差异。对于每个实验组，至少选择20条白化鱼进行繁殖。除nos3(88％雄性，n＝42)、dnd1(83％雄性，n＝41)、tia1(80％雄性，n＝20)和elavl1(90％雄性，n＝20)外，所有f0突变实验组在5个月龄时的性别比均正常(见表3)。此外，我们还发现nos3和dnd1的编码序列被破坏，导致30％(n＝3/10)的nos3f0雌性和60％(n＝4/10)的dnd1f0雄性发育成无性生殖体的成鱼。在这些鱼中，成熟期的剥离程序没有产生配子。在进一步分析它们的性腺后，我们在f0nos3突变的雌性中发现了线状卵母细胞游离卵巢，在f0dnd突变的雄性中发现了半透明的无精子精巢(图4)。vasa是一种在野生型精巢和卵巢中强烈表达的生殖细胞特异性标记物，在这些鱼类的性腺(nos3和dnd1f0性腺)中明显未检测到表达。有趣的是，dnd1编码序列下游β-珠蛋白3'utr的成功双等位基因整合导致雄性不育。
表3:靶基因和相关表型。呈现每个基因选择的突变等位基因。nd：未检测到，na：不适用，n：正常，*测量的pgc消融最低水平
接下来，我们研究了突变的母体效应，以确定其是否改变了pgc的发育途径。为此，将各实验组2～4只同胞f0雌性罗非鱼与野生型雄性罗非鱼交配，并对其胚胎后代进行荧光显微镜下的pgc计数分析。根据靶向基因的不同，pgc消融的平均水平在20％到85％之间(图11和表3)。每个实验组中不同的f0雌鱼产生的胚胎具有不同的pgc消融水平，这可能是由于靶位点序列结果的嵌合体。相反，所有f0突变雄性与雌性tg(zpc5:egfp:nanos3’utr)杂交产生的胚胎pgc计数正常(平均35-42pgc/胚胎)。
为了确定携带nos33'utr突变的f0雌性是否产生pgc计数减少的胚胎，我们分析了这些子代在4月龄和6月龄时的性腺(由于该实验组的f0雌性不携带gfp转基因，pgc计数是不可能的)。令人惊讶的是，我们观察到一种强烈的母性不孕效应，其特征是性腺体指数降低，精巢半透明，卵巢呈弦状(图12a至d)。因此，虽然nos3编码序列的突变导致雌性不育，但nos33'utr保守基序1中的离散突变并不损害卵母细胞发育。相反，这种突变似乎只破坏了突变雌性胚胎后代中nos3mrna的翻译后调节。突变对pgc发育的母体效应在下一代中得到证实，并在下面的实施例16中进一步讨论。
我们进一步分析了携带tia1、rbms42和ptbp1a突变的f0雌性后代中pgc缺失性腺的发育情况。我们比较了pgc计数低和pgc计数高的个体，发现pgc减少水平和性腺大小减少之间存在正相关(图12的e至f)。我们观察了母源性不孕表型，包括透明的精巢和萎缩的线状卵巢(图12-e-h)。
总之，我们的结果确定了几个基因的功能丧失或错误表达导致母体效应pgc缺失和相关的不育表型。
实施例12–f1代和f2代表型的验证
由于f0突变体罗非鱼在靶向dna双链断裂位点具有不可预测的多个序列结果，并且剩余的野生型或框内插入缺失标记序列能够掩盖表型的程度未知，因此我们进行了额外的表型表征。此外，非靶向核酸酶活性可能与表型有关。因此，我们有选择地繁殖预期的突变，以确保假定的脱靶突变从后代中分离和消除。最终，当在f2纯合子世代动物的每个细胞中发现相同的突变时，可以测量完整的表型。相应地，对于每个实验组，我们将选择的具有种系传递突变的首建者雄性与雌性tg(zpc5:egfp:nanos3’utr)进行远系繁殖产生f1鱼类杂合子，用于移码突变、插入或精确编辑靶基因。
表3和图13-31、33和35总结了所选突变等位基因的详细信息，包括插入缺失标记的大小和预测的cdna和蛋白质变化。nos3(图33)和dnd1(图35)的3'utr区域突变选择性地去除了(缺失)或替换了(等位基因替换)假定的调控基序。最后，选择mirna-202突变以完全或部分去除mir-202-5p种子序列(图31)。
携带这些突变的杂合子罗非鱼看起来很健康，并分化成两性均可生育的成年鱼。在这些性成熟的f1代中缺乏生殖表型并不意外，因为在所选突变体的所有细胞中存在每个靶基因的野生型等位基因。
鉴于靶向基因在pgc发育中的明显关键作用，我们进一步测试了其是否代表剂量依赖性机制。为此，我们研究了降低母体功能性mrna/蛋白的剂量是否会减少pgcs的数量。确实，在半合子突变雌性的卵母细胞中，两个等位基因都有表达，但功能蛋白只有一个编码。因此，如果靶基因以剂量依赖性的方式工作，我们应该期望从半合子雌性与野生型雄性杂交的后代显示pgc数量的减少。我们发现khsrp(kshrpδ17/+)和elavl1(elavl1δ3k/+)的半合子突变体产生了pgc计数正常的胚胎后代(图36)。相反，我们在tiari11/+,tia1δ10/+,dhx9δ7/+,igf2pb3δ2/+,elavl2δ8/+,ptpb1aδ1.5k/+,hnrnpabδ8/+,rbm24δ7/+,tdrd6δ10/+和mir202-5pδ7/+mir202-5pδ8/+以及nos33’utr基序1δ32/+和nos33’utr基序1δ8/+(a减少40-50％)的后代中测量出了显著的pgc减少，揭示强烈的基因剂量敏感性(图37)。
为了进一步研究突变在早期发育过程中合子效应的可能性，我们对半合子突变雌性与半合子突变雄性杂交的胚胎后代的生存能力进行了评分。我们预计大约25％的胚胎后代是突变等位基因的纯合。
在白光立体显微镜下，我们测量到来自kif5b家族的约25％的幼鱼出现了严重的颅面畸形，身体弯曲，尾巴弯曲(图10)。对这些畸形幼鱼进行基因分型，发现其携带kif5bδ1/δ1等位基因。f2纯合子kif5bδ1/δ1突变体的死亡率在受精后7天达到95％，所有纯合子突变体kif5b在30天龄时死亡。我们没有观察到所有其他靶向基因存在明显的形态学体细胞缺陷，在存活的和解剖上无法区分的同胞后代中，约25％的纯合子突变被鉴定出来。
为了进一步了解这些基因在发育后期可能的功能，我们将每一组胚胎培养至成年，并分析了纯合子、半合子和野生型同胞后代的性别比、生育能力和性腺形态。
与f0代观察到的表型一致，合子nos3和dnd1mrna的缺失导致不育表型。我们发现nos3基因敲除(nos3δ5/δ5)发育为两性鱼类。我们发现nos3δ5/δ5雌性具有类似于弦的卵巢(图39)。此外，nos3缺陷雄性的精巢部分透明，而在野生型和半合子突变型中为粉红色不透明。在6月龄时，来自nos3δ5/δ5雄性的精子浓度显著降低；然而，我们发现精子形态、运动能力或功能没有缺陷。因此，nos3δ5/δ5雄性表现出延迟成熟，但仍可育。
我们只饲养了dnd1ko罗非鱼(dnd1)，并全部发育成雄性(n＝17)。这些雄鱼显示出半透明的精巢，并且为无性生殖体，通过对其精巢的细胞和分子分析证实了这一点(图38)。
我们进一步表明，rna结合蛋白elavl2是雄性和雌性配子发生的基础，因为功能缺失突变导致两性配子完全消失，这是通过对其性腺的形态学和分子分析得出的证据(图40)。
实施例13-具有母性不育表型的单纯合ko基因
对于所有其他靶向基因，我们在预期孟德尔频率下恢复了所有预期基因型，成年后没有明显的表型。为了测量母性效应不育表型的全部强度，我们将纯合子突变雌性与野生型雄性杂交，并分析胚胎后代。我们观察到以下等位基因tiar、khsrp、tia1、dhx9、elavl1、cxcr4的纯合雌性后代的pgc显著减少(图45)。将突变雌性的pgc缺失后代培养至成年，分析其性腺的大小和变化。我们发现萎缩的卵巢具有弦状结构，以及透明的生殖细胞缺失的精巢与胚胎中严重的pgc缺失相一致。相反，f2突变雄性的后代发育出正常大小的性腺。例如，我们测量出了tiar1纯合子突变雌性产生的后代的平均性腺体指数比对照组(纯合子突变雄性的后代)低10-20倍(图43)。与nos3编码序列的空突变相比，位于nos33'utr的基序1序列的缺失并没有导致雌性不育，这表明该基序不是维持卵原干细胞所必需的。然而，重要的是，这些雌性产生的胚胎有严重的pgc消融(图41和44)。其余基因的母体效应表型仍在研究中。单基因失活导致的不完全pgc消融表型提示这些基因参与了具有显著遗传冗余的复杂通路。
实施例14-剖析pgc形成的遗传结构
为了更好地理解pgc发育的遗传结构和确定参与这些过程的基因的功能顺序，我们建立了双突变系，并比较了单基因或双基因功能缺失表型后代中pgc的数量。进一步地，为了确定现有的突变是否控制nos3的转录后调控，我们研究了在卵母细胞特异性启动子(msc转基因系)的控制下，表达促凋亡基因bax融合到nos33’utr的转基因罗非鱼系中的单个突变的影响。我们之前已经证实，msc雌性细胞通过这些细胞中bax的异位母体表达产生缺乏pgc的胚胎(lauth和buchanan，2016年)。
我们在携带msc-khrspδ16/δ16,msc-dhx9δ7/δ7,msc-tiarι11/ι11的罗非鱼品系中仅发现了加性pgc效应(无上位性)，表明这些基因不与nos3'utr相互作用(图44)。事实上，msc的设计是为了利用卵母细胞自身的细胞机制来驱动胚胎子代的pgc的bax:nos33’utr表达。如果靶基因参与nos33'utr的转录后调控，促凋亡蛋白bax的表达将不局限于pgc，从而限制msc-pgcs的消融能力。我们认为dhx9、tial和khsrp既不直接也不间接参与nos3的定位。
实施例15–罗非鱼种质中不限制pgc发育的多效性表型基因
我们的诱变筛选发现了新的种质基因，这些基因在罗非鱼中的失活阻止了可育雌性的发育。我们发现hnrnph1和rbms的失活导致胚胎致死。我们的结果进一步与早期发现一致，即缺乏kif5ba的胚胎表现出中等到严重的腹侧化表型(campbell，heim等人著，2015年)。
我们的研究结果表明，nos3在罗非鱼中的合子功能是维持卵原干细胞所必需的，nos3δ5/δ5突变雌性在成熟时发育出类似于弦的无性生殖体卵巢，而突变雄性则保持可育性(图39)。值得注意的是，我们的nos3突变罗非鱼雌性没有性别回复到雄性表型。在这方面，我们的结果与李等人(李，杨等人著，2014年)的结果不一致，表明罗非鱼中存在生殖细胞独立的性别决定机制。
我们的结果证实了先前在大西洋鲑鱼中的研究结果，该研究表明合子dnd1表达是生殖细胞持续维持所必需的，母系贡献的dnd1mrna和/或蛋白质不能拯救该基因的合子功能(wargelius，leininger等人著，2016年)。
我们在elavl2中产生了功能缺失突变，该突变编码一种蛋白质，与果蝇elav基因(胚胎致死、异常视觉系统)的产物有显著的相似性，缺失该基因会导致多种结构缺陷和胚胎致死。在早期胚胎发育过程中，发现elavl2在斑马鱼大脑以及pgc中大量表达(thisse和thisse2004年著，mickoleit，banisch等人2011年著)。因此，我们惊讶地看到，罗非鱼elavl2δ8/δ8纯合子突变体是完全可行的，发育成不育的雄性和雌性(图40)。因此，与nos3、dnd1、vasa和piwi样基因一样，elavl2也显示出必要的合子功能，以确保成年生殖细胞的维持。
实施例16–参与pgc形成的新型rna结合蛋白
有点令人惊讶的是，我们成功地鉴定出了功能缺失突变导致pgc发育严重缺陷的基因，这些基因在成年后没有其他明显的表型，这表明它们不是生存能力或生育能力所必需的。在这里，我们首次描述了由tia1、tiar、khsrp、rbm24、rbm42、dhx9、igf2pb3、hnrnph1和elavl1功能缺失突变引起生殖细胞是由母体遗传指定的任何动物物种的缺陷(例如所有鱼类、许多昆虫和青蛙物种)。这些基因突变母体的胚胎平均减少了60％到88％的pgc数量。在某些(但并非所有)母体突变基因型中，这种减少与这种数量性状的方差增加相关。方差的增加可能表明缓冲剂在稳定控制生殖细胞数量的基因调控网络中的作用。缺乏tial1的小鼠表现出部分胚胎致死性和生殖细胞成熟缺陷(beck等人，1998年)，这意味着tia1蛋白在脊椎动物发育的重要方面起调节作用。我们还描述了罗非鱼中由hook2、tdrd6、dnd1和kif5b失活引起的第一个缺陷。
实施例17–3'utr调控基序的鉴定与功能分析
为了解决与生殖细胞维持所需的必需蛋白质的多效性功能相关的问题，我们研究了在不影响合子活性的情况下选择性地去激活母体基因功能的可能性。我们专门研究了罗非鱼nos3和dnd1的3'utr功能，它们分别是胚胎和成鱼形成和维持生殖系所必需的。鉴于elavl2可能参与pgc的形成(mickoleit，banisch等人著，2011年)，以及其对成年生殖系维持的要求(我们的研究)，我们进一步将elavl23'utr纳入我们的分析。
为了探讨罗非鱼dnd13'utr在维持成体生殖细胞中的作用，我们用罗非鱼β-珠蛋白基因的3'utr进行了3'utr交换实验。细胞质β-珠蛋白基因的表达通常被认为是组成性的，并且在所有细胞类型中普遍存在，并且预计缺乏pgc表达所必需的顺式作用基序(herpin，nakamura等人著，2009年)。我们发现β-珠蛋白3'utr不能作为维持dnd1合子功能的替代3'utr，提示合子中dnd1的活性需要特定的转录后调控。
rna在种质中的定位是由3'utr特异性的顺式调控元件介导的，这些元件对合子功能的要求尚未测试。为了首先定位候选调控元件，我们将不同物种的nos3、dnd1和elavl2转录本的3'utr序列输入到基于web的软件基序发现算法中。尽管在多重序列比对中序列相似性很低，并且长度有3-9倍的变化，但我们成功地在这些同源基因的3'utr中鉴定了不同的保守基序。nos33'utr序列分析的结果揭示了两个保守的基序，其中一个存在于所有分析的nos33'utr序列中(图32)。dnd13'utr分析的结果是一组两个预测的结合基序，发现在所有硬骨鱼类以及爪蟾的不同位置(图34)。最后，对elavl23'utr的分析确定了2个基序，其中一个基序出现在所有受检物种的3'utr的相同位置(图35a和b)。第二个elavl2基序(elavl2基序2)在大西洋鲑鱼、青鳉和尼罗罗非鱼中保存完好(图36c)。由于rna调控元件通常包含二级结构背景下松散定义的一级序列的组合(keene和tenenbaum2002年著)，我们使用rna折叠算法对这些区域进行了计算研究(kerpedjiev，hammer等人著，2015年)。在不同的基序中，nos3基序1和dnd1基序1是由几个分析rna序列和折叠预测相似性的程序共同识别的。这些基序的序列比对、基序标识(每个位置核苷酸相对频率的图形表示)和预测的二级结构如图32和33所示。
为了进一步评估这些区域的合理性，我们对mir-430、mir-23和mir-101的种子靶点进行了相应配对扫描。mir430是早期斑马鱼胚胎中含量最丰富的mir，已知可抑制体细胞中的nos3和tdrd7mrnas(mishima，giraldez等人著，2006年)。在许多硬骨鱼类的未受精卵和早期胚胎中检测到这些保守的mirna家族(ramachandra，salem等人著，2008年)，这表明了一个重要的保守作用，可能调控着种质rna。我们在罗非鱼dnd13'utr中发现了两个假定的oni-mir-23位点，在罗非鱼nos33'utr中发现了一个mir-430和一个mir-101位点，位于罗非鱼nos3和dnd13'utr保守的预测结合基序1和2附近。我们的分析并不希望受到理论的束缚，而是提出了一种机制，即保守的顺式作用基序和反式作用rna结合因子形成mrna-蛋白质复合物(mrnp)。这些相互作用可能以种质特异的方式防止mirna降解。综上所述，在6个结合基序中，dnd1-1和nos3-1被优先用于本研究的进一步研究。
正如之前的假设并与nos3功能缺失突变相反，我们发现nos3-3'utr基序-1的破坏并不损害基因的合子功能。我们观察到基序1缺陷的雌性发育出功能性卵巢。重要的是，我们证实了该基序是该基因母体功能所必需的。我们观察到基序1缺陷的雌性产生pgc缺失的胚胎，这些胚胎发育成性发育迟缓和/或无性生殖的成体(图41b和a)。在广泛的生物体内，这种18-mer和其他基序在直系同源基因的3'-utr中的出现可以解释3'utr在从鱼类到青蛙的低等脊椎动物中的功能互换性。
我们提出类似的方法可用于预测rna结合蛋白的结合基序靶点，并预期这种系统性鉴定将确定有价值的修饰靶点，以实现调控pgc形成的额外母体基因的解除调控。
我们推测其他保守的3'utr调控序列的失活不会导致多效性表型损害纯合子突变雌性的存活、性别决定或生育能力。顺式作用元件的保守性使得这些序列特别具有吸引力，可作为在不同水产养殖鱼类中获得相同母体效应表型的靶点。
实施例18–mir-202-5p靶向修饰分析
我们首次进一步描述了mir-202-5p失活对pgc发育的影响。这个mir202在进化上是保守的，有两个成熟的转录本，mir-202-5p和mir-202-3p，其中mir-202-5p代表斑马鱼(vaz，wee等人2015年著)、海青鳉(presslauer，bizuayehu等人2017年著)、虹鳟(juanchich，lecam等人2013年著)、罗非鱼(肖，钟等人2014年著)，大西洋大比目鱼(bizuayehu，babiak等人2012年著)和热带爪蟾(armisen，gilchrist等人2009年著)卵黄发生后期卵巢中的优势臂。最近有报道称，青鳉的mir-202失活(mir-202-3p和mir-202-5p的联合缺失)导致不育雌性缺卵或亚可育雌性产出异常和不能存活的卵量减少。生殖表型反映卵泡发育受损(gay，bugeon等人著，2018年)。值得注意的是，我们的f0和f1mir-202突变雌性产生了可存活的pgc缺失后代。
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序列号88和90(野生型kif5b)
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生物体:尼罗罗非鱼
序列号89和91(kif5b突变等位基因-1nt缺失)
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序列号92和94(野生型tiar)
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序列号93和95(tiar突变等位基因-11nt插入)
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序列号96和98(野生型khsrp)
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生物体:尼罗罗非鱼
序列号97和99(khsrp突变等位基因-17nt缺失)
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生物体:尼罗罗非鱼
序列号100和102(野生型dhx9)
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序列号101和103(dhx9突变等位基因-7nt缺失)
长度:4280bp(-7bp)和82aa
类型:cdna(序列号:101)和蛋白(序列号:103)
生物体:尼罗罗非鱼
序列号104和106(野生型tia1)
长度:3664bp和387aa
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生物体:尼罗罗非鱼
序列号105和107(tia1突变等位基因-10nt缺失)
长度:3664bp(-10bp)和27aa
类型:cdna(序列号:105)和蛋白(序列号:107)
生物体:尼罗罗非鱼
序列号108和110(野生型igf2bp3)
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生物体:尼罗罗非鱼
序列号109和111(igf2bp3突变等位基因-2nt插入)
长度:2288bp(-2bp)和206aa
类型:cdna(序列号:109)和蛋白(序列号:111)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号112和114(野生型elavl1)
长度:1894bp和359aa
类型:cdna(序列号:112)和蛋白(序列号:114)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号113和115(elavl1突变等位基因-3knt缺失)
长度:1894bp(-3kb)和105aa
类型:cdna(序列号:113)和蛋白(序列号:115)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号116和118(野生型elavl2)
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类型:cdna(序列号:116)和蛋白(序列号:118)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号117和119(elavl2突变等位基因-8nt缺失)
长度:1119bp(-8bp)和40aa
类型:cdna(序列号:117)和蛋白(序列号:119)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号120和122(野生型cxcr4a)
长度:1996bp和382aa
类型:cdna(序列号:120)和蛋白(序列号:122)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号121和123(cxcr4a突变等位基因-8nt缺失)
长度:1996bp(-8bp)和177aa
类型:cdna(序列号:121)和蛋白(序列号:123)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号124和127(野生型ptbp1a)
长度:6015bp和538aa
类型:cdna(序列号:124)和蛋白(序列号:127)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号125和128(ptbp1a突变等位基因-13nt缺失)
长度:6015bp(-13bp)和80aa
类型:cdna(序列号:125)和蛋白(序列号:128)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号126和129(ptbp1a突变等位基因-1.5knt缺失)
长度:6015bp(-1.5kb)和346aa
类型:cdna(序列号:126)和蛋白(序列号:129)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号130和132(野生型nos3)
长度:660bp和219aa
类型:cdna(序列号:130)和蛋白(序列号:132)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号131和133(nos3突变等位基因-5nt缺失)
长度:660bp(-5pb)和145aa
类型:cdna(序列号:131)和蛋白(序列号:133)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号134和136(野生型dnd1)
长度:1653bp和320aa
类型:cdna(序列号:134)和蛋白(序列号:136)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号135和137(dnd突变等位基因-5nt缺失)
长度:1653bp(-5pb)和324aa
类型:cdna(序列号:135)和蛋白(序列号:137)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号138和140(野生型hnrnpab)
长度:999bp和332aa
类型:cdna(序列号:138)和蛋白(序列号:140)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号139和141(hnrnpab突变等位基因-8nt缺失)
长度:999bp(-8bp)和29aa
类型:cdna(序列号:139)和蛋白(序列号:141)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号142和144(野生型hermes)
长度:525bp和174aa
类型:cdna(序列号:142)和蛋白(序列号:144)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号143和145(hermes突变等位基因-16nt插入)
长度:525bp(+16bp)和61aa
类型:cdna(序列号:143)和蛋白(序列号:145)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号146和148(野生型rbm24)
长度:708bp和235aa
类型:cdna(序列号:146)和蛋白(序列号:148)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号147和149(rbm24突变等位基因-7nt缺失)
长度:708bp(-7bp)和54aa
类型:cdna(序列号:147)和蛋白(序列号:149)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号150和152(野生型rbm42)
长度:1227bp和408aa
类型:cdna(序列号:150)和蛋白(序列号:152)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号151和153(rbm42突变等位基因-7nt缺失)
长度:1227bp(-7pb)和178aa
类型:cdna(序列号:151)和蛋白(序列号:153)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号154和156(野生型tdrd6)
长度:4890bp和1630aa
类型:cdna(序列号:154)和蛋白(序列号:156)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号155和157(tdrd6突变等位基因-10nt缺失)
长度:4890bp(-10bp)和43aa
类型:cdna(序列号:154)和蛋白(序列号:156)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号158和160(野生型hook2)
长度:4002bp和708aa
类型:cdna(序列号:158)和蛋白(序列号:160)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号159和161(hook2突变等位基因-2nt缺失)
长度:4002bp(-2pb)和158aa
类型:cdna(序列号:159)和蛋白(序列号:161)
生物体：尼罗罗非鱼
序列号166(nanos33’utr)
长度:703bp
类型:cdna非编码
生物体:牙鲆(paralichthysolivaceus)
序列号167(nanos33’utr)
长度:567bp
类型:cdna非编码
生物体:鲤鱼(cyprinuscarpio)
序列号168(nanos33’utr)
长度:618bp
类型:cdna非编码
生物体:斑马鱼(daniorerio)
序列号169(nanos33’utr)
长度:801bp
类型:cdna非编码
生物体：尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)
序列号170(nanos33’utr)
长度:903bp
类型:cdna非编码
生物体:斑点叉尾鮰(ictaluruspunctatus)
序列号171(nanos33’utr)
长度:1000bp
类型:cdna非编码
生物体:虹鳟(oncorhynchusmykiss)
序列号172(nanos33’utr)
长度:124bp
类型:cdna非编码
生物体:日本青鳉(oryziaslatipes)
序列号173(nanos33’utr)
长度:400bp
类型:cdna非编码
生物体:黑青斑河鲀
序列号174(dnd13’utr)
长度:173bp
类型:cdna非编码
生物体:大西洋鲑鱼(salmosalar)
序列号175(dnd13’utr)
长度:500bp
类型:cdna非编码
生物体:大西洋鳕鱼(gadusmorhua)
序列号176(dnd13’utr)
长度:190bp
类型:cdna非编码
生物体:虹鳟(onchrorincusmyskiss)
序列号177(dnd13’utr)
长度:465bp
类型:cdna非编码
生物体：尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)
序列号178(dnd13’utr)
长度:273bp
类型:cdna非编码
生物体:河豚(takifugurubripes)
序列号179(dnd13’utr)
长度:527bp
类型:cdna非编码
生物体:斑马鱼(daniorerio)
序列号180(dnd13’utr)
长度:552bp
类型:cdna非编码
生物体:沟鲶(ictaluruspunctatus)
序列号181(dnd13’utr)
长度:585bp
类型:cdna非编码
生物体:爪蟾(xenopustropicalis)
序列号182(elavl23’utr)
长度:2235bp
类型:cdna非编码
生物体:大西洋鳟鱼(salmosalar)
tctcatctcggattgtttatagaaaactctacagaaaatggaaaaacctaaaatggaaacctaccgaccgtaaactttctacattagcaaaaacatctttgtaaatcagtgttacgaagggaaactatacttagcgtccaacagtgttttcctttccttcattgctaggctttgaaacttcttaaaatactttgcgttaaaccagaaaaaatactgcaggttttcacgcctgtctttaaagctggaccttttaaaatgttactaaaggtttttttttgttttgttgcacatctgctgtaaaacaggaagttttgtaaggctttgtgtagtgatttttcttttgtattcttctgtgtcctgatttgccttggtgctttttgcgtcttaagtggttaacgaagtatttatttttgattattcagtttaaacaaattgttagtattatgtttattgtaatatgagttattggttggctgcataatattgcttattgtaaaatttaatggaggaaaaacacaaaaaaatatatcttaaagcagtaccttgccaaagagctaagaacctctttgatgtgggtttaaaaagcatctatttttataaaaagacaaatttggagaaactttttactggacctggaacaaatattttgacttggatactttgagaaatatcttcatatgacaccttaccaggaagtttgcagtggttgacatttctggagagatttctgatgtaaaagataccttttgagatctttgtattatctttcgattctagaatcaatggcagtgatggtttcatttgtataatcacctgtgggttgtcctatcatcctggctgttatgactagcaactcccattcacttttgatttggaaatgcagacagaaaaaatacaaaggtttatttgcaaaagtgcatgcaaaattatagtggaaatatcttcaaggtaaaaggggggggggataaaaatcagttcttcctaaagaattcccttcaagacagcgctcatggtggtttgtggtgtacttactatatcattttgtctttatattaaacaaataagggttttacctactttgtatgaaagagggagaggacaagctgaccaaggcagctgattaagtaaacgagtttgaatgaaagatggggaagattactcctgggcttagagctatgtaaataagtcctttttttttatgttgagtatttagctagcatatttgttatttttttggactttatggcgaagtgctttttttatttgagtaactagtgtgatttattgatttttctggggagatattgccttattttgatttcagttcgactttgaaagttcacattcagttaaaatacttgatttgttgtcctatggactagcattacagtgtcagatttgttggtgattttggtctttagatggtcttgcttctgctattaagaaaactatagacatttaagttggtttgttttatatataaacattatagatatatatttatgtggtaaagaatggatataaaccagtttttagctttctgattactttttttttttcattcatatagacgtaatgcataataacctgtcttaaaaatcgtaaaaggtgtattgctttattcacttgaagcggttccatgaccatatcaaaaagggttgcaagagattgccgaacaacatcttgcttctctcgaacagaggctggtcaagcccttagatgcactgagtactgcacctgcatcctgctttgtcttgagctcattactagtcatacgtctccttatcgagcagtgtgctgtgcattatatatatatacatttatatatttaccaactgcttttcttatactttttctctttttttttttggttaattgtacaagttcaactttgattatagattagctgtgacactgctgctgtgggggaaggggcccccattttctcatgcccggcctctcactggtcttgattgaggataacttgacggacccgagggggctctgactagctaggcatggcaaaatgagcccccccacacccactttcaattctaaatgtgagaattattatttatttgaagttgtacagtattacttggttccacagcggttttgggatagaatatatcttgagtatttaaaaaaggatgtacatgttattttctttgtgtttggaatactttgtattttttcatgttcagtacatcaataaatacgttgaagggaaatgca
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类型:cdna非编码
生物体:尼罗罗非鱼(o.niloticus)
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序列号184(elavl23’utr)
长度:465bp
类型:cdna非编码
生物体:斑马鱼(daniorerio)
ggagtgccgacgtgcagcgctttgcaaacgtgactttgcaataatgacgggacgcgtatattatattcttttcttttcttaaagtactttatcattattttaagcatttgtttaatgatttacgtaggatataacagctgactgtttaagtgtttgtttttggcgtgtgatcctgagggcgtgatgctgagatggagagcgctggtgttcccgtctctcctcatgggcttctgcggtgcagtccactgcataatctttgtgcatgaatctttagttaaaccatttcagttcgctttctgtgctaaaggctctttgtgttgaaagatatatctttatgttaagcatttaaatgagacaagatgtacgtgttgttttgtgtttgaaatttgggatttgtttttgttttttattgttcagtacatcaataaatactttgaaaggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
序列号185(elavl23’utr)
长度:1264bp
类型:cdna非编码
生物体:鲶鱼(ictaluruspunctatus)
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序列号186(elavl23’utr)
长度:2176bp
类型:cdna非编码
生物体:青鳉(oryziaslatipes)
aagtaagggggggaaaaaaaccactgagattgttcttaaaaaacaaaaaaactcaccagaaagaagtggaacatgggagcttttgaccgtaactttctacattagtaagaacagctttgtaatcgatatttagcctccaacattgtgactttttgttttcgttgctttcagtccttagtttcaagcaaaaaagtagtgcaggtctgaaggcctgtcgtgttgccgatggatcacctgaaatgttctgggttttgtcgtttagttgctctttgatttgacccagtgagtcttgtacggctgtgactttttctttctcttctgctgtgtcccccagtagctgcatcaggcttttagtggtaagctagtacttctgttggagactttttttttttttttcctctttccgttctgttggtttctcgtaatgcgttggttatcggttgactgcatccagttgcttattgtaaaacttagccgattaaaaaataaaaaatacatacataaagggaaaaagacaaaaaaaattcttaaagcagtaccttgccaaagagctaagaacctctttgatgtgggtttaaaaagcatctatttttataaacagaaaaatttggagaaactttttactggacctggaacaaaaaaaaaaatattttgacttggatactttgagaaatatcttcatatgacaccttgtgagcttttgaactttacaagaaagtttgcagtggtcgacatttctggagagatgttatgatgtaaaagataccttttgagatctttgtattacctttagattctagaatcagtggcagtgctggtttcattcgtcaaatcgtctgtgggttctcctccatcccggtcgtccgctcgacccccaacggtgcacttttcccccctccagacaaaagcgaacagtgcatgctaaacgaccgctagaggagatcttcatgggaattaaatcagttcttcctttaagattcccttcagacggagccgcggtggtttgtggcgcacccacgatgtatcgtgagaccaatcttggcttgaaatgaatcatttgtggtttttaaatagtttgtacgacagactgacggaggcagagacaaaaaaaaacccaacaaaagctctgaagaatcggatgactcctaagcgttgagctgtgtaaataaatcttttgtttgttttgtttatgttgtgtattggacacttttctttacagttggattcctgggtatggaaagtgatgattttttttttctttctttctttcttggagtacgtgaggtgtttactgtttttgagttggcaaaaccttaatttatatttttggttttcctatggacgaacactgaagtgcatcaaatttgttggtggtttggtctgtagttagtctttgtttgttacaaaaaaaagtattcaactatagacagtttttttttaatatataaacattatagatatatatttatgtggtgaagaatggatataaaccacatttctggattttttttttcatactatgtaaaaacaatgcatataacctgtctttaaaaatcgtaaaaaaggtgtctattgctttaggaaggacggtgaagcagaaacgaatagcagaagtgattgcaacagttgttggcggcggtgggcggagcctagcagtctctgaatcctgcatcctttctgctatttcaacccagtcatgcttcccttactgagcagtgtgctatgcattcaatgatcctttgcaactgctttttctttagagaacttctttgtgttccttgtaaaagttcctctttaagtctagatgagttgtgatacttgctgctgtagaggagggtggggtgggggggcatgctttttacgcctgacccatctgggctttttttgtttttttaaaaattcatcgatttttttttttttttttttaatagatttgatcgtccggcgtgaaaacgtgtccccctacgaccccggcccccccattcttctgatctctattctttagtgagaatgattatttatttgaagttgtatagtccgactcggttcacagcgtttttgggaatagaatatttttgttgactatttaaaaggatgtacatgttctttactttgtgtttggatactttgacttttttcaatgttcagtacatcaataaatatgtttgaagggcaa
序列号187(elavl23’utr)
长度:485bp
类型:cdna非编码
生物体:爪蟾(x.tropicalis)
caagttaacttctcccattatatacacacatgcaacaaaggcaagttgataaactttatactttttgaaattgtctttgcaagtaagtgttacaccaaagtgtgtgggtttgagggagccacggcaaaatgagatcatcatttagcatctttagaatatgtgagattgttattgttggattttggatttttattttatgtttgtgtatggaccttgggtaacagggtttttaccggtcatattacattatgccttctattgagggggattttttttagatatttcagcagtgggaagacgatttatgttccgtttttttacattcttaccttcaaacctgagttaaagctttggaaggatttttgttaaaatggttaagtatatgaaagttatttcatttttattataatttataaatgtgtaaaaccatatttattttgcggttatttagggaattggaggactccactataaaaaaaaaaaaa
序列号188(nanos33’utr-del8nt)
长度:793bp
类型:cdna非编码
生物体：尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)
序列号189(nanos33’utr-del32nt)
长度:769bp
类型:cdna非编码
生物体：尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)
序列号190(dnd13’utr-editedmotif1)
长度:465bp
类型:cdna非编码
生物体：尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)
在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节，以便提供对实施例的透彻理解。然而，显而易见的是，对于本领域技术人员来说不需要这些具体细节。
上述说明的实施例仅旨在作为示例。本领域技术人员可以对特定实施例进行改变、修改和变化。权利要求的范围不应受到本文阐述的特定实施例的限制，而应以与本详述整体一致的方式来解释。
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