一种杀菌杀病毒酶制剂组合物及其应用的制作方法

本发明涉及一种杀菌杀病毒组合物及其应用，涉及食品和日化领域。

背景技术：

无风吹、无日晒的条件下，在光滑无孔的表面，有囊膜的病毒，如冠状病毒、流感病毒、艾滋病毒，可以维持感染活性1～2天；无囊膜的病毒，如甲肝病毒、诺如病毒，可维持感染活性长达数周。诺如病毒会引发急性肠胃炎和食物中毒。这种病毒具有强大的感染力，只要有10至100个病毒体进入人体，就会导致感染。流感病毒及冠状病毒类具有人传人特性，在世界范围内的扩散对世界人民的生命安全造成了极大的隐患。对于皮肤表面的病毒杀灭通常使用75％的酒精。对环境使用的含氯消毒剂在环境中容易富集，具有伤害性。但两者的使用都有一定局限性。

此外，在食品加工和生活环境中，来自于食品原料引起食品腐败，变质的细菌和霉菌病毒等的数量仅占一小部分。事实上，从事食品生产的人员的手部和皮肤、食品制造的机械和器具的表面，和从空气落下的微生物，及食品生产过后清洗消毒不彻底而导致细菌繁殖，最终造成食品加速腐败的情况也不容小视。单独向食品中添加防腐剂而未有效控制作业环境的微生物细菌及病毒的发生并不能从根源杜绝食品危害事件的发生。因此，食品工业通常要求从业人员在进行食品加工前使用酒精制剂对手部进行消毒，并对食品制造的器具及机械表面进行喷洒消毒剂以进行杀菌，并防止细菌污染。然而，为了达到理想的杀菌杀病毒效果，酒精的浓度需要在70％以上，而且容易挥发不具有持久性。除此之外，酒精对于部分病毒无明显效果。高浓度的酒精消毒剂的频繁使用，不仅会造成手部脱脂和皮肤干燥，也可能存在一定的安全隐患。因此，一种天然、有效的杀菌杀病毒的杀菌剂对于食品行业控制食品污染、提供绿色健康的操作空间具有重要的行业推动价值和巨大的应用潜力。

溶菌酶是一种能水解致病菌中细胞壁黏多糖成份的水解酶。但是对病毒类和革兰氏阴性菌等无作用。中国专利申请cn106029089a中揭示了使用热变性的手段改造溶菌酶使其具有杀灭诺如病毒功能的发现，但是制作工艺复杂，热变性造成蛋白质的絮凝，降低了原料的利用率。

因此，本领域中亟需一种杀菌谱广且稳定性好的杀菌杀病毒组合物。

技术实现要素：

针对现有技术存在的一系列上述不足，本发明通过使用酶解工艺从溶菌酶稳定简易获取多肽及蛋白组分，并结合葡糖氧化酶及酸性乙醇水而制造制剂，使其对革兰氏阳性菌的杀菌能力提高10倍以上，并获取了对于革兰氏阴性菌及病毒的有效杀灭作用。

具体而言，本发明的第一方面提供了一种杀菌杀病毒组合物，其中，所述组合物含有0.02-1wt％的酶解溶菌酶和1～500u/g的葡糖氧化酶。

本发明的第二方面提供了一种杀菌杀病毒组合物的制备方法，其中，所述方法包括配制酶解溶菌酶与葡糖氧化酶的混合物，并控制所述酶解溶菌酶的含量为0.02-1wt％，所述葡糖氧化酶的含量为1～500u/g。

本发明的第三方面提供了一种杀菌杀病毒方法，其中，将本发明的第一方面所述的组合物按1～2wt％的添加量添加至待处理的液体、半固体或固体。

本发明的第四方面提供了本发明的第一方面所述的组合物在食品安全、日化领域中的用途。

有益效果

本发明通过酶解改造溶菌酶的特性，并将酶解溶菌酶与葡糖氧化酶进行复配，并采用酸性乙醇水溶液使二者形成稳定溶液，解决了溶菌酶及葡糖氧化酶等在杀菌消毒剂中出现沉淀，无法杀灭病毒及革兰氏阴性菌等问题，保存期限可达24个月以上，二者的杀菌杀病毒效果能够产生协同作用，比单独使用单一成分的杀菌消毒剂效果提高2倍以上。本发明的杀菌杀病毒组合物，杀菌谱广，而且产品安全绿色，成本低廉，经济环保，可广泛用于病毒破灭及食品加工企业的器具杀菌，从业人员的手部杀菌等领域。

附图说明

图1是示出了(a)溶菌酶、(b)酸水解溶菌酶、(c)酶解溶菌酶的分子量分布的示意图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在第一种实施方式中，本发明提供了一种杀菌杀病毒的组合物，其中，所述组合物含有0.02-1wt％的酶解溶菌酶和1～500u/g的葡糖氧化酶。

在本发明中，除非另有说明，术语“酶解溶菌酶”是指溶菌酶的酶解产物；术语“溶菌酶”是指具有将n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞壁酸的β－1,4键水解的性质的蛋白质。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶是通过蛋白酶对溶菌酶、优选鸡蛋蛋白液来源的溶菌酶进行酶解处理而获得的。

在优选的实施方式中，所述蛋白酶包括但不限于木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和/或米曲霉来源的蛋白酶。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶中分子量500以上20000以下的组分占比达到50wt％以上；优选地，所述组分包括但不限于蛋白质、多肽和/或氨基酸组分。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶的浓度为0.1-1wt％、优选0.2-1wt％，所述葡糖氧化酶的浓度为10-500u/g、优选100-500u/g。

在优选的实施方式中，所述组合物的溶剂为酸性乙醇水溶液；优选地，所述酸性乙醇水溶液中乙醇体积浓度为20～60％。

在优选的实施方式中，所述酸性乙醇水溶液是ph为2.5～3.5、例如2.5～3.0或3.0～3.5的溶液；优选地，采用己二酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、苹果酸以及它们的钠盐的一种或两种以上的组合来调节所述酸性乙醇水溶液的ph。

在第二种实施方式中，本发明提供了一种杀菌杀病毒组合物的制备方法，其中，所述方法包括配制酶解溶菌酶与葡糖氧化酶的混合物，并控制所述酶解溶菌酶的含量为0.02-1wt％，所述葡糖氧化酶的含量为1～500u/g。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶是通过蛋白酶对溶菌酶、优选鸡蛋蛋白液来源的溶菌酶进行酶解处理而获得的。

在优选的实施方式中，所述酶解处理包括如下步骤：向溶菌酶浓度为0.3～20wt％、优选5～15wt％溶菌酶水溶液中加入蛋白酶，在25～50℃的条件下保温酶解1～24小时；反应完毕后，80～100℃加热30～60分钟进行灭菌处理；经过过滤去除不溶物，喷雾干燥，得到所述酶解溶菌酶。

在优选的实施方式中，所述蛋白酶包括但不限于木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和/或米曲霉来源的蛋白酶；优选地，所述蛋白酶在所述溶菌酶水溶液中的浓度为0.1～1wt％。

在优选的实施方式中，所述溶菌酶包括细菌型溶菌酶、鸡型溶菌酶、鹅型溶菌酶和/或噬菌体型溶菌酶。作为最优选的实施方式，所述溶菌酶只包括鸡蛋蛋白液来源的溶菌酶。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶中分子量500以上20000以下的组分占比达到50wt％以上；优选地，所述组分包括但不限于蛋白质、多肽和/或氨基酸组分。

在优选的实施方式中，所述酶解溶菌酶的浓度为0.1-1wt％、优选0.2-1wt％，所述葡糖氧化酶的浓度为10-500u/g、优选100-500u/g。

在优选的实施方式中，用酸性乙醇水溶液配制所述酶解溶菌酶与葡糖氧化酶的混合物；优选地，所述酸性乙醇水溶液中乙醇体积浓度为20～60％。

在优选的实施方式中，所述酸性乙醇水溶液是ph为2.5～3.5、例如2.5～3.0或3.0～3.5的水溶液；优选地，采用己二酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、苹果酸以及它们的钠盐的一种或两种以上的组合来调节所述酸性乙醇水溶液的ph。

在第三种实施方式中，本发明提供了一种杀菌杀病毒方法，其中，将本发明的第一种实施方式所述的杀菌杀病毒组合物按1～2wt％的添加量添加至待处理的液体、半固体或固体。

在优选的实施方式中，所述方法是将所述杀菌杀病毒组合物喷洒在所述液体、半固体或固体的表面或在其内部混匀分散。

在第四种实施方式中，本发明还提供了所述杀菌杀病毒组合物在食品安全、日化领域中的用途。

在优选的实施方式中，所述用途包括将所述杀菌杀病毒组合物作为消毒剂喷洒至环境中、或者作为消毒剂涂抹至皮肤表层(例如手部)、或者作为保鲜剂及杀菌剂添加至食品中、或者作为杀菌剂用于食品加工设备的清洁消毒、或者作为洗涤助剂用于皮肤表层清洁。

在优选的实施方式中，所述杀菌杀病毒组合物用于一种或多种下述细菌和/或病毒的杀灭，所述细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、白色念珠菌和李斯特菌等；所述病毒包括但不限于诺如病毒、冠状病毒、新型冠状病毒、流感病毒、甲肝病毒和手足口病毒等。

实施例

以下对本发明的具体方案进行说明，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本发明的范围和精神。在本发明中，除非另有说明，所使用的方法均为常规方法；所使用的原料或仪器均为常规原料或仪器。除非另有说明，实施例中使用的溶菌酶为鸡蛋蛋白来源的溶菌酶。

本发明采用的评价方法如下：

(1)杀菌杀病毒组合物稳定性评价

取20g将杀菌杀病毒组合物分别置于4℃、20℃、45℃下静置1天、3个月、6个月、24个月、24个月后，观察是否有沉淀析出。

(2)杀菌性能测定

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌置于营养肉汤培养基上培养24h，用接种环挑取典型形态的供试菌落，接种于5mllb液体培养基中，37℃，200r/min，培养2～6h至对数生长期。取适量菌液，用lb液体培养基调整菌浓度至10⁵cfu/ml。对最小抑菌浓度mic进行测定。无菌条件下，依次将各实施例的步骤1组分按比稀释。按稀释度从低到高依次加入到无菌96孔板的第1列至第11列，每孔50μl，第12列为阳性对照，加等量无菌水。随后每孔再加入50μl菌液，密封混匀。此时，第1孔至第4孔杀菌杀病毒组合物的终质量浓度为0.005％、0.02％、0.2％、1％；第5孔至第8孔为1-4孔的平行样；第9-12孔为空白，使用无菌水替代组合物。然后将96孔板置于37℃培养箱中培养5分钟后用平板或者纸片培养测定活菌落数目。

杀菌活性＝log起始生菌数/ml(放置5分钟前的菌体数目)–log杀菌后的生菌数/ml(放置5分钟后的菌体数目)

当杀菌活性的数值大于或者等于2时认为体现出良好的杀菌效果。

(3)杀病毒性能测定

使用已经确立培养方法的鼠诺如病毒替代人诺如病毒进行试验。使用50％细胞感染浓度法(tcid50法)评价杀病毒效果。将病毒液用含2％犊牛血清的mem细胞培养液连续进行10倍稀释(10^-1～10^-12)，向96孔板各孔依次加入100μl稀释好的病毒液，重复4次，由后向前依次加f81细胞100μl/孔。置37℃细胞培养箱，5d后观察细胞病变情况并按reed-muench公式计tcid50。向fcv－sh株病毒液(7.67logtcid50/ml)中按照与制剂比例为1:1缓慢加入制剂溶液，充分振荡混匀，在37℃恒温摇床中120r/min灭活5分钟后分别取样微量滴定法检测灭活病毒滴度变化。

杀病毒活性＝logtcid50/ml(放置5分钟前的病毒混合液的感染效价)-logtcid50/ml(放置5分钟后的病毒混合液的感染效价)，当杀病毒活性大于或者等于3时认为体现出良好的杀病毒效果。

(4)葡糖氧化酶活性定义

在ph5.5、温度37℃的条件下，每分钟能把1.0μmol的β–d–葡萄糖氧化成d–葡萄糖酸和h2o2的酶量为一个单位(u)。

(5)酶解溶菌酶的制备

酶解溶菌酶制备过程中，水溶液中溶菌酶的质量浓度为0.3～20％，优先选择5～15％为佳。选用的蛋白酶种类以在食品加工过程中允许使用的木瓜蛋白酶(ec3.4.22.2)、胃蛋白酶(ec.3.4.23.1)、米曲霉来源的蛋白酶(例如诺维信生物技术有限公司的商品flavorzyme1000l)。蛋白酶浓度选择对应底物质量浓度在0.1～1％，反应温度为25～50℃之间，反应时间控制为1～24小时。反应时间太长及太短均会影响最终产物的杀菌杀病毒效果。上述的酶解产物经过适当的脱盐处理，再经过分子量分布的测定。

具体的制备步骤如下：鸡蛋蛋白来源溶菌酶100kg与200kg纯化水进行均质搅拌，加入50g米曲霉来源的蛋白酶flavorzyme1000l，50℃的条件下，保温酶解3小时；反应完毕后，80℃加热30分钟进行灭菌处理；经过过滤去除不溶物，喷雾干燥，可得酶解溶菌酶粉末9.2kg。

与之对照的酸水解溶菌酶步骤如下：鸡蛋蛋白来源溶菌酶1g与200ml水溶解后加入浓盐酸(10n)，在耐热密闭性容器中115℃的条件下放置1小时，用冰水迅速冷却后使用2n的氢氧化钠溶液调整ph至6±1，3000转/分钟下离心15分钟以去除不溶物，进行冷冻干燥得到酸水解溶菌酶1.1g。

溶菌酶分解物分子量分布的测定采用下述条件：

色谱柱：ymc-packdiol200(6.0×300mm)

洗脱液：0.2m磷酸钾缓冲液(ph6.7)

流速：0.7ml/分钟

检测波长：215nm

经过检测，溶菌酶、酸水解溶菌酶、酶解溶菌酶的分子量分布依次如图1的a、b和c所示。经计算，溶菌酶的分子量分布中80％以上在78000，500～20000分子量的部分含量小于50％；酸水解溶菌酶的分子量分布中80％以上小于500，500～20000分子量的部分含量小于50％；酶解溶菌酶分子量分布中500～20000分子量的部分含量大于50％，为62.9％。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例中的酶解溶菌酶及葡糖氧化酶均为自制产物。

实施例1

按照下述步骤进行杀菌杀病毒组合物的制备和评价。

(1)以质量百分比，按照以下原料配制杀菌杀病毒组合物：100u/g葡糖氧化酶、55％酒精，依次使用0.2％溶菌酶、0.2％酸水解溶菌酶、0.2％酶解溶菌酶，依次对应编号a1-a3实验组。

(2)通过添加柠檬酸和柠檬酸钠调节杀菌杀病毒组合物的ph为3.0(即酸性乙醇水溶液的ph)。

(3)将杀菌杀病毒组合物室温放置1天、3个月、6个月、24个月，观察有无沉淀析出。

(4)测定杀菌杀病毒组合物的杀菌性能，杀病毒活性。

当使用酸水解溶菌酶、酶解溶菌酶时，所配制的杀菌杀病毒组合物稳定，当使用未水解溶菌酶时，组合物长期保存会出现沉淀。杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果如表1所示。

表1杀菌杀病毒组合物的稳定性结果※

※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出

将配制的杀菌杀病毒组合物存放6个月后的杀菌杀病毒活性进行测定，结果如表2所示。组合物a3效果优异，长期保存也能够保持稳定。

表2杀菌杀病毒组合物的杀菌杀病毒活性※

※杀菌杀病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％

实施例2

按照下述步骤进行杀菌杀病毒组合物的制备和评价。

(1)以质量百分比，按照以下原料配制杀菌杀病毒组合物：0.2％酶解溶菌酶、100u/g葡糖氧化酶、55％酒精。

(2)通过添加柠檬酸和柠檬酸钠分别调节杀菌杀病毒组合物的ph为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。依次对应编号b1-b9的实验组。

(3)将杀菌杀病毒组合物室温放置1天、3个月、6个月、24个月，观察有无沉淀析出。

(4)测定杀菌杀病毒组合物的杀菌性能，杀病毒活性。

在ph为2.5～3.5的范围内，所配制的杀菌杀病毒组合物稳定，当ph小于2.5或者大于3.5时，组合物长期保存会出现沉淀。杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果如表3所示。

表3杀菌杀病毒组合物的稳定性结果※

※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出

将配制的杀菌杀病毒组合物存放6个月后的杀菌杀病毒活性进行测定，结果如表3与表4所示。组合物b2-b4效果优异，长期保存也能够保持稳定。

表4杀菌杀病毒组合物的杀菌杀病毒活性※

※杀菌杀病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％

实施例3

按照下述步骤进行杀菌杀病毒组合物的制备和评价。

(1)以质量百分比，按照以下原料配制杀菌杀病毒组合物：0.2％酶解溶菌酶、100u/g葡糖氧化酶，依次调整酒精浓度为1％、2％、10％、20％、40％、60％、70％、80％。依次对应编号c1-c8的实验组。

(2)通过添加柠檬酸和柠檬酸钠调节杀菌杀病毒组合物的ph为3.0。

(3)将杀菌杀病毒组合物室温放置1天、3个月、6个月、24个月，观察有无沉淀析出。

(4)测定杀菌杀病毒组合物的杀菌性能，杀病毒活性。

在酒精浓度高于70％的情况下，所配制的杀菌杀病毒组合物出现不稳定现象。当酒精浓度低于20％情况下，杀菌杀病毒活力出现较大衰减。杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果如表5所示。

表5杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果※

※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出

表6杀菌杀病毒组合物的杀菌杀病毒活性※

※杀菌杀病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％

实施例4

按照下述步骤进行杀菌杀病毒组合物的制备和评价。

(1)以质量百分比，按照以下原料配制杀菌杀病毒组合物：0.2％酶解溶菌酶，葡糖氧化酶含量为0、1u/g、10u/g、100u/g、500u/g、1000u/g依次对应编号d1-d6的实验组。酒精浓度为60％。

(2)通过添加柠檬酸和柠檬酸钠调节杀菌杀病毒组合物的ph为3.0。

(3)将杀菌杀病毒组合物室温放置1天、3个月、6个月、24个月，观察有无沉淀析出。

(4)测定杀菌杀病毒组合物的杀菌性能，杀病毒活性。

在组合物中含有1000u/g葡糖氧化酶的情况下，所配制的杀菌杀病毒组合物出现不稳定现象。当组合物中葡糖氧化酶活力低于1u/g的情况下，杀菌杀病毒活力出现较大衰减。

表7杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果※

※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出

表8杀菌杀病毒组合物的杀菌杀病毒活性※

※杀菌杀病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％

实施例5

按照下述步骤进行杀菌杀病毒组合物的制备和评价。

(1)以质量百分比，按照以下原料配制杀菌杀病毒组合物：100u/g葡糖氧化酶，酶解溶菌酶浓度为0、0.005％、0.02％、0.2％、1％、2％依次对应编号e1-e6的实验组。酒精浓度为60％。

(2)通过添加柠檬酸和柠檬酸钠调节杀菌杀病毒组合物的ph为3.0。

(3)将杀菌杀病毒组合物室温放置1天、3个月、6个月、24个月，观察有无沉淀析出。

(4)测定杀菌杀病毒组合物的杀菌性能，杀病毒活性。

表9杀菌杀病毒组合物的稳定性实验结果※

※有：表示有沉淀析出；无：表示无沉淀析出

表10杀菌杀病毒组合物的杀菌杀病毒活性※

※杀菌杀病毒组合物的相对于菌悬液的终质量浓度为1％

实施例5的结果如表9与10所示，在组合物中含有2％酶解溶菌酶的情况下，所配制的杀菌杀病毒组合物出现不稳定现象，分析由于酶解溶菌酶存在的少量高分子量组分在酸性条件下形成絮凝物。当组合物中酶解溶菌酶含量小于0.02％的情况下，杀菌杀病毒活力出现较大衰减。

采用酶解溶菌酶和葡糖氧化酶共同制备杀菌杀病毒组合物，其杀菌杀病毒效果比单独使用任何一种物质效果显著增强，且优于单独使用其中任何一种化合物的效果加和。

本发明对溶菌酶、酶解溶菌酶、酸水解溶菌酶的杀菌杀病毒活性进行对比，发现溶菌酶对于革兰氏阴性菌杀灭作用很弱，对病毒几乎无杀灭作用，且在酸性乙醇水溶液中稳定性差；酸水解溶菌酶虽然在酸性乙醇水溶液中稳定性高，但是杀菌杀病毒作用微弱；本发明制得的分子量500以上20000以下的组分占比达到50％以上的酶解溶菌酶，在合适比例和ph的酸性乙醇水溶液中稳定且具有高效的杀菌杀病毒作用。

本发明还对杀菌杀病毒组合物的组分及浓度进行了其它调整，结果显示，在酶解溶菌酶浓度低于0.02％的情况下，所配制的杀菌杀病毒组合物难以达到理想的杀菌效果。当葡糖氧化酶浓度低于1u/g的状况下，杀菌活力相对于组合物而言出现明显下降，葡糖氧化酶对于组合物杀菌能力的提高有显著作用。而当葡糖氧化酶浓度高于1000u/g时，配制组成物放置后出现沉淀，长期保存时不稳定，难以实现商业化生产。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。