本发明涉及中药栽培技术领域，具体涉及一种利用生长调节组合物制剂的茯苓种植方法。
背景技术：
茯苓(wolfiporiacocos(schw.)ryv.etgilbn.)，属于担子菌门(basidiomycota)，层菌纲(hymenomycetes)，非褶菌目(aphyllophoracws)，多孔菌科(poliporaleae)，茯苓属(wolfiporia)的一种以腐生为主兼营寄生的褐腐真菌。茯苓通常生长于松属(pinus)植物的根部，菌丝扭结成团状即为菌体。茯苓是一种传统的药食同源物质，具宁心、利水、渗湿、健脾之功。现代药理学研究表明，茯苓另具有调节人体免疫力、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等功效，其发挥生物有效的主要有效物质为茯苓多糖和三萜类物质。
茯苓味甘淡而性平，偏长于渗湿健脾宁心，具有利而不猛，扶正兼能祛邪等特点，《神农本草经》言其“久服安魂养神，不饥延年”，以茯苓为原料制备的保健食品、普通食品等产品形式多样，保健康养理念各异，市场消费量巨大，供消需求矛盾日益突出。近年来，茯苓栽培越来越受重视，各产区当年10-12月选地、整地及准备松木料，第二年清明节前后将松木料堆窑、接菌后覆土栽培，根据茯苓结苓大小在当年10月-12月或第三年的3-4月采收，一般历经6个月至12个月的生长后采收。由此可见，传统茯苓栽培方法中，茯苓的生长周期长。在茯苓栽培过程中，结苓的速度和大小将会直接影响茯苓的产量，因此，促进茯苓菌核快速发育、加快结苓速度，对于规模化栽培茯苓和提高茯苓产量具有重要意义。
技术实现要素：
本发明意在提供一种利用生长调节组合物制剂的茯苓种植方法，以解决传统茯苓栽培方法中茯苓生长周期长的问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种利用生长调节组合物制剂的茯苓种植方法，包括入窖栽培和增施生长调节组合物制剂步骤，入窖栽培和增施生长调节组合物制剂步骤中均喷施由芸苔素内酯与em菌液混合配制而成的生长调节组合物制剂。
本方案的原理及优点是：在入窖栽培和增施生长调节组合物制剂步骤中，均喷施由芸苔素内酯与em菌液混合配制而成生长调节组合物制剂，该生长调节组合制剂是发明人经过不断探索发现的。在发明人在发现芸苔素内酯与em菌液联用具有意想不到的效果前，也尝试将赤霉素、胺鲜酯、氯吡脲等应用到茯苓的培育中，而后也尝试将赤霉素、胺鲜酯、氯吡脲等分别与em菌液联用在茯苓培育期间，并没有出现茯苓产量和茯苓有效成分含量提升的现象。在这个探索过程中，发明人发现在茯苓培育期间喷施芸苔素内酯与em菌液，会有效提高茯苓产量和茯苓有效成分的含量，而后，发明人进一步探索发现，该生长调节组合物制剂中，芸苔素内酯的生物活性与其结构密切相关：芸苔素内酯高活性必须具有如下结构特征：①a/b环为反式；②b环含有7位内酯和6位酮基；③a环上具有2位和3位两个羟基；④侧链22位和23位具有羟基；⑤侧链24位上有1-2个c的取代基。而em菌液富含放线菌、杆菌、细菌、酵母等多种有益微生物，其可参与多种代谢产物的合成、解构。芸苔素内酯联合em菌液使用，em菌液中的多种有益微生物可对芸苔素内酯进行解构、合成等多种生理生化反应，生成高活性的芸苔素内酯，即em菌液能够活化芸苔素内酯，从而促进茯苓菌核快速发育、加速结苓速度，缩短茯苓菌核生长周期，提高茯苓产量。
同时，芸苔素内酯与em菌液联合使用时，能够显著提高鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的活力，同时提高α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)的活力，抑制葡糖磷酸异构酶(pgi)的活力，而鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶是引导茯苓菌核代谢过程中乙酰辅酶a向茯苓三萜合成途径的关键酶类，α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)和葡糖磷酸异构酶(pgi)是多糖合成积累过程中的关键酶类，因此，芸苔素内酯与em菌液联合使用时，能够通过影响关键酶类的活力来提高茯苓三萜类化合物和茯苓多糖的含量，进而提高茯苓的品质。此外，em菌液中的有益微生物对茯苓菌核的生长无抑制作用，且具有拮抗或抑制土壤中有害微生物的作用，为茯苓菌核的生长创造良好的生长环境。
综上所述，本方案在茯苓菌核入窖栽培前以及窖内栽培期间喷施生长调节组合物制剂，使得茯苓菌核在窖内栽培55-65天后即可生长成熟，相较于传统的茯苓栽培方法，本方案大幅度缩短了茯苓的生长周期，提高了茯苓的产量，同时，还提高了茯苓中的茯苓多糖以及三萜类化合物的含量，从而提高了茯苓的品质。并且，本方案简单易行，利于推广应用，具有广阔的市场前景。
优选的，作为一种改进，所述生长调节组合物制剂中，芸苔素内酯的浓度为1.0×10-4-2.0×10-4mm，em菌液的活菌浓度为105-106cfu/g。
芸苔素内酯的浓度过高时，芸苔素内酯不易完全溶解，而芸苔素内酯的浓度过低时，对茯苓菌核的作用不明显。em菌液的活菌浓度过高时，喷施生长调节组合物制剂后培养料上的活菌数量过多，而em菌液的活菌浓度过低时，对茯苓菌核的作用不明显。因此，芸苔素内酯的浓度为1.0×10-4-2.0×10-4mm，em菌液的活菌浓度为105-106cfu/g是较优选择。
优选的，作为一种改进，所述生长调节组合物制剂的喷施量为50-300ml。
生长调节组合物制剂的喷施量过多时，将会存在生长调节组合物制剂浪费的问题，而生长调节组合物制剂的喷施量过低时，对茯苓菌核的作用效果有限，因此，生长调节组合物制剂的喷施量为50-300ml是较优选择。
优选的，作为一种改进，入窖栽培和增施生长调节组合物制剂步骤中，均是在茯苓菌核的接种处喷施生长调节组合物制剂。
相较于直接在覆盖茯苓菌种的土壤上喷施生长调节组合物制剂而言，在茯苓菌核的接种处喷施生长调节组合物制剂，能够保证生长调节组合物制剂的有效量。
优选的，作为一种改进，增施生长调节组合物制剂步骤中，每隔20-25天喷施一次生长调节组合物制剂。
喷施生长调节组合物制剂的间隔时间过长，则会出现生长调节组合物制剂断层的问题，而喷施生长调节组合物制剂的间隔时间过短，则会出现生长调节组合物制剂喷施量过多的问题，因此，每隔20-25天喷施一次生长调节组合物制剂是较优选择。
优选地，作为一种改进，入窖栽培步骤中，茯苓菌核接种后，使用ph为5.5-6.5的砂性土壤覆盖茯苓菌核，覆盖厚度为18-22cm。
砂性土壤具有较好的透气性和透水性，而砂性土壤的ph为5.5-6.5时，有利于土壤中有效成分的释放和微生物的生长，从而利于茯苓菌核的生长发育。
优选的，作为一种改进，在入窖栽培步骤前还包括选择山地造窖的步骤，在海拔400-1000m处的缓坡山地上造窖，缓坡山地的坡度小于35°。
具有一定坡度的山地有利于排水，避免窖内积水造成菌丝死亡，有利于茯苓菌核生长，而缓坡山地的坡度不宜过陡，否则窖内的茯苓菌核、土壤易滑移。
优选的，作为一种改进，在入窖栽培步骤前还包括制备培养料的步骤，将松木屑、松木枝、松木块粉碎物与小麦粒、麦麸、棉籽壳、硫酸镁、磷酸二氢钾、蔗糖、石膏、石灰混合，添加清水调节含水量，培养料团握不滴水即可。
本方案中的培养料能够在入窖栽培后为茯苓菌核提供充足的养分。
优选的，作为一种改进，培养料的配比按重量份数分别为：松木屑粉碎物10-30份、松木枝粉碎物10-30份、松木块粉碎物15-40份、小麦粒15-25份、麦麸5-15份、棉籽壳5-10份、硫酸镁0.5-1份、磷酸二氢钾0.5-1份、蔗糖0.1-1份、石膏0.1-1份、石灰0.1-0.5份。
本方案中的培养料的营养结构更加符合茯苓菌核生长所需的营养结构。
优选的，作为一种改进，将培养料袋装成栽培袋，对栽培袋进行灭菌处理，灭菌温度为115-121℃，灭菌时间为16-24h。
栽培袋在115-121℃条件下灭菌16-24h即可完全灭菌，不会出现灭菌不完全的问题，从而避免茯苓菌丝受到污染的问题。
具体实施方式
实施例1
本实施例中的一种利用生长调节组合物制剂的茯苓种植方法，包括以下步骤：
s1、茯苓种植场的选择：选择未受污染、排水性良好、坡度为20°的缓坡山地，在海拔为600m处的缓坡山地上造窖，该缓坡山地属于三年内未栽培过茯苓的生荒地。
s2、培养料的制备：取暴晒过的松木屑10份、松木枝30份、松木块粉碎物30份与小麦粒20份、麦麸10份、棉籽壳8份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾0.5份、蔗糖0.2份、石膏0.3份、石灰0.1份按重量份数配比混合，添加清水调节含水量，培养料团握不滴水即可，调节好水分后装袋。将装袋好的栽培袋放入高压灭菌锅内，120℃，保温16小时，进行灭菌，灭菌完毕后，栽培袋自然冷却到室温。
s3、栽培袋接种与发菌：将步骤s2中冷却后的栽培袋移入接种室，在无菌接种室内茯苓菌种移入栽培袋内，完成茯苓菌种的接种，而后将接种完的栽培袋放入恒温培养室内，单排堆码排放，培养温度调至25℃。培养期间定期检查培养袋内茯苓菌丝的生长情况，发现菌袋感染现象要及时清理，避免交叉感染，培养至茯苓菌丝长满培养袋。
s4、入窖栽培：在农历谷雨节前后，选择天气晴朗的日子，将步骤s3中的栽培袋的一侧划口，将当年的2cm×2cm大小的鲜茯苓菌核种子接种于栽培袋的划口处，使鲜茯苓菌核种子紧贴培养料，再将接种后的栽培袋侧放于窖内，在接种处的培养料上喷施生长调节组合物制剂，随后覆盖厚度约为20cm的土壤，覆盖的土壤隆起，以利于排水。其中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.5×10-4mm)+em菌液(5×105cfu/g)，喷施量为200ml；土壤为砂性土壤，且土壤的ph为6。
s5、增施生长调节组合物制剂：窖内栽培期间，每隔23天喷施生长调节组合物制剂，喷施方法为轻轻拨开覆盖的土壤，露出培养料或茯苓菌核，向茯苓菌核附近的培养料喷施生长调节组合物制剂，随后拨拢土壤重新覆盖茯苓菌核。其中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.5×10-4mm)+em菌液(5×105cfu/g)，喷施量为200ml。同时，定期检查茯苓菌核是否发生病虫害，并及时清理、防治，避免病虫害扩大化。
s6、采收及加工储存：茯苓菌核入窖栽培后经过55天的生长即可成熟，茯苓菌核成熟的标志：菌袋中营养料耗尽，颜色由纯白色转变为黄褐色至黑色；茯苓菌核没有开裂生长，茯苓皮呈棕色，质地坚实无弹性，白色嫩口呈褐色。采收后的茯苓菌核含水量大，要及时清洗、干燥，然后经切块等加工后储存。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(2.0×10-4mm)+em菌液(106cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经60天的生长即可成熟。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.0×10-4mm)+em菌液(105cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经65天的生长即可成熟。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.0×10-4mm)+em菌液(5×105cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经62天的生长即可成熟。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.0×10-4mm)+em菌液(106cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经63天的生长即可成熟。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.5×10-4mm)+em菌液(105cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经59天的生长即可成熟。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(1.5×10-4mm)+em菌液(106cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经57天的生长即可成熟。
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(2.0×10-4mm)+em菌液(105cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经64天的生长即可成熟。
实施例9
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4和步骤s5中，生长调节组合物制剂为芸苔素内酯(2.0×10-4mm)+em菌液(5×105cfu/g)；步骤s6中，茯苓菌核入窖栽培后经61天的生长即可成熟。
实施例10
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s2中，培养料的重量份数配比为：松木屑30份、松木枝20份、松木块粉碎物20份与小麦粒25份、麦麸15份、棉籽壳5份、硫酸镁1份、磷酸二氢钾1份、蔗糖1份、石膏1份、石灰0.5份。
实施例11
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s2中，培养料的重量份数配比为：松木屑20份、松木枝10份、松木块粉碎物15份与小麦粒20份、麦麸5份、棉籽壳10份、硫酸镁0.6份、磷酸二氢钾0.8份、蔗糖0.5份、石膏0.5份、石灰0.3份。
实施例12
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4中，土壤的ph为7。
实施例13
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例的步骤s4中，土壤的ph为5。
对比例1-14，以及对照组1-3中，分别以不同的喷施物代替实施例1中的生长调节组合物制剂，具体如表1所示，其余操作与实施例1相同。
表1各组喷施物选择及浓度表
记录实施例1-9、对比例1-14以及对照组1-3中栽培的茯苓菌核成熟的生长周期、茯苓产量、茯苓多糖含量以及茯苓的三萜类化合物含量，其中，茯苓多糖含量的测定按照标准《ny/t1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定》进行，三萜类化合物含量的测定采用香草醛-高氯酸显色法进行，所记录的结果如表2所示。
表2各组对茯苓生长周期、茯苓产量和有效成分的影响(mean±se，n＝10)
将对比例1-12与对照组1-3的数据进行对比，可以看出，单独喷施生长调节类激素或em菌液，茯苓生长周期、茯苓产量、茯苓多糖以及三萜类化合物的含量并无显著变化，说明单独使用不同剂量的各生长调节剂后对茯苓菌核的生长并没有产生特殊影响，对茯苓产量或品质也无影响。
将实施例10-13与对照组1-3的数据进行对比，可以看出，在一定范围值内，茯苓培养料各组分的配比、土壤ph的选择对茯苓的生长周期、茯苓产量以及茯苓有效成分的影响并不显著。
将实施例1-9、对比例13、对比例14与对照组1-3的数据进行对比，不难发现，不同生长调节类激素与em菌液联用后，茯苓生长周期、茯苓产量、茯苓多糖以及三萜类化合物的含量各不相同，其中，赤霉素与em菌液联用后，茯苓的生长周期、茯苓产量、茯苓多糖以及三萜类化合物的含量与对照组的数据相比并无显著变化(对比例13和对照组1-3分别进行显著性分析，p值均大于0.05)，同样，胺鲜酯(da-6)与em菌液联用后，茯苓的生长周期、茯苓产量、茯苓多糖以及三萜类化合物的含量与对照组的数据相比也无显著变化(对比例14和对照组1-3分别进行显著性分析，p值均大于0.05)。而芸苔素内酯与em菌液联用后，茯苓生长周期缩短至55-65天，茯苓产量最高为3652±33.94g，茯苓多糖的含量最高为1.92±0.21％，三萜类化合物的含量最高为4.67±0.28％，因此，芸苔素内酯与em菌液联用，不仅能够缩短茯苓的生长周期，提高茯苓的产量，还能够有效提高茯苓多糖和三萜类化合物的含量，提高茯苓的品质。此外，由表2还可以看出，不同浓度的芸苔素内酯与不同浓度的em菌液的联用，对茯苓的生长所产生的影响不同，其中，芸苔素内酯(1.5×10-4mm/l)与em菌液(5×105cfu/g)的联用效果最佳。
基于芸苔素内酯与em菌液联用能够提高茯苓中有效成分的结论，发明人进一步发现，芸苔素内酯与em菌液联用时影响茯苓品质的主要机制在于，芸苔素内酯与em菌液联用时将影响茯苓菌核萜类代谢过程中鲨烯合成酶、羊毛甾醇合成酶这两种关键酶的酶活力，同时，也会对α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)以及葡糖磷酸异构酶(pgi)的酶活力造成影响，具体结果见表3和表4。
我们知道，鲨烯合成酶是催化两分子的法呢酯焦磷酸缩合产生鲨烯的关键酶，而鲨烯是生物合成三萜等萜烯类重要物质的共同前体。因此，鲨烯合成酶的活性高低将直接影响萜类化合物的产量。另外，在萜类合成途径中涉及的分支途径——甲羟戊酸途径，该途径经过羊毛甾醇等中间体，最后经过一系列氧化还原以及环化反应形成的。羊毛甾醇合成酶处于甲羟戊酸途径中的第二个分支点，是三萜类化合物合成过程中的一个关键酶，因此，羊毛甾醇合成酶的含量以及活性高低将直接影响到三萜类化合物的产量。
而多糖合成途径中涉及糖酵解和多糖合成两大分支途径，其中糖酵解途径使碳能量向乳酸代谢方向行进，不利于多糖的合成积累，葡糖磷酸异构酶(pgi)是糖酵解途径的关键控制酶，主导着碳能量向乳酸代谢方向行进。多糖合成途径则是使碳能量向多糖合成积累方向行进，α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)是多糖合成途径的关键酶，是该途径的重要分支点。因此，α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)以及葡糖磷酸异构酶(pgi)的活性高低将直接影响到多糖的产量。
表3不同组别对三萜类化合物合成关键酶活性的影响(mean±se，n＝10)
表4不同组别对茯苓多糖合成关键酶活性的影响(mean±se，n＝10)
由表3可以看出，单独使用各生长调节类激素或em菌液并不能显著提高鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的活力，并且，赤霉素与em菌液联用时以及胺鲜酯与em菌液联用时，亦没有提高鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的活力。但，芸苔素内酯与em菌液联用时，能够显著提高茯苓三萜合成途径中鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶这两个酶的活性，而鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶是引导茯苓菌核代谢过程中茯苓三萜合成途径的关键酶类，因此，芸苔素内酯联合em菌液时，能够通过提高鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的酶活性来提高茯苓中三萜类化合物的含量。
另外，从表4中不难发现，单独使用各生长调节类激素或em菌液并不能显著提高α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)的活力，也没有显著降低葡糖磷酸异构酶(pgi)的活力，并且，赤霉素与em菌液联用时以及胺鲜酯与em菌液联用时，亦没有提高α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)的活力，亦没有降低葡糖磷酸异构酶(pgi)的活力。但，芸苔素内酯与em菌液联用时，α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)的活力显然得到了较大幅度的提升，而且葡糖磷酸异构酶(pgi)的活力显然受到了较大程度的抑制，因此，芸苔素内酯与em菌液联用时，能够通过提高α-葡糖磷酸变位酶(α-pgm)的酶活性以及抑制葡糖磷酸异构酶(pgi)的酶活性来使能量碳类化合物向多糖合成积累方向行进，从而提高茯苓多糖的含量。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。