本发明涉及细胞冻存
技术领域：
，尤其是指一种脐带血造血干细胞冻存方法。
背景技术：
：目前，干细胞治疗已在国内外得到大范围的研究与推广，而造血干细胞是目前干细胞家族中唯一获得临床准用的干细胞资源。脐带血造血干细胞移植，可以治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性等上百种疾病。随着科学技术的不断发展，脐带血造血干细胞的应用前景将更加广阔。科学家早已证明，细胞可以在低温环境中长期储存。但直接将细胞置于低温环境中会对细胞造成冰晶或溶质的损伤，这种损伤是不可逆的，会影响细胞复苏后的活性。通过进一步研究发现，将加入冷冻保护剂的细胞按照一定速率降温可以显著降低冰晶或溶质损伤，提高细胞的复苏活率。目前常用异丙醇程序降温盒或程序降温仪对细胞进行降温，然后再转入气相液氮储存罐进行储存。但目前市面上没有针对25ml/50ml规格冻存袋的程序降温盒，所以只能采用程序降温仪对25ml/50ml规格冻存袋进行程序降温。目前技术不足：使用程序降温仪进行程序降温，不仅设备价格昂贵，液氮作为程序降温仪的冷源，由于液氮特殊生产和保存条件，液氮成本较高，导致使用程序降温仪降温的细胞成本较高。在常压下液氮汽化产生的氮气过量，可使空气中氧分压下降，极端情况下可能引起人员缺氧窒息。液氮温度为-196℃，极易造成人员误触冻伤风险。程序降温仪为高精尖仪器，操作相对比较复杂，操作人员上岗前，需经过较长时间的培训，才能上岗操作。使用程序降温仪进行细胞的程序降温，受程序降温仪容积、液氮供应影响，单次细胞程序降温数量有限，无法满足目前大规模脐带血造血干细胞生产。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作方便、安全可靠、成本低、细胞复苏活率高的冻存方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种脐带血造血干细胞冻存方法，包括：s1、将脐带血造血干细胞、右旋糖酐和dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s2、将混合溶液装入冻存袋；s3、将冻存袋放在第一温度t1的环境下保持第一时长t1，其中3℃＜t1＜5℃，25min＜t1＜35min；s4、将冻存袋放在第二温度t2的环境下保持第二时长t2，其中-25℃＜t2＜-15℃，110min＜t2＜130min；s5、将冻存袋放在第三温度t3的环境下保持第三时长t3，其中-85℃＜t3＜-75℃，11h＜t3＜13h；s6、将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存，其中t4≤-150℃。进一步的，在步骤s1之中，将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液。进一步的，所述第一温度t1＝4℃，所述第一时长t1＝30min；所述第二温度t2＝-20℃，所述第二时长t2＝2h；所述第三温度t3＝-80℃，所述第三时长t3＝12h。进一步的，在步骤s2之中，所述冻存袋的容量为l，其中，25ml≤l≤50ml。进一步的，在将冻存袋放在第二温度的环境下保持第二时长的步骤之中，转移温度不高于t1；在将冻存袋放在第三温度的环境下保持第三时长的步骤之中，转移温度不高于t2；在将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存的步骤之中，转移温度不高于t3。进一步的，在步骤s1之中，采用吸头多次吹打实现将脐带血造血干细胞、右旋糖酐和dmso混匀形成混合溶液。进一步的，在将冻存袋放在第一温度的环境下保持第一时长的步骤中，采用第一保温箱对冻存袋进行持续保温；在将冻存袋放在第二温度的环境下保持第二时长的步骤之中，采用第二保温箱对冻存袋进行持续保温；在将冻存袋放在第三温度的环境下保持第三时长的步骤之中，采用第三保温箱对冻存袋进行持续保温。进一步的，在步骤s6之后，还包括对冻存袋中脐带血干细胞进行复苏的步骤，具体地，将冻存袋置于37℃水浴2分钟进行复苏。进一步的，在将冻存袋置于37℃水浴2分钟进行复苏的步骤之后，还包括对脐带血干细胞测定活率。进一步的，在步骤s6之中，将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存，保存时长t0≥1m。本发明的有益效果在于：提供了一种定温冻存的方法对脐带血造血干细胞进行冻存，该方法具有操作简单、安全可靠、成本低、细胞复苏活率高的特点，非常适用于大规模的脐带血造血干细胞冻存工作。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明，本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。实施例1一种脐带血造血干细胞冻存方法，包括：s1、将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s2、将混合溶液装入冻存袋，其中冻存袋为25ml/50ml规格无菌冻存袋；s3、将冻存袋放在第一温度t1的环境下保持第一时长t1，采用第一保温箱对冻存袋进行持续保温，其中t1＝4℃，t1＝30min，第一保温箱为4℃医用保存箱；s4、将冻存袋放在第二温度t2的环境下保持第二时长t2，采用第二保温箱对冻存袋进行持续保温，其中t2＝-20℃，t2＝120min，第二保温箱为-20℃低温保存箱；s5、将冻存袋放在第三温度t3的环境下保持第三时长t3，采用第三保温箱对冻存袋进行持续保温，其中t3＝-80℃，t3＝12hour，第三保温箱为-80℃深低温保存箱；s6、将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存，采用第四保温箱对冻存袋进行保存，其中t4≤-150℃，第四保温箱为-150℃以下的气相液氮储存罐。实验例1s1、将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s2、将混合溶液装入冻存袋；s3、将冻存袋放在第一温度t1的环境下保持第一时长t1，其中t1＝3℃，t1＝25min；s4、将冻存袋放在第二温度t2的环境下保持第二时长t2，其中t2＝-25℃，t2＝110min；s5、将冻存袋放在第三温度t3的环境下保持第三时长t3，其中t3＝-85℃，t3＝11.5hour；s6、将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存，其中t4≤-150℃。实验例2s1、将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s2、将混合溶液装入冻存袋；s3、将冻存袋放在第一温度t1的环境下保持第一时长t1，其中t1＝5℃，t1＝35min；s4、将冻存袋放在第二温度t2的环境下保持第二时长t2，其中t2＝-15℃，t2＝130min；s5、将冻存袋放在第三温度t3的环境下保持第三时长t3，其中t3＝-75℃，t3＝12.5hour；s6、将冻存袋放在第四温度t4的环境下保存，其中t4≤-150℃。将实施例1、实验例1和实验例2冻存并测试复苏活率，得到的复苏活率如表1：冻存方法复苏活率实施例190.03％实验例187.83％实验例288.75％表1由上表实验结果表明，采用实施例1、实验例1和实验例2的冻存方法的细胞活率均在85％以上，满足细胞冻存活率要求。实施例2将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；将混合溶液装入冻存袋内，其中冻存袋为25ml/50ml规格无菌冻存袋；将冻存袋放在第一温度t1的环境下保持第一时长t1，其中t1＝4℃，t1＝30min；将冻存袋放在第三温度t3的环境下保存，其中t3＝-80℃。实施例3将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐和10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；将混合溶液装入冻存袋内，其中冻存袋为25ml/50ml规格无菌冻存袋；将冻存袋放在第二温度t2的环境下保持第二时长t2，其中t2＝-20℃，t2＝120min；将冻存袋放在第三温度t3的环境下保存，其中t3＝-80℃。实验条件1采用25ml规格的无菌冻存袋，细胞在保存一个月后，采用常规方法，将冻存袋置于37℃水浴2分钟，然后测定活率。实验条件2采用50ml规格的无菌冻存袋，细胞在保存一个月后，采用常规方法，将冻存袋置于37℃水浴2分钟，然后测定活率。将实施例1、实施例2、和实施例3分别在实验条件1和实验条件2下冻存并测试复苏活率，得到的复苏活率如表2：表2由上表实验结果表明，采用实施例1的冻存方法的细胞活率均在90％以上，满足细胞冻存活率要求。对比例1s101、将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐、10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s102、将混合溶液装入25ml无菌冻存袋内；s103、将25ml无菌冻存袋放入thermo7453程序降温仪进行降温；s104、将降温完成的25ml冻存袋放入-150℃以下气相液氮储存罐保存。其中，步骤s103中的程序降温仪具体程序设计如下：s1031、等待到样品温度接近4℃；s1032、按照1℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-5.0℃；s1033、按照21℃/min的速率进行降温，直到腔体温度＝-54.0℃；s1034、按照17℃/min的速率进行降温，直到腔体温度＝-21.0℃；s1035、按照2℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-40.0℃；s1036、运行10℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-80.0℃；s1037、程序结束。对比例2s201、将细胞浓度为2*107个/ml脐带血造血干细胞、10％右旋糖酐、10％dmso按体积比8:1:1混匀，形成混合溶液；s202、将混合溶液装入25ml无菌冻存袋内；s203、将25ml无菌冻存袋放入thermo7453程序降温仪进行降温；s104、将降温完成的50ml冻存袋放入-150℃以下气相液氮储存罐保存。其中，步骤s203中的程序降温仪具体程序设计如下：s2031、等待到样品温度接近4℃；s2032、按照1℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-5.0℃；s2033、按照21℃/min的速率进行降温，直到腔体温度＝-54.0℃；s2034、按照17℃/min的速率进行降温，直到腔体温度＝-21.0℃；s2035、按照2℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-40.0℃；s2036、运行10℃/min的速率进行降温，直到样品温度＝-80.0℃；s2037、程序结束。采用实施例1在实验条件1和实验条件2下的方案，以及对比例1和对比例2的方案在细胞保存一个月以后，采用常规方法，将冻存袋置于37℃水浴2分钟，然后测定活率，得到的复苏活率如表3：表3结果表明，采用实验条件1的实施例1、实验条件2实施例1、对比例1、对比例2的方案，细胞活率均在90％以上，满足细胞冻存活率要求，并且它们无明显差异。采用实验条件1的实施例1、实验条件2实施例1、对比例1、对比例2的方案的过程中，对电力、液氮消耗等，进行单次降温成本计算进行统计，可得到如表4的成本计算结果：分组成本/元实验条件1的实施例14.23实验条件2的实施例14.23对比例1101.11对比例2101.11表4结果表明实验条件1的实施例1与实验条件2的实施例1方案单次降温成本相同，并远低于对比例1、对比例2的方案的冻存成本。从上述描述可知，本发明的有益效果在于：提供了一种定温冻存的方法对脐带血造血干细胞进行冻存，该方法具有操作简单、安全可靠、成本低、细胞复苏活率高的特点，非常适用于大规模的脐带血造血干细胞冻存工作。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12