一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法与流程

[0001]
本发明涉及落叶松组织离体培养获得再生植株的方法。通过本发明可以实现落叶松优良品系的快速、规模化繁育，克服落叶松种子繁育时间长的造林难题。同时本发明也为通过遗传工程手段获得转基因或基因编辑落叶松提供了遗传转化体系。本发明属于农林科技及生物技术领域。


背景技术：

[0002]
落叶松是重要的用材和绿化树种，其适应性强，耐腐性强，并具有生态保护功能。因此，落叶松具有经济和环境双重价值，在我国及世界各地广泛种植。杂交育种是获得落叶松优良品系的主要方法，但落叶松生长周期长、遗传背景复杂，其很难像农作物杂交育种一样，可以在较短的时间内获得纯合亲本，并通过杂交获得具有明显杂种优势且性状一致的杂合后代。因此，在短时间内获得速生、优质落叶松植株一直是落叶松繁育及造林中需要攻克的难题。现代生物技术的迅速发展，特别是基于植物外植体的离体培养技术的发展，为在短时间内获得大量再生植株奠定了坚实基础。在植物中利用该方法获得再生植株具有如下优点：（1）遗传稳定性好。由于再生植株是通过克隆化培养获得，因此优良性状可以被再生植株完全保留；（2）周期短。无需通过有性繁殖，而是直接利用植物细胞的全能性获得再生植株，不受植株生长周期及季节的限制，可以在室内实现再生植株的规模化产出。基于此，利用组织离体培养获得落叶松再生植株具有重要的经济价值。同时，落叶松离体组织培养体系的建立也为通过基因工程手段获得转基因落叶松奠定了坚实基础，在落叶松转基因育种中具有重要应用潜力。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的是提供一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法，通过该方法可以实现落叶松优良品系的快速、规模化繁育，克服落叶松种子繁育时间长的造林难题，在落叶松优良品系种苗繁育中具有重要价值。同时本发明也为通过遗传工程手段获得转基因落叶松提供了遗传转化体系，在落叶松转基因育种中具有重要应用潜力。
[0004]
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）落叶松材料的培养：购买当年采收的落叶松成熟种子，将其置于4℃冰箱低温处理14天挑选成熟饱满种子在室温下震荡浸泡48h，浸泡液中含有400 mg/l赤霉素及2%的纤维素酶，后用自来水冲洗3次；将处理并洗净的落叶松种子撒播于灭菌河沙土中，再在落叶松种子上覆盖一层0.5 cm厚的沙土，保持沙土湿润，在温度为22-23℃的培养室内培养30天收获落叶松幼苗材料；（2）落叶松离体组织的获取、消毒：收获生长20-30天的落叶松幼苗地上部分，采用5%的次氯酸钠溶液清洗6 min，每次2 min，共3次；无菌水清洗3次，每次2 min；75%的乙醇消毒1min，迅速用无菌蒸馏水清洗3次，接着用0.1%的氯化汞溶液震荡浸泡并消毒2min，最后用
无菌水清洗6次，每次2min；清洗结束后将落叶松幼苗地上部分放在灭菌的滤纸上晾干，剪去伤口坏死的部分，从而获得落叶松离体组织无菌材料；（3）落叶松离体组织脱分化及增殖培养：选取上述无菌落叶松幼苗地上部分的下胚轴，采用无菌手术刀将其切成0.5 cm长的茎段，置于含有4.0 mg/l 6-ba（6-苄基腺嘌呤） + 0.2 mg/l naa（萘乙酸）+0.5 mg/l zt（玉米素）的1/2ms培养基中，在黑暗条件下诱导落叶松离体组织下胚轴脱分化并进行愈伤组织诱导；诱导出愈伤组织后，将愈伤组织转接到含有2.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt（激动素） + 0.1 mg/l zt的1/2ms培养基中诱导愈伤组织进行增殖生长；（4）不定芽诱导及生长：将增殖培养5周左右的落叶松愈伤组织转接到含有0.5 mg/l 6-ba + 0.05 mg/l naa+2%壳聚糖的1/2ms培养基中进行不定芽的诱导，21-28天，愈伤组织的绿色区域诱导出不定芽；将产生的不定芽转到含有1.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l iba+ 2%壳聚糖的1/2ms培养基中进行不定芽伸长培养，两周后观察芽的生长情况：芽叶片颜色正常，叶片密集，生长状态良好；（5）不定根诱导及增殖：取2-3 cm长的不定芽的末端平切少许茎段，转接到含有1.0 mg/l iba+2%壳聚糖+0.05 mg/l zt的1/2ms培养基中进行不定根的诱导及增殖，42天，不定根形成，并在主根上延伸出侧根；（6）落叶松再生植株炼苗及移栽：落叶松再生幼苗生长出发达的根系后，打开培养瓶，将其放置在组织培养室中2-3天，温度为22-23℃，同时向培养瓶中直接添加少量蒸馏水，以保持水分；用小刀切断生根苗与底部培养基的联系，防止根部受损，再用镊子取出试管幼苗，用水仔细洗掉根部培养基；将洗过的幼苗移入装有无菌混合土壤（草炭土：沙土：蛭石=2:1:1）的花盆中，轻轻压实土壤，将其置于栽培室，温度为22-23℃，光照周期16h/d，定期浇水，保持土壤湿润；经过4-8周，若移栽的落叶松顶芽继续生长，则表明再生幼苗移栽成活。
[0005]
本发明所述步骤（3）中落叶松离体组织脱分化及增殖培养的愈伤诱导培养基为1/2ms+4.0 mg/l 6-ba + 0.2 mg/l naa+0.5 mg/l zt；愈伤组织增殖培养基为1/2ms+2.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l zt。所述步骤（4）不定芽诱导培养基为1/2ms+0.5 mg/l 6-ba + 0.05 mg/l naa+2%壳聚糖；不定芽伸长增殖培养基为1/2ms+1.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l iba+ 2%壳聚糖。所述步骤（5）不定根诱导及增殖培养基为1/2ms+1.0 mg/l iba+2%壳聚糖+0.05 mg/l zt。
[0006]
本发明进一步公开了通过组织离体培养获得落叶松再生植株方法在提高落叶松优良品系的快速、规模化繁育方面的应用。实验结果显示：利用本发明提供的方法可以实现一颗落叶松种子在半年时间内产生上百株落叶松再生幼苗，且该方法不受季节影响，全年都可以进行幼苗的再生及扩大培养，是快速、规模化繁殖落叶松优良品系的有效策略。
[0007]
本发明提供一套通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法，包括落叶松材料的培养，离体组织的获取、消毒，离体组织脱分化及增殖，不定芽诱导及生长，不定根诱导及增殖，再生植株炼苗及移栽。本发明在获得落叶松离体组培用材料时选用当年采收的成熟落叶松种子，并经过4℃低温处理后，再用含有400 mg/l赤霉素及2%的纤维素酶的浸泡液处理种子，其可以有效降低落叶松种皮太厚，不易吸水萌发的问题。此外，在种子萌发过程中采用沙土培养，其相对于一般用土壤，具有良好的透气性及良好的渗透性，可以有效促进种
子的萌发。
[0008]
本发明主要解决了落叶松生长周期长、优良品系培育、扩繁困难落叶松造林难题，重点考察了落叶松优良品系的生长发育特征及无性克隆繁殖策略，主要的难点在于攻克落叶松生长缓慢、再生能力低对无性克隆繁殖的制约。
[0009]
本发明公开的通过组织离体培养获得落叶松再生植株方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：（1）本发明采用落叶松幼苗下胚轴为外植体，在含有4.0 mg/l 6-ba + 0.2 mg/l naa+0.5mg/l zt的1/2ms培养基中进行暗培养诱导下胚轴愈伤组织形成，并采用含有2.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l zt的1/2ms培养基诱导愈伤增殖生长。其激素组合可以高效诱导愈伤组织形成及增殖。
[0010]
（2）本发明采用含有1.0 mg/l iba+2%壳聚糖+0.05mg/l zt的1/2ms培养基进行落叶松再生植株不定根的诱导及增殖。是否形成不定根是落叶松再生植株能否移栽成活的重要限制因素。在培养基中添加壳聚糖，其可以作为植物外源刺激因子与植物激素协同作用促进落叶松不定根的生成，其对于高效获得落叶松再生植株并确保再生植株移栽后的成活率具有重要价值。
[0011]
（3）本发明充分利用植物细胞的全能性结合组织培养技术，可以快速、高效且不受季节限制，规模化获得落叶松再生植株，实现落叶松优良品系的快速、规模化繁育，避免通过种子繁育周期长、性状不稳定的造林难题，为落叶松更好的服务于经济建设和环境保护提供重要保障繁育策略。
附图说明
[0012]
图1为落叶松种子在沙土中萌发照片；图2(a、b)为落叶松下胚轴愈伤组织诱导及增殖照片，其中图2a显示诱导形成的绿色愈伤组织团；图2b显示增殖膨大的愈伤组织团；图3(a、b)为落叶松离体组织不定芽诱导照片，其中图3a显示落叶松愈伤组织诱导出的不定芽；图3b显示芽叶片颜色正常，叶片密集，生长状态良好的不定芽；图4为落叶松再生植株不定根诱导的照片；图5为落叶松再生植株移栽苗照片。
具体实施方式
[0013]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
[0014]
实施例1成熟落叶松种子购自辽宁省抚顺市清原县国家落叶松良种林场种子园，取回后置于4℃冰箱低温处理14天后挑选成熟饱满种子在室温下震荡浸泡48h（浸泡液中含有400mg/l赤霉素及2%的纤维素酶），后用自来水冲洗三次。将处理并洗净的落叶松种子撒播于灭菌河沙
土中，再在落叶松种子上覆盖一层0.5cm厚的沙土，保持沙土湿润，在温度为22-23℃的培养室内培养30天收获落叶松幼苗材料。
[0015]
幼苗长至25天左右，选择生长良好的幼苗，收获幼苗地上部分。采用含有5%的次氯酸钠溶液清洗幼苗6 min，每次2 min，共3次；无菌水清洗3次，每次2 min；75%的乙醇消毒1 min，迅速用无菌蒸馏水清洗3次，接着用0.1%的氯化汞溶液震荡浸泡并消毒2 min，最后用无菌水清洗6次，每次2 min。清洗结束后将落叶松幼苗地上部分放在灭菌的滤纸上晾干，剪去伤口坏死的部分，从而获得落叶松离体组织无菌材料(图1)。
[0016]
将获得的无菌落叶松下胚轴材料切成4-7 mm的茎段，并置于1/2ms培养基（含有4.0 mg/l 6-ba + 0.2 mg/l naa+0.5 mg/l zt）中，在黑暗条件下进行落叶松愈伤组织的诱导。暗培养2-3天，红黄色的落叶松下胚轴切段开始启动愈伤诱导，并发生少许膨胀。7-10天，下胚轴膨大，开始出现可见的愈伤组织，下胚轴形态逐渐消失。16-21天，愈伤组织体积增大并形成绿色的愈伤组织团（图2a）。诱导出愈伤组织后，更换1/2ms培养基（2.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l zt），使愈伤组织进一步增殖膨大（图2b）。一段时间后观察发现落叶松愈伤组织明显膨大，愈伤组织较为紧实，形成的愈伤组织呈绿色，仅少许区域呈红色。
[0017]
将增殖培养5周左右的愈伤组织转接到1/2ms培养基（含有0.5 mg/l 6-ba + 0.05 mg/l naa+2%壳聚糖）中进行不定芽的诱导。观察发现，在7天时，愈伤组织在分化培养基中体积增大且变得紧实，愈伤组织某些区域的颜色发生了变化，且出现绿色的凸起斑块。从7天到14天愈伤组织大部分区域呈现绿色，且愈伤组织体积继续增大。21天到28天，愈伤组织的绿色区域诱导出不定芽（图3a）。将产生的不定芽转到1/2ms培养基（含有1.0 mg/l 6-ba + 0.1 mg/l kt + 0.1 mg/l iba+ 2%壳聚糖）中进行伸长培养，两周后观察芽的生长情况：芽叶片颜色正常，叶片密集，生长状态良好(图3b)。取2-3cm长的不定芽的末端平切少许茎段后，转入到1/2ms培养基（含有1.0 mg/l iba+2%壳聚糖+0.05mg/l zt）中。14-21天后，在培养基中茎段膨胀，同时出现愈伤团。35天后在膨胀的愈伤团上出现单一的主根（图4）。42天时，不定根继续生长，并且在主根上会延伸出侧根。
[0018]
落叶松再生幼苗生长出发达的根系后，打开培养瓶，将其放置在组织培养室中2天，温度为22℃，同时向培养瓶中直接添加少量蒸馏水，以保持水分。用小刀切断生根苗与底部培养基的联系，防止根部受损。再用镊子取出试管幼苗，用水仔细洗掉根部培养基。将洗过的幼苗移入装有无菌混合土壤（草炭土：沙土：蛭石=2:1:1）的花盆中，轻轻压实土壤，将其置于栽培室，温度为22℃，光照周期16h/d，定期浇水，保持土壤湿润。经过4-8周，若移栽的落叶松顶芽继续生长，则表明再生幼苗移栽成活（图5）。