一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法及其应用与流程

本发明涉及作物新品种选育技术领域，尤其涉及一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法及其应用。

背景技术：

棉花杂种优势利用是提高棉花产量、改进纤维品质的有效途径，核不育两用系杂交棉因其制种用工少、种子生产成本低而备受关注，而核不育两用系的创制则是关键。现有技术已培育出抗a1、抗a2、ga、ga5、ga18、ga70等核不育两用系，这些两用系具有抗病或抗虫等有利性状，但衣分普遍不高，进而影响了核不育杂交种的棉纤维产量，所测配杂交种的衣分一般在39％-41％，优势核不育杂交种选育进展较慢。多年育种经验表明，采用常规育种方法在改良某一性状时很难保证现有优良性状如结铃性好、铃大、纤维品质较好、抗虫等同时保留。西南大学将fbp7::iaam导入到棉花品种冀棉14中，获得了纤维产量和细度同步改良的转基因棉花材料if1-1(fbp7::iaam)：成熟纤维数量增加,同时其马克隆值也显著下降。但if1-1除了衣分较高以外，其他经济性状如结铃性、单铃籽棉重等表现一般，大面积直接推广应用困难。转基因生物技术与传统育种技术结合在棉花遗传改良方面已取得重大进展，我国利用自主构建的抗虫基因cry1ab/cry1ac并通过全国大量棉花育种家采用杂交、回交等传统技术培育出一大批转基因抗虫棉品种，在长江流域和黄河流域大面积推广应用了20余年，成为目前我国种植面积最大的转基因作物。转基因生物技术与传统育种技术的结合已成为目前作物育种最为有效的途径之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法及其应用，在常规育种选择中结合目的基因的pcr检测，利用所述选育方法将不育、抗虫、高衣分有效聚合，所培育的转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系，遗传稳定性好，利用其做母本与常规棉花品种杂交，可获得转基因抗虫、衣分高的核不育杂交种。本发明方法步骤合理、操作简单，缩短了育种周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法，包括以下步骤：

1)以转基因抗虫棉花核不育两用系的不育株为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫核不育杂交种f1；

2)以所述转基因抗虫核不育杂交种f1为父本，与步骤1)中所述母本进行回交，得回交一代bc1f1；

3)以回交一代bc1f1中具有高衣分基因的可育株为父本，与步骤1)中所述母本为轮回亲本进行回交，连续回交5代，得bc6f1；

4)筛选所述bc6f1中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收种，得bc6f2；

5)所述bc6f2单株种植成行，筛选抗虫株行中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收获，得bc6f3；

6)所述bc6f3单株种植成行，筛选有不育株出现且所有植株都具有高衣分基因的株行，进行不育株与可育株对株杂交，对株收获，得bc6f4；

7)所述bc6f4对株种植成行，筛选有不育株出现的株行进行株行内不育株与可育株混合杂交繁殖，得转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。

优选的，步骤1)所述母本包括棉花核不育系抗a3、ga18、ga70或sa01；所述父本包括转基因高衣分的棉花种质材料if1-1。

优选的，步骤5)中所述抗虫的植株的鉴定方法包括：在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。

本发明还提供了上述方案所述选育方法选育得到的转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系在转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种生产中的应用。

本发明还提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种的生产方法，包括以下步骤：以上述方案所述选育方法选育得到的转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系为母本，以陆地棉或海岛棉的常规品种为父本进行杂交，得转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种。

优选的，所述父本包括川棉56、川棉243、泗棉3号、中棉所12号、中棉所41、鲁棉研28号或新海21号。

本发明的有益效果：本发明提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法，利用转基因抗虫棉花核不育两用系中的不育株与转基因高衣分材料杂交，以转基因抗虫核不育两用系为轮回亲本与杂交后代连续回交六代，然后经两代自交、一代对株杂交和一代混合杂交，并结合回交、自交、对株交后代的抗虫性鉴定、育性鉴定以及目标基因的分子鉴定，选育出转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。本发明采用常规育种方法和分子鉴定方法结合，精准获得目标基因，缩短了育种周期，实现了高衣分、抗虫、不育的有机聚合，开辟了棉花核不育两用系创制的新途径，并为培育和生产转基因核不育杂交种提供了亲本材料。

附图说明

图1为转基因抗虫高衣分核不育两用系培育的流程图。

图2为所检测材料的转基因高衣分基因的pcr检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法，包括以下步骤：

1)以转基因抗虫棉花核不育两用系的不育株为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫核不育杂交种f1；

2)以所述转基因抗虫核不育杂交种f1为父本，与步骤1)中所述母本进行回交，得回交一代bc1f1；

3)以回交一代bc1f1中具有高衣分基因的可育株为父本，与步骤1)中所述母本为轮回亲本进行回交，连续回交5代，得bc6f1；

4)筛选所述bc6f1中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收种，得bc6f2；

5)所述bc6f2单株种植成行，筛选抗虫株行中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收获，得bc6f3；

6)所述bc6f3单株种植成行，筛选有不育株出现且所有植株都具有高衣分基因的株行，进行不育株与可育株对株杂交，对株收获，得bc6f4；

7)所述bc6f4对株种植成行，筛选有不育株出现的株行进行株行内不育株与可育株混合杂交繁殖，得转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。

本发明首先以转基因抗虫棉花核不育两用系的不育株为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫核不育杂交种f1。在本发明中，所述母本优选的包括棉花核不育系抗a3、ga18、ga70或sa01；所述父本优选的包括转基因高衣分的棉花种质材料if1-1，所述转基因高衣分的棉花种质材料if1-1从西南大学引进，其衣分高达45.7％，但铃较小，单铃籽棉重4.7g，平均单株结铃17个/株，结铃性不强；所述转基因高衣分材料if1-1含有转fbp7::iaam基因。本发明对所述杂交的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段进行杂交即可。

得到转基因抗虫核不育杂交种f1后，本发明以所述转基因抗虫核不育杂交种f1为父本，与上述方案所述母本(转基因抗虫棉花核不育两用系的不育株)进行回交，得回交一代bc1f1。本发明对所述回交的方法并没有特殊限定，所述回交能够将轮回亲本(转基因抗虫核不育两用系)的遗传成分递增一半到杂交后代bc1f1中。

得到回交一代bc1f1后，本发明以以回交一代bc1f1中具有高衣分基因的可育株为父本，与所述母本(转基因抗虫棉花核不育两用系的不育株)为轮回亲本进行回交，连续回交5代，得bc6f1。

本发明所述回交共六代，可发挥将轮回亲本的几乎所有遗传成分都传递给bc6f1中，达到bc6f1的主要性状已接近轮回亲本的效果。

在本发明具体实施过程中，采用的转基因高衣分品系为if1-1材料，含有的高衣分基因为fbp7::iaam；所述杂交后代材料是否具有高衣分基因的fbp7::iaam的鉴定方法，优选的包括：对高衣分基因fbp7::iaam进行pcr鉴定。在本发明中，所述pcr鉴定采用的引物为：if-up(seqidno.1，5’-atcagagccatgaataggtc-3’)、if-dn1(seqidno.2，5’-ccttgcagaccagtaagggc-3’),和if-dn2(seqidno.3，5’-gtgtgataccccaaattggg-3’)

在本发明中，所述pcr鉴定包括以下步骤：

1)分单株提取需要鉴定的转基因棉花材料的dna；

2)以所述需要鉴定的转基因棉花材料的dna为模板，分别采用第一引物组和第二引物组进行pcr扩增，得到pcr产物；所述第一引物组包括if-up和if-dn1；所述第二引物组包括if-up和if-dn2；

3)对所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若第一引物组扩增得到690bp的dna条带，且第二引物组扩增得到883bp的dna条带，表示需要鉴定的转基因棉花材料中含有目的基因fbp7::iaam。

本发明首先分单株提取需要鉴定的转基因棉花材料的dna。本发明对所述提取方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

得到分单株提取需要鉴定的转基因棉花材料的dna后，本发明分别采用第一引物组和第二引物组进行pcr扩增，得到pcr产物；所述第一引物组包括if-up和if-dn1；所述第二引物组包括if-up和if-dn2。在本发明中，所述pcr扩增的体系以25μl计，优选的包括：5×primestar缓冲液(mg²⁺plus)5μl、dntp(各2.5mm)2μl、if-up和if-dn1(或if-up和if-dn2)各1μl、棉花gdna10～200ng、primestardnapolymerase0.5u和余量的双蒸水。在本发明中，所述pcr扩增的程序优选为：98℃、10sec，56℃、5sec，72℃、60sec，运行扩增32个循环。在本发明中，所述if-up、if-dn1、if-dn2的浓度分别优选为10mm，采用双蒸水作为溶剂溶解。

得到扩增产物后，本发明对所述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在含有目的基因的情况下，if-up和if-dn1应扩增690bpdna条带，if-up和if-dn2应扩增883bpdna条带。如两个引物组合扩增结果均为阳性，表示所鉴定的转基因棉花植株中含有目的基因fbp7::iaam。如两个引物组合扩增结果均为阴性，或者一个阴性一个阳性则检测植株中不含有目的基因，应淘汰。

在本发明中，鉴定所述可育株和不育株的方法优选的包括：在两用系植株开花前7～8d，根据花蕾花粉的有无，鉴定判别不育株和可育株。即当植株下部果枝花蕾生长到9～10mm时，剥蕾，捻破花药，有花粉粒的为可育株，无花粉粒的为不育株。

得到bc6f1后，本发明筛选所述bc6f1中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收种，得bc6f2。本发明在所述bc6f1栓花自交后，进行单株收种，得bc6f2。本发明所述具有高衣分目标基因的植株的鉴定方法和育性鉴定方法与上述方案相同，在此不再赘述。本发明经所述栓花自交后，得到bc6f2种子，可发挥将抗虫基因纯合的作用。

得到bc6f2后，本发明将所述bc6f2单株种植成行，筛选抗虫株行中具有高衣分基因的可育株进行栓花自交，单株收获，得bc6f3。本发明具体实施过程中，种植bc6f2，单株成行，先后进行抗虫性鉴定、育性鉴定、高衣分基因分子鉴定，淘汰有不抗虫植株出现的株行，其余株行的可育株进行高衣分基因的分子鉴定，具有高衣分基因的可育株栓花自交，单株收种，得bc6f3种子。在本发明中，本发明所述具有高衣分目标基因的植株的鉴定方法和育性鉴定方法与上述方案相同，在此不再赘述。所述抗虫的植株的鉴定方法优选的包括：在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。本发明经所述bc6f2栓花自交后，得到bc6f3种子，可发挥将高衣分基因纯合的作用。

得到bc6f3后，本发明将所述bc6f3单株种植成行，筛选有不育株出现且所有植株都具有高衣分基因的株行，进行不育株与可育株对株杂交，对株收获，得bc6f4。本发明具体实施过程中，种植所述bc6f3，单株成行，淘汰全是可育株的株行，以及有无高衣分基因植株出现的株行，留下株行的不育株与可育株都抗虫且具有高衣分基因，进行对株杂交，每对株单独收获，得bc6f4种子。本发明所述对株杂交可将不基因、抗虫基因、高衣分基因聚合在一起的作用。

得到bc6f4后，本发明将所述bc6f4对株种植成行，筛选有不育株出现的株行进行株行内不育株与可育株混合杂交繁殖，得转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。本发明具体实施过程中，种植所述bc6f4，对株成行，进行抗虫性鉴定、育性鉴定和高衣分基因鉴定，所有植株应全都抗虫且具有高衣分基因。全是可育株的株行淘汰，有不育株也有可育株的株行保留，各株行内的不育株与可育株进行混合杂交繁殖，收获考种进行单铃重、衣分、纤维品质测试，选择衣分高、纤维品质好的株行保留，得转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。本发明所述混合杂交可将个体优良性状充分保留在群体内的作用。

本发明还提供了上述方案所述选育方法选育得到的转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系在转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种生产中的应用。

本发明还提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种的生产方法，包括以下步骤：以上述方案所述选育方法选育得到的转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系为母本，以陆地棉或海岛棉的常规品种为父本进行杂交，得转基因抗虫高衣分棉花核不育杂交种。在本发明中，所述父本优选的包括川棉56、川棉243、泗棉3号、中棉所12号、中棉所41、鲁棉研28号或新海21号。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)2014年夏季，在成都种植转基因抗虫核不育两用系ga70和转基因高衣分材料if1-1(从西南大学引进，含有转fbp7::iaam基因)。在蕾期鉴定ga70的育性，对不育株作上标记。开花后，利用if1-1的花朵给ga18不育株上的花朵授粉杂交，收获杂交铃种子，得转基因抗虫核不育杂交种f1(材料名称fb)。

(2)2014年冬季，在海南种植杂交种fb和核不育系ga70，在蕾期鉴定ga70的育性，对不育株作上标记。开花后，利用回交材料fb的花朵给ga70不育株上的花朵授粉杂交，收获杂交铃种子，得回交一代材料(材料名称fbc1f1)。

(3)2015夏季，在成都种植回交一代材料fbc1f1和核不育系ga70，在蕾期对fbc1f1(34株)和ga70(20株)进行育性鉴定，fbc1f1中有不育株19株，淘汰拔除，按上述方案对其他11株可育株进行转fbp7::iaam基因的pcr鉴定，鉴定出无fbp7::iaam基因的可育植株4株，淘汰，有fbp7::iaam基因的可育植株7株，利用这7株的花朵给ga70不育株上的花朵授粉杂交，收获15个杂交铃的种子，得回交二代材料种子(材料名称fbc2f1)。

相同方法，以ga70不育株为轮回母本，回交材料中含有fbp7::iaam基因的可育株为父本，连续回交四代得回交六代材料fbc6f1；

表1各回交后代材料育性及fbp7::iaam鉴定

(4)2017年冬季，在海南种植fbc6f1材料，得36个植株，在蕾期鉴定育性，16株不育株淘汰拔除，剩余20株(可育)进行fbp7::iaam鉴定，获得11株转基因高衣分可育株，栓花自交，每株单独收获5个自交铃，得fbc6f2种子；

(5)2018年夏季，在成都种植fbc6f2材料，11个株行，每个株行种植15株，6片真叶时用0.8％的硫酸卡拉霉素鉴定抗虫性，6个株行出现有不抗虫植株，淘汰；其余5个所有植株全抗虫的株行在蕾期时鉴定育性，淘汰22株不育株，剩余53株抗虫可育植株进行fbp7::iaam鉴定，淘汰非高衣分基因植株20株，选择12株健壮、抗虫、可育、高衣分植株栓花自交，每株单独收获，每株各收5个自交铃，得fbc6f3种子。

(6)2018年冬季，在海南种植夏季收获的12个fbc6f3可育株材料，单独种植形成12个株行，每个株行30株。蕾期进行育性鉴定，全是可育株的株行4个，淘汰，剩余8个株行均有不育株，开展fbp7::iaam鉴定，其中6个株行出现了非fbp7::iaam植株，淘汰。剩余2个株行的所有植株既抗虫又具有转高衣分基因，其中一个株行8株行不育株、22株可育株，另一个株行6株不育株24可育株；2个株行选择健壮可育株进行对株授粉杂交，每个对株单独收7个自交铃，得fbc6f4种子。

(7)2019年夏季，在成都种植海南收获的14个fbc6f4对株材料，每个对株种子单独种植形成14个株行，每个株行种植约60株，6片真叶期喷施0.8％的卡拉霉素鉴定抗虫性，所有株行的所有植株均具有抗虫性；蕾期鉴定育性，鉴定出5个株行的植株均为可育株，淘汰，其余9个株行的不育株率在48％左右。对这9个株行进行fbp7::iaam鉴定，所有植株均含有fbp7::iaam。8个株行内进行不育株与可育株混合杂交，分别收混合交铃，评价其铃重、衣分、纤维品质，筛选出4个较好株行，获得转基因抗虫高衣分核不育两用系(fba)，这些对株行的株型、铃重等与ga70基本一致，但其纤维品质中的马克隆值、衣分均比ga70有所提高。

(8)上述核不育两用系对株系种子进一步扩大繁殖，可发放到种子生产公司进行转基因抗虫高衣分核不育杂交种种子的生产。

表2转基因抗虫高衣分核不育两用系fba的主要性状

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所

<120>一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atcagagccatgaataggtc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccttgcagaccagtaagggc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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