长白斯氏线虫在防治梨小食心虫上的应用

本发明属于生物防治领域，具体涉及长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)在防治梨小食心虫上的用途。
背景技术：
：梨小食心虫(grapholithamolesta(busck)，又称梨小蛀果蛾)属鳞翅目(lepidoptera)卷蛾科(tortricidae)小食心虫属(grapholitha)。梨小食心虫在世界各果树产区都有发生，在我国尤以北方桃、梨果产区发生普遍。梨小食心虫主要危害果树的枝梢和果实，虫果率可达30％～40％，严重时可高达80％，严重影响果品的产量和质量，给果农造成巨大的经济损失。目前，防治梨小食心虫主要依赖化学农药，但是梨小食心虫具有钻蛀特性，化学防治比较困难；且化学防治还存在农药用量大、频次高，不仅污染生态环境，造成果品农药残留超标，还会加快害虫产生抗药性等问题。昆虫病原线虫(entomopathogenicnematode，epn)是指专门侵染和寄生昆虫的有益线虫，如斯氏属(steinernema)和异小杆属(heterorhabditis)线虫对地下害虫和一些钻蛀性害虫都具有较好的防治效果，是一类新型高效生物杀虫剂。昆虫病原线虫的侵染期幼虫(infectivejuveniles,ijs)可以主动搜寻寄主，具有杀虫范围广、易于人工培养、对人畜、环境安全等优点。昆虫病原线虫还可以与化学农药混用。不同种类的昆虫病原线虫生物学特性(如对特定害虫的致病力、适宜的环境条件等)具有较大差异，同一种内的昆虫病原线虫的不同地理种群之间，经过适应不同的生存环境，其生物学特性也会发生较大变化。因此，为防治当地的特定害虫，必须筛选适宜的线虫种类和品系。目前，用于防治梨小食心虫的线虫主要有：小卷蛾斯氏线虫(steinernemacarpocapsae)、芜菁夜蛾斯氏线虫(steinernemafeltiae)和异小杆线虫(heterorhabditis)等(李长青等.环境昆虫学报，2011，33(4)：512-516。李宁等.河北农业大学学报，2011，34(2)：90-93)这些线虫对梨小食心虫存在着防效相对较差等问题，亟待寻找防效更高的线虫。马娟等(majetal.russianjournalofnematology，2012,20(2)：97-112)从辽宁省本溪市土壤中采集和分离到一种新的线虫，经鉴定,该线虫为斯氏线虫属(steinernema)的一个新种，采集人将其拉丁文分类命名为steinernemachangbaiense。技术实现要素：本发明人将马娟等(maj等.russianjournalofnematology，2012，20(2)：97-112)发现的斯氏线虫属(steinernema)的新种steinernemachangbaiense的中文分类名命名为：长白斯氏线虫，并将该线虫命名为：lbx66。针对目前对于梨小食心虫尚无高效的生物防治方法，本发明目的在于提供长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)在防治梨小食心虫上的用途，该线虫对梨小食心虫的防效高，拓宽了梨小食心虫生物防治的途径。本发明提供了长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)在防治果树害虫上的应用。所述的果树害虫是指梨小食心虫等。所述的长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)为lbx66等。本发明还提供了一种生物农药，其活性成分为长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)。上述生物农药，其所述的长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)是指lbx66等。本发明还提供了上述生物农药在防治梨小食心虫上的应用。上述应用中所述生物农药中长白斯氏线虫的浓度为2ijs/cm2～10ijs/cm2。上述生物农药的制备方法，包含如下步骤：利用大蜡螟老熟幼虫活体培养和繁殖长白斯氏线虫；收集长白斯氏线虫的侵染期幼虫，用水清洗幼虫；将幼虫悬浮于无菌水中，得线虫悬浮液。上述制备方法中所述的培养和繁殖的温度为22℃～28℃。上述生物农药的施用方法，用机动或手动喷雾器将上述生物农药喷施到果园地面，或浇水时随水浇入；上述生物农药还可以与其他非杀线虫杀虫剂混合使用。本申请人承诺自申请日起二十年内向公众提供长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)lbx66。本发明具有的有益技术效果：本发明人发现长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)对梨小食心虫具有致死作用，基于该发现，将含有长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)的生物制剂施于桃、梨等果园中，结果长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)对梨小食心虫的防治效果可达93％，防治效果极为显著；此外，用长白斯氏线虫防治梨小食心虫还具有环保、持效期长、成本低、专一性强和不易产生抗药性等优点。附图说明图1为不同浓度长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)对梨小食心虫幼虫致死率柱形图。图2为长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)对梨小食心虫的不同龄期幼虫致死率柱形图。图3为不同温度下长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)在大蜡螟体内繁殖数量柱形图。具体实施方式下面将对本发明具体实施方式进行详细描述，但本发明保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)对梨小食心虫的室内防治效果试验(一)、供试材料1、供试线虫：供试线虫为本发明人从辽宁省本溪市土壤中采集、分离、鉴定并扩繁的斯氏线虫属的一个新种steinernemachangbaiense，记载于马娟等(maj等。russianjournalofnematology,2012,20(2):97-112.)发表的文献中。发明人将其中文分类命名为：长白斯氏线虫，将该线虫命名为：lbx66。该线虫保存于本申请人实验室中。本申请人承诺自申请日起二十年内向公众提供该线虫。2、供试昆虫：梨小食心虫(采集于河北省保定市桃园)。(二)、试验方法：1、长白斯氏线虫(steinernemachangbaiense)悬浮液的制备按照如下方法进行：(1)在24孔板的每孔中加入灭菌沙土2g，然后每孔加入长白斯氏线虫悬浮液200μl(含100条长白斯氏线虫)，放入1头5龄大蜡螟幼虫；用保鲜膜密封，置于25℃培养箱中培养。(2)将被线虫侵染死亡后的大蜡螟置于收集盘内；约12天后长白斯氏线虫的侵染期幼虫游到收集盘中的水中。(3)收集侵染期幼虫，清洗后，用无菌水配制成线虫悬浮液。2、试验方法用无菌水调整上述步骤1中制备的长白斯氏线虫悬浮液的浓度，将线虫悬浮液0.5ml均匀洒在垫有双层滤纸的培养皿(直径70mm)内，其使用浓度分别为0.3、0.5、1、2、3、4ijs/cm2，对照组为等量无菌水。每皿放入10头梨小食心虫末龄幼虫，并加入2块0.5cm3饲料作为食物，用封口膜封口。每处理重复4次。在25℃恒温培养箱中培养3d，检查梨小食心虫死亡情况，将死亡的昆虫挑破，显微镜下查看昆虫体内线虫侵入情况，计算梨小食心虫的死亡率和校正死亡率。校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照死亡率)×100％。结果(见图1)长白斯氏线虫(s.changbaiense)对梨小食心虫末龄幼虫致死效果随着浓度增加而增加，当使用浓度为2ijs/cm2时，长白斯氏线虫对梨小食心虫末龄幼虫致死率达93％，防治效果极为显著，说明长白斯氏线虫(s.changbaiense)对梨小食心虫具有很好的生防潜力。但当线虫使用浓度高于2ijs/cm2后，线虫致死率提高不显著，说明长白斯氏线虫(s.changbaiense)lbx66最适使用浓度应当≧2ijs/cm2。实施例2、长白斯氏线虫(s.changbaiense)对梨小食心虫不同龄期幼虫的防效试验(一)供试材料1、供试昆虫：梨小食心虫的不同龄期幼虫(来源同实施例1)。2、供试线虫：实施例1制备的长白斯氏线虫(s.changbaiense)悬浮液。(二)试验方法将梨小食心虫的2龄、3龄和末龄幼虫分别放置于培养皿内，将实施例1制备的长白斯氏线虫浓度稀释至1ijs/cm2，并添加于培养皿中，以无菌水作为对照，在25℃恒温培养箱中培养3d，然后检查梨小食心虫死亡情况。结果(见图2)长白斯氏线虫(s.changbaiense)lbx66对梨小食心虫的不同龄期幼虫的致死率都在75％以上，即对不同龄期幼虫都具有突出的防治效果，且对不同龄期幼虫的致死率相差不大，说明在梨小食心虫幼虫不同龄期均可以用长白斯氏线虫进行防治。实施例3、长白斯氏线虫(s.changbaiense)对梨小食心虫蛹防效试验(一)试验材料1、供试昆虫：梨小食心虫蛹(来源同实施例1)。2、供试线虫：将实施例1制备的长白斯氏线虫(s.changbaiense)幼虫悬浮液用无菌水稀释，获得不同浓度的长白斯氏线虫悬浮液。(二)试验方法：在玻璃瓶内(直径7cm，高度10cm)放入灭菌沙土20g，将梨小食心虫蛹分别放置于沙内，再将制备的长白斯氏线虫悬浮液2ml施于沙土上，线虫使用浓度分别为2、20、50ijs/cm2，以无菌水作为对照，每处理重复4次。在25℃下培养5d，检查梨小食心虫死亡情况。结果(见表1)当长白斯氏线虫s.changbaienselbx66浓度较低时，对梨小的蛹致死率不高，但当线虫使用浓度为50ijs/cm2时，梨小食心虫蛹死亡率达67％。由此可见，果园内用长白斯氏线虫(s.changbaiense)对梨小食心虫进行防治时，最好在梨小食心虫化蛹之前施用。如果用于防治蛹期的梨小食心虫，应当提高线虫的使用浓度至50ijs/cm2以上。表1长白斯氏线虫对梨小食心虫蛹的致死率试验结果线虫浓度(ijs/cm2)22050梨小食心虫死亡率(％)52267实施例4长白斯氏线虫(s.changbaiense)繁殖温度筛选试验(一)、供试材料1、供试昆虫：大蜡螟末龄幼虫2、供试线虫：用无菌水稀释实施例1制备的长白斯氏线虫(s.changbaiense)侵染期幼虫悬浮液至浓度为500ijs/ml。(二)、试验方法在24孔板内放置灭菌沙土2g，然后加入长白斯氏线虫水悬液200μl(含100头线虫)，再在每孔放置1头大蜡螟末龄幼虫，在25℃恒温培养箱中培养。大蜡螟受线虫侵染死亡12天后，统计每克虫尸繁殖的侵染期线虫数量。结果(见图3)长白斯氏线虫(s.changbaiense)在19℃时繁殖数量显著低于22℃、25℃和28℃，而在温度为22℃、25℃和28℃时繁殖数量差别不大，以25℃最佳。说明繁殖和田间应用长白斯氏线虫(s.changbaiense)防治梨小食心虫时，温度为22℃～28℃繁殖或防治效果更好。当前第1页12