一种细胞保存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞保存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.随着现代医学科学的迅速发展，细胞培养在各大疾病治疗和科研领域中应用已日趋广泛，各种细胞已经广泛应用于临床。这就对细胞保存的要求也随之增高。目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。只有通过正确的细胞保存方法才能确保不改变细胞特有的形态特征和细胞活性及增殖能力，也能排除某些实验中细胞不稳定的因素，提高细胞相关实验的稳定性和可重复性。
4.近年来，干细胞的研究进展迅速，干细胞的功用正日益受到生命科学的重视，已经显示出其在生命科学多个领域的广泛应用前景。干细胞疗法也日益广泛的应用于临床治疗，便应运而生了一种新的医学治疗技术，即干细胞技术。目前干细胞技术已在心血管系统疾病、神经系统疾病、肌肉骨骼相关疾病、糖尿病等多种疾病的治疗中取得了令人振奋的效果，展示了广阔的临床应用前景。然而，干细胞不同于普通的生物制品和药品，它是具有生命活性的生命最基本单位，在干细胞的广泛应用过程中，干细胞活性的保存、运输和冻存等是一个重要的挑战因素。
5.目前的研究表明，干细胞可以用一种冻存液在
‑
80℃中较长期保存，复苏后仍保持其良好的活性状态、干细胞特征及功能。但是，细胞保存液的组成，尤其是各个组分的比例至关重要，尤其是适用于直接临床应用的冻存液更需要一种更加安全和有效的细胞冻存液。例如自体外周血造血干细胞移植现已成为治疗恶性血液病、恶性淋巴瘤、实体瘤等疾病根治性方法之一。自体外周血干细胞移植的方法是先用造血干细胞动员剂将造血干细胞动员入外周血中，然后用血细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞组分。由于是自体外周血干细胞移植，患者在动员和分离采集自体外周血干细胞后，需经过1周甚至更长时间的放、化疗等预处理。在这段时间内，为了保持造血干细胞的活性及造血和免疫重建功能，采集的细胞必须冷冻保存。所以干细胞的冷冻保存技术是移植成功的关键环节之一。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种细胞保存液及其制备方法和应用。本发明细胞保存液的主要成分二甲基亚砜(dmso)进行了浓度限值，既能够用于保护细胞又减少dmso细胞毒性。同时优化筛选得到人血白蛋白、右旋糖酐40(dex)、羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)等有效成分，经试验证明，本发明细胞保存液是一种新的安全方便、活性保存良好的干细胞的保存液，其更能接近细胞的体内生存微环境。
7.具体的，本发明涉及以下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供一种细胞保存液，所述保存液其组成成分包括人血白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐40(dex)、羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)和生理盐水。
9.本发明的第二个方面，提供上述细胞保存液的制备方法，所述制备方法包括：将上述各组分混合即得。
10.本发明的第三个方面，提供上述细胞保存液在体外细胞保存中的应用。
11.本发明的第四个方面，提供一种细胞的保存方法，所述保存方法包括采用上述细胞保存液进行保存。
12.本发明的第五个方面，提供一种用于体外分析检测细胞的试剂盒，其包括有上述细胞保存液。
13.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
14.上述技术方案中人血白蛋白、右旋糖酐为细胞提供所需的营养成分，从而提高细胞的存活率，二甲基亚砜和右旋糖酐结合对细胞起保护作用，从而避免细胞损伤。
15.经试验证明，上述制备得到的细胞保存液其更能接近细胞的体内生存微环境，对细胞保护效果好，复苏后细胞可保持高活性和繁殖能力，不影响细胞活性，为体外分析检测提供的方便，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
16.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
17.图1为本发明实施例中hl60细胞冻存复苏后活性率(％)示意图；
18.图2为本发明实施例中外周血单个核细胞细胞活性率(％)示意图；
19.图3为本发明实施例中hl60细胞增殖示意图；
20.图4为本发明实施例中外周血单个核细胞细胞增殖示意图。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
23.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
24.本发明的一个具体实施方式中，提供一种细胞保存液，所述保存液其组成成分包
括人血白蛋白、二甲基亚砜、右旋糖酐40(dex)、羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)和生理盐水。所述细胞保存液为细胞冻存液。
25.本发明的又一具体实施方式中，所述生理盐水为0.9％注射用生理盐水。
26.本发明的又一具体实施方式中，所述细胞保存液中由如下浓度(体积百分比)的各成分组成：
27.10
‑
20％人血白蛋白，10
‑
20％二甲基亚砜，10
‑
20％右旋糖酐40(dex)，8
‑
12％羟乙基淀粉代血浆，1
‑
5％复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)，溶剂为0.9％注射用生理盐水。
28.本发明的又一具体实施方式中，所述细胞保存液中由如下浓度(体积百分比)的各成分组成：
29.16％人血白蛋白，16％二甲基亚砜，16％右旋糖酐40(dex)，10％羟乙基淀粉代血浆，4％复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)，溶剂为0.9％注射用生理盐水。
30.本发明的又一具体实施方式中，提供上述细胞保存液的制备方法，所述制备方法包括：将上述各组分混合即得。
31.本发明的又一具体实施方式中，提供上述细胞保存液在体外细胞保存中的应用。
32.本发明的又一具体实施方式中，所述细胞包括干细胞(如造血干细胞)、单核细胞(如外周血或骨髓的单个核细胞)。
33.本发明的又一具体实施方式中，提供一种细胞的保存方法，所述保存方法包括采用上述细胞保存液进行保存。
34.本发明的又一具体实施方式中，所述保存方法为：将待保存细胞与细胞保存液混匀，冷冻保存。
35.所述待保存细胞与细胞保存液的体积比为1：0.5～5，优选为1：1。
36.本发明的又一具体实施方式中，所述冷冻条件具体为：在
‑
80℃冷冻保存。经试验证明，本发明细胞保存液对细胞保护效果好，低温冻存6个月后，复苏细胞可保持高活性和增殖能力，而不影响细胞活性。
37.本发明的又一具体实施方式中，所述细胞包括干细胞(如造血干细胞)、单核细胞(如外周血或骨髓的单个核细胞)。
38.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于体外分析检测细胞的试剂盒，其包括有上述细胞保存液。
39.本发明的又一具体实施方式中，所述细胞包括干细胞(如造血干细胞)、单核细胞(如外周血或骨髓的单个核细胞)。
40.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中使用的细胞保存液由如下浓度(体积百分比)的各成分组成：16％人血白蛋白，16％二甲基亚砜，16％右旋糖酐40(dex)，10％羟乙基淀粉代血浆，4％复发氨基酸注射液(18aa
‑
iv)，溶剂为0.9％注射用生理盐水。
41.实施例
42.血细胞分离机采集急性髓系白血病患者外周血干细胞悬液100ml，白细胞浓度为238.26
×
109/l。采集袋置于超净台。根据干细胞悬液占冻存体系终体积的50％，算出冻存液终体积为l00ml+100ml＝200ml。混合液200ml注入医用干细胞冻存袋中，冻存袋中充分混
匀。最后把干细胞混合液，分装入干细胞冻存袋，l00ml/袋，共4袋。排净空气，封口并在冻存袋的进液管处留取4段细胞，标签注明采集及冻存时间、患者及冻存者姓名、冻存量、冻存细胞浓度。硬纸板固定冻存袋使之平整，放入
‑
80℃冰箱内冻存。
43.细胞培养与传代：液氮瓶中将hl
‑
60细胞取出，放入37℃恒温水浴锅中迅速融化。融化好的细胞加入到三支离心管中(三支离心管中提前加入4～5ml细胞培养液)，以800转/分钟的速度离心3分钟。弃上清，再一次每支离心管加入4～5ml细胞培养液，用吸管将细胞沉淀吹打均匀后，分别将三种细胞转移至细胞培养瓶或者细胞培养皿，放于37℃、5％co2温箱里培养。提前四十分钟打开紫外线灯照射超净工作台。进入细胞房之前戴好口罩帽子，打开部分超净工作台玻璃窗，开排风扇和照明灯，自检三分钟。新洁尔灭擦拭工作台，进出超净工作台的物品，包括双手，每次均要消毒。一般操作都在通风口处进行。悬浮细胞换液时，先将培养瓶中的旧培养液用移液管转移至离心管中，以800转/分钟的速度离心3分钟。弃上清，用移液管加入新的培养液，轻轻吹打，使细胞分布均匀。用移液管把离心管内的带有细胞的培养液移至培养瓶内，放于37℃、5％co2温箱里培养。如果细胞足够多，可以进行细胞传代，将原有含细胞的培养液平均分配到两个或者三个培养瓶内，补充适量的培养液即可，至对数生长期备用。
44.小鼠外周血淋巴细胞分离液实验方法：选择3只balb/c小鼠，采血时选择医用真空采血管获得抗凝血6ml，按体积比1:1的比例与样本稀释液混匀，取一支适当的离心管，先加入与稀释后样本等量的分离液。将经稀释后的血液样本小心加于ficoll分离液之液面上，550
‑
650g(大离心力可至1000g)，离心20
‑
30min。吸取单个核细胞层，pbs洗涤2次，调整细胞数为2
×
106/ml，备用。
45.1、细胞保存：实验前准备：超净台紫外照射30min，配好细胞保存液a，放入4℃预冷。取前一日半量或全量换液的对数生长期hl60细胞，或上述方法分离的小鼠外周血单个核细胞，装入离心管，800rpm 3min离心。结束后弃上清，加入配好的细胞冻存液a，吹打混匀，混匀后吸至冻存管，用封口膜封好，再用胶布贴好标记时间。按照4℃30min、
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20℃60min程序保存后，分别放置
‑
80℃1周、1个月、3个月和6个月，均为三复管。
46.2、细胞复苏与活性测定：将
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80℃冻存不同时间的实验组细胞保存袋取出，快速放置于40℃的温水中，振动快速融化，吸取细胞悬液，加入10倍的细胞培养液中，低速离心，尽快洗去保存液，再悬浮于新鲜细胞培养液中，采用常规台盼蓝染色法，测定细胞活性。
47.3、cck8测定细胞增殖能力：取上述方法复苏的冻存细胞悬液，混匀后每孔加入100μl含细胞的培养液，每组设3个复孔，且每板设立1个只加入相等体积(100μl)1640培养液的调零孔，再置于37℃，5％co2饱和湿度的条件下培养，分别于培养24h时取出一块待测96孔板，每实验孔加入10μl的cck
‑
8液(避光)。于37℃条件下孵育2
‑
4小时后，用酶标仪测定各孔在450nm波长范围内的吸光度(a)值。试验结果见图1
‑
图4，对细胞保护效果好，复苏后细胞可保持高活性和繁殖能力，不影响细胞活性。
48.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。