一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法

1.本发明涉及农业栽培技术领域，更具体的说是涉及一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法。


背景技术：

2.苹果主要通过嫁接等无性方式进行繁殖，致使我国栽植的苹果普遍感染病毒，病毒一旦感染将终身携带，导致苹果产量低、品质差。
3.目前，我国苹果的栽培面积和产量稳居世界前列，但无毒化面积所占比例仍很少，难以取得高效益和占领国际市场。
4.因此，苹果无毒化栽培是大势所趋。现有的苹果田间苗脱毒及繁育技术流程比较繁琐，且存在周期长、工作量大等缺陷。
5.因此，建立一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法。具有操作简单、所需设备少、材料可循环利用、无毒苗木保存方式多样的特点。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法，包括以下步骤：
9.1)植物材料的前处理：收集1.8～2.2cm长的嫩梢，进行第一次继代扩繁，得苹果试管苗；
10.2)脱毒处理：选取长势良好的苹果试管苗，切取茎尖i插入含病毒唑的培养基中，常温25℃预培养10～13d，待愈伤组织出现后，进一步培养切取茎尖ii；
11.3)茎尖再生：将切取的茎尖ii初步培养后，待茎尖再生待植株长至0.6～0.8cm，除去最外层的愈伤组织，除去部分厚度为1.0～2.0mm，然后转入培养基中，第二次继代培养至完整再生植株；
12.4)完整再生植株的病毒检测：切取完整再生植株上部1.0～1.5cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第1轮病毒检测；检测无毒的植株培养20～25d后，进行第三次继代，将植株的上部1.0～1.5cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第2轮病毒检测；两轮检测均为阴性的植株即作为无毒的苹果试管苗；检测带毒的植株重新进行脱毒处理；
13.5)无毒苹果苗的繁育：将检测无毒的苹果试管苗进行扩繁，切取嫩稍，嫁接于无毒砧木，完成无病毒苹果苗木的繁育。
14.进一步的：除去最外层的愈伤组织所用工具为解剖刀。
15.有益效果在于：一般苹果田间苗脱毒处理时，收集的是叶芽或小于1.0cm的嫩稍，一般需要60～90d才能完成第一次继代。
16.常温25℃预培养10～13d，苹果试管苗基部的愈伤组织基本形成，这一过程相当等
于试管苗进行了一个抗病毒剂的前处理，这样不仅可以提高脱毒效率(可提高5％左右)，而且经过这一时期的生长，植株对高温的抵御能力有效增加，进而提高了植株热处理阶段的成活率(可提高10％左右)。
17.茎尖刚再生成植株后(约0.6～0.8cm)生长速度明显减慢，生长成达到检测要求的植株还再需60d左右，此时，在不破坏整体植株的情况下，用解剖刀片切除最外层的一层愈伤组织(约1.0～2.0mm)，可有效缩短生长成达到检测要求植株的时间，切除后生长30d便可达到检测要求。
18.一般地，再生植株继代2～3次，扩繁到一定数量后进行第一次病毒检测，这个时间需要约60d。现在不进行扩繁，对茎尖直接再生的植株进行检测，省去了后期的扩繁工作及对应的工作投入；
19.进一步的：每轮检测过程中，rna提取和反转录均为常规方法，pcr扩增时采用常规pcr和荧光定量pcr相结合的方式。
20.有益效果在于：两次病毒检测，每次检测利用两种检测方法，当pcr检测为阴性的样品，再利用荧光定量pcr进行验证。可有效保证病毒检测的准确性和稳定性。此外，检测带毒的植株继续进行脱毒处理，可使材料得到充分利用。
21.优选的：步骤1)中，嫩梢的来源为a或b，其中：
22.a：5月～11月，田间直接收集茎嫩稍；
23.b：12月～次年4月，选择叶芽饱满的枝条插入水盆中进行水培，促使枝条萌发，温度为26～28℃，萌发后收集嫩稍；
24.扩繁前需消毒，再接种到培养基中；
25.消毒：将嫩稍先用自来水冲洗，无菌环境下，75％酒精处理30s，千分之一的升汞处理14～16min，无菌蒸馏水清理2～3次；
26.扩繁：第一次继代时间为接种后20～30d，接种后40～50d完成扩繁。
27.有益效果在于：a或b方案两个方案结合，一年四季都能获得处理材料。
28.优选的：步骤2)中，茎尖i长度为0.8～1.2cm；
29.培养基中病毒唑的浓度为20～30μg/ml；
30.进一步培养：将试管苗移入光照培养箱中，24～26℃培养1～2d，27～29℃培养1～2d，30～32℃培养1～2d，33～35℃培养1～2d，35～37℃培养20～25d。茎尖ii长度为1.0～2.0mm。
31.优选的：步骤3)中，初步培养：暗培养7～10d，正常培养30～40d；
32.再培养的时间为25～30d。
33.优选的：步骤5)中，扩繁的时间为25～35d；
34.嫩稍的长度1.0～1.5cm；
35.嫁接采用劈接的方式；
36.无毒砧木为山定子，还包括嫁接后10～15d检测嫁接的成活情况。
37.优选的：培养基的成分包括：ms+0.2～0.4mg/l iba+0.8～1.0mg/l 6
‑
ba。
38.有益效果在于：一般地，苹果无毒试管苗需要生根移栽到田间，才能完成繁育，这一过程至少需要3个月的时间，然后再移栽到田间。将获得的无毒苹果试管苗直接嫁接到无毒砧木上，省去了生根移栽的时间及相应的成本消耗。
39.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法，取得的技术效果为：
40.利用苹果嫩稍进行组织培养，材料容易获取，全年均可取样，且由于取样的嫩梢较大，有效缩短了试管苗的形成时间，可节省40～60d；
41.脱毒处理过程中增加了预培养和逐渐升温的过程，有效提高了植物的耐热能力，降低了死亡率，可降低10％左右；
42.一般大小为1.0mm的苹果茎尖完全再生成植株(2.5～3.0cm)至少需要3个月的时间，本发明在再生成植株还比较小时先切除少量愈伤组织，可有效缩短植株的检测周期，缩短约30d，进而快速获得满足检测需求的植株；
43.省略了扩繁的环节，直接对茎尖再生的植株进行病毒检测，可有效减少大量扩繁而产生的工作量及成本，而且缩短了扩繁所需时间；仅需2.5个月；较现有常规操作节约一半时间；
44.进行两轮病毒检测，每轮检测采用两种pcr检测方法，有效的提高了检测的准确性，准确性可提高8～20％，对无病毒苹果苗木的认定具有重要意义；
45.检测带毒的植株还可以重新进行脱毒处理，缩短了植物前处理的时间，材料得到了充分利用；
46.将获得的无毒苹果试管苗直接嫁接到无毒砧木上，省去了生根移栽的时间及相应的成本消耗；
47.无病毒苹果植株以离体(试管苗)和活体(田间苗)两种形式保存，可充分满足不同的需求。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.本发明实施例公开了一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法。
50.实施例中，当pcr检测为阴性的试管苗样品，再利用荧光定量pcr进行验证。
51.每轮检测过程中，rna提取和反转录均为常规方法，pcr扩增时采用常规pcr和荧光定量pcr相结合的方式。
52.总rna的提取：取苹果试管苗样品50mg，采用吸附柱法(范旭东等，2014)进行总rna提取。
53.普通反转录：取上述总rna 3.0μl(约0.1g)、随机引物1.0μl、去离子水6.0μl于一离心管中，混匀后在72℃性10min，冰上3min。向上述溶液中依次加入：5
×
反转录buffer4.0μl、dntp mixture(10mmol/l)1.0μl、m
‑
mlv(200u/μl)0.5μl(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，用水补足总体系为20μl。混匀后，42℃水浴10min，37℃水浴1h，72℃3min，合成cdna放
‑
20℃保存备用。
54.荧光定量用反转录：采用去基因组dna反转录试剂盒primescript
tm rt reagent kit with gdna eraserperfect real time(takara)合成cdna。
55.常规pcr扩增：反应体系为25μl，含10
×
pcrbuffer(mg
2+
plus)2.5μl、dntp mixture(2.5mm each)0.5μl、10μmol/l正、反向引物各0.5μl(表1)、5u/μl0.125μl和cdna 2μl，用dh2o补足至25μl。扩增条件：94℃3min，94℃30s，55℃30～40s，72℃30～50s，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
56.表1常规pcr扩增所用的引物
[0057][0058]
备注：只要有一对引物扩增出条带，则该样品则携带该种病毒。
[0059]
荧光定量pcr扩增：利用tbpremix ex taq
tm
(tli rnaseh plus)试剂盒(takara)。反应体系为20μl，含tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)(2x)10.0μl、10μmol/l正、反向引物各0.5μl(表2)、dnase/rnase free dh2o 7μl和cdna 2μl。扩增条件：94℃预变性32min，94℃10s，58℃15s，72℃15s，40个循环，延伸结束时记录荧光信号。熔解曲线分析的温度范围是60～95℃，每5s增加0.5℃，以鉴别引物二聚体和非特异性扩增。
[0060]
表2荧光定量pcr扩增所用的引物
[0061][0062]
实施例1
[0063]
一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法，包括以下步骤：
[0064]
1)植物材料的前处理：收集1.8cm长的嫩梢，进行第一次继代扩繁，得苹果试管苗；
[0065]
2)脱毒处理：选取长势良好的苹果试管苗，切取茎尖i插入含病毒唑的培养基中，常温25℃预培养10d，待愈伤组织出现后，进一步培养切取茎尖ii；
[0066]
3)茎尖再生：将切取的茎尖ii初步培养后，待茎尖再生待植株长至0.6cm，除去最外层的愈伤组织，除去部分厚度为1.0mm，然后转入培养基中，第二次继代培养至完整再生植株；
[0067]
4)完整再生植株的病毒检测：切取完整再生植株上部1.0cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第1轮病毒检测；检测无毒的植株培养20d后，进行第三次继代，将植株的上部1.0cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第2轮病毒检测；两轮检测均为阴性的植株即作为无毒的苹果试管苗；检测带毒的植株重新进行脱毒处理；
[0068]
5)无毒苹果苗的繁育：将检测无毒的苹果试管苗进行扩繁，切取嫩稍，嫁接于无毒砧木，完成无病毒苹果苗木的繁育。
[0069]
为进一步优化技术方案：步骤1)中，嫩梢的来源为：
[0070]
5月～11月，田间直接收集茎嫩稍；
[0071]
扩繁前需消毒，再接种到培养基中；
[0072]
消毒：将嫩稍先用自来水冲洗，无菌环境下，75％酒精处理30s，千分之一的升汞处理14min，无菌蒸馏水清理2次；
[0073]
扩繁：第一次继代时间为接种后20d，接种后50d完成扩繁。
[0074]
为进一步优化技术方案：步骤2)中，茎尖i长度为0.8cm；
[0075]
培养基中病毒唑的浓度为20μg/ml；
[0076]
进一步培养：将试管苗移入光照培养箱中，24℃培养1d，27℃培养1d，30℃培养1d，33～35℃培养1d，35℃培养20d。茎尖ii长度为1.0mm。
[0077]
为进一步优化技术方案：步骤3)中，初步培养：暗培养7d，正常培养30d；
[0078]
再培养的时间为25d。
[0079]
为进一步优化技术方案：步骤5)中，扩繁的时间为25d；
[0080]
嫩稍的长度1.0cm；
[0081]
嫁接采用劈接的方式；
[0082]
无毒砧木为山定子，还包括嫁接后10d检测嫁接的成活情况。
[0083]
为进一步优化技术方案：培养基的成分包括：ms+0.2mg/l iba+0.8mg/l 6
‑
ba。
[0084]
实施例2
[0085]
一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法，包括以下步骤：
[0086]
1)植物材料的前处理：收集2cm长的嫩梢，进行第一次继代扩繁，得苹果试管苗；
[0087]
2)脱毒处理：选取长势良好的苹果试管苗，切取茎尖i插入含病毒唑的培养基中，常温25℃预培养12d，待愈伤组织出现后，进一步培养切取茎尖ii；
[0088]
3)茎尖再生：将切取的茎尖ii初步培养后，待茎尖再生待植株长至0.7cm，除去最外层的愈伤组织，除去部分厚度为1.5mm，然后转入培养基中，第二次继代培养至完整再生植株；
[0089]
4)完整再生植株的病毒检测：切取完整再生植株上部1.2cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第1轮病毒检测；检测无毒的植株培养22d后，进行第三次继代，将植株的上部1.3cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第2轮病毒检测；两轮检测均为阴性的植株即作为无毒的苹果试管苗；检测带毒的植株重新进行脱毒处理；
[0090]
5)无毒苹果苗的繁育：将检测无毒的苹果试管苗进行扩繁，切取嫩稍，嫁接于无毒
砧木，完成无病毒苹果苗木的繁育。
[0091]
为进一步优化技术方案：步骤1)中，嫩梢的来源为：
[0092]
12月～次年4月，选择叶芽饱满的枝条插入水盆中进行水培，促使枝条萌发，温度为26～28℃，萌发后收集嫩稍；
[0093]
扩繁前需消毒，再接种到培养基中；
[0094]
消毒：将嫩稍先用自来水冲洗，无菌环境下，75％酒精处理30s，千分之一的升汞处理15min，无菌蒸馏水清理3次；
[0095]
扩繁：第一次继代时间为接种后25d，接种后45d完成扩繁。
[0096]
为进一步优化技术方案：步骤2)中，茎尖i长度为1.0cm；
[0097]
培养基中病毒唑的浓度为25μg/ml；
[0098]
进一步培养：将试管苗移入光照培养箱中，25℃培养2d，28℃培养1d，31℃培养1d，34℃培养2d，36℃培养24d。茎尖ii长度为1.8mm。
[0099]
为进一步优化技术方案：步骤3)中，初步培养：暗培养8d，正常培养36d；
[0100]
再培养的时间为27d。
[0101]
为进一步优化技术方案：步骤5)中，扩繁的时间为30d；
[0102]
嫩稍的长度1.3cm；
[0103]
嫁接采用劈接的方式；
[0104]
无毒砧木为山定子，还包括嫁接后13d检测嫁接的成活情况。
[0105]
为进一步优化技术方案：培养基的成分包括：ms+0.3mg/l iba+0.9mg/l 6
‑
ba。
[0106]
实施例3
[0107]
一种简化的苹果田间苗脱毒及繁育方法，包括以下步骤：
[0108]
1)植物材料的前处理：收集2.2cm长的嫩梢，进行第一次继代扩繁，得苹果试管苗；
[0109]
2)脱毒处理：选取长势良好的苹果试管苗，切取茎尖i插入含病毒唑的培养基中，常温25℃预培养13d，待愈伤组织出现后，进一步培养切取茎尖ii；
[0110]
3)茎尖再生：将切取的茎尖ii初步培养后，待茎尖再生待植株长至0.8cm，除去最外层的愈伤组织，除去部分厚度为2.0mm，然后转入培养基中，第二次继代培养至完整再生植株；
[0111]
4)完整再生植株的病毒检测：切取完整再生植株上部1.5cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第1轮病毒检测；检测无毒的植株培养25d后，进行第三次继代，将植株的上部1.5cm移入培养基中，切下的剩余部分进行第2轮病毒检测；两轮检测均为阴性的植株即作为无毒的苹果试管苗；检测带毒的植株重新进行脱毒处理；
[0112]
5)无毒苹果苗的繁育：将检测无毒的苹果试管苗进行扩繁，切取嫩稍，嫁接于无毒砧木，完成无病毒苹果苗木的繁育。
[0113]
为进一步优化技术方案：步骤1)中，嫩梢的来源为：
[0114]
5月～11月，田间直接收集茎嫩稍；
[0115]
扩繁前需消毒，再接种到培养基中；
[0116]
消毒：将嫩稍先用自来水冲洗，无菌环境下，75％酒精处理30s，千分之一的升汞处理16min，无菌蒸馏水清理2次；
[0117]
扩繁：第一次继代时间为接种后30d，接种后50d完成扩繁。
[0118]
为进一步优化技术方案：步骤2)中，茎尖i长度为1.2cm；
[0119]
培养基中病毒唑的浓度为30μg/ml；
[0120]
进一步培养：将试管苗移入光照培养箱中，26℃培养2d，29℃培养2d，32℃培养2d，35℃培养2d，37℃培养25d。茎尖ii长度为2.0mm。
[0121]
为进一步优化技术方案：步骤3)中，初步培养：暗培养10d，正常培养40d；
[0122]
再培养的时间为30d。
[0123]
为进一步优化技术方案：步骤5)中，扩繁的时间为35d；
[0124]
嫩稍的长度1.5cm；
[0125]
嫁接采用劈接的方式；
[0126]
无毒砧木为山定子，还包括嫁接后15d检测嫁接的成活情况。
[0127]
为进一步优化技术方案：培养基的成分包括：ms+0.4mg/l iba+1.0mg/l 6
‑
ba。
[0128]
对比试验
[0129]
对比例1：区别在于植物材料的前处理，收集叶芽或小于1.0cm的苹果嫩稍，进行组织培养。60～90d完成第一次继代，40～50d完成试管苗的扩繁。
[0130]
对比例2：区别在于脱毒处理，将待脱毒苹果试管苗移入含抗病毒剂的培养基中，常温25℃预培养1d，然后将试管苗移入光照培养箱中高温处理，然后切取茎尖进行再生。
[0131]
对比例3：区别在于茎尖再生，切取的茎尖正常培养90d左右，再生成完整植株，然后转入新的培养基中进行扩繁。
[0132]
对比例4：区别在于再生植株的病毒检测，再生植株继代2～3次(约60d)，每个茎尖再生的植株扩繁到2瓶(每瓶约4株)以上时，用整株样品进行第一次病毒检测。第一次继代检测无毒的植株培养20～25d后进行第二轮病毒检测。每轮检测过程中，rna提取和反转录的方法同上，pcr扩增时采用常规pcr检测，且每种病毒只进行1个pcr扩增。
[0133]
对比例5：区别在于无毒苹果苗的繁育：将检测无毒的苹果试管苗进行扩繁，约25～30d，然后选择长势一致的植株进行生根，约25～30d；生根完成后将试管苗转移到温室，打开瓶盖进行炼苗，约7～10d，然后将带根苗移栽到含有蛭石和草炭等的营养基质中，注意温度和湿度的控制，30～40d后统计植株的成活情况；成活的植株移栽到田间。
[0134]
结果表明，相较于实施例1～3，对比例1继代所需时间延长；对比例2植株热处理阶段的成活率偏低；对比例3生长成达到检测要求植株的时间延长；对比例4无法保证病毒检测的准确性和稳定性；对比例5生根移栽的时间长，且成本高。
[0135]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0136]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。