本发明涉及麻花秦艽种植领域，尤其涉及一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法。
背景技术：
麻花秦艽为龙胆科，龙胆属多年生草本植物,别名大叶秦艽、麻花艽，藏医称“解吉嘎保”，因主根下部多分枝或多数相互分离后又连合，略成网状或麻花状，故习称麻花艽。麻花秦艽作为常用中药，在藏药和蒙药中也是常用药，是构成青藏高原生态的重点种群，也是国家三级重点保护植物。由于近年来临床使用的增加和多年的过度采挖，造成了目前麻花秦艽野生资源的匮乏现状。
大面积的引种栽培已成为目前保护该野生药用资源的一项可持续发展的措施。在生产中，麻花秦艽经常因干旱和盐碱胁迫，致使发芽率和幼苗成活率较低，即，高海拔地区，干旱和盐碱所组成的双重胁迫对麻花秦艽的正常生长具有巨大影响。
遂，需建立麻花秦艽种子和幼苗在双重胁迫下的技术体系，以期从根本上解决麻花秦艽在生产实际中遇到的干旱、盐碱胁迫问题，此外，为其它药用植物种子在干旱胁迫和盐碱胁迫下的萌发及幼苗期的干旱胁迫和盐碱胁迫的生长开辟了一条新途径。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法，以解决上述技术问题。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法，其特征在于：包括如下测试项目：
1)设置胁迫浓度，采用nacl+na2co3和peg-6000模拟不同的胁迫条件；
2)检测在不同胁迫条件的培养中，麻花秦艽于种子萌发期、幼苗期的生理指标；
3)将不同胁迫条件的培养下麻花秦艽幼苗，移栽至大田内，检测相关生理指标；
所述种子萌发期的测定内容包括发芽率、发芽势和发芽指数；
所述幼苗期的测定内容包括出苗率、出苗指数、活力指数和发芽势；
所述大田试验苗期的测定内容包括叶绿素含量检测、丙二醛含量检测、过氧化酶活性检测、植株株高、根系长度、叶片数量和植株生物量。
优选的，所述胁迫浓度的浓度如下：
1)设peg-6000浓度为2％、4％、6％、8％、10％、12％；
2)盐碱胁迫浓度为10+10、15+15、25+25、75+35、100+45、150+55mmol/l；
3)peg-6000浓度组别与盐碱胁迫浓度组合为37个处理组，其中包括以蒸馏水为对照的对照组。
优选的，所述麻花秦艽中于不同胁迫条件的培养步骤如下：
1)选取籽粒饱满、大小一致的麻花秦艽种子，用蒸馏水清洗后置于烧杯中用蒸馏水浸泡24h待用，用浓度0.1％hgcl2消毒5min，蒸馏水清洗3～5次，然后用浓度75％酒精消毒30s，最后用蒸馏水清洗，用无菌滤纸吸去多余水分后，挑选已吸胀饱满的种子摆放到双层无菌滤纸上、一层纱布的培养皿中，每皿50粒；
2)分别加入配置的36个浓度处理液和蒸馏水各10ml，每个处理重复3次，然后将培养皿放入人工气候箱中培养，每2d更换培养皿；
3)逐日统计种子发芽数，以胚根长＞1mm为标准，持续统计8d，以第6d种子萌发率作为最终种子萌发率，依次计算种子发芽率、发芽势、发芽指数，第8d后测定幼苗茎长、根长、鲜重以及相关生理指标。
优选的，所述种子萌发期中测量公式包括：
发芽率(g)＝萌发种子数/受试种子数×100％；
发芽势(ge)＝n3/n×100％，其中n3为第3天的种子萌发数，n为供试种子数；
发芽指数(gi)＝σ(gt/dt)，其中gt为第t天种子萌发数，dt为相应出苗天数。
优选的，所述幼苗期中测量公式包括：
出苗率(er)＝正常出苗粒数/供试种子总数×100％；
出苗率(er)＝正常出苗粒数/供试种子总数×100％；
出苗指数(ei)＝σ(gt/dt)，其中gt为第t天种子萌发数，dt为相应出苗天数；
活力指数(vi)＝种苗长度×出苗指数；
发芽势(ep)＝出苗高峰期种子出苗数/供试种子总数×100％。
优选的，所述大田试验苗期中关于叶绿素含量检测步骤如下：
1)将丙酮、无水乙醇按体积1:1比例配成混合浸提液；
2)将麻花秦艽叶片洗净、吸干、去大叶脉，称取0.1000g，剪成细丝置于研钵，加入丙酮乙醇混合液及适当的石英砂和碳酸钙研磨匀浆过滤；
3)滤液用80％丙酮定容至10ml，将浸提液移至加塞试管中于室温条件下浸提48小时，每隔8小时上下轻摇试管；
4)将浸提液稀释1000倍后叶绿素溶液在波长663nm和645nm处的光密度；
5)通过公式检测叶绿色含量，公式如下：
a663＝82.04ca+9.27cb
a645＝16.75ca+45.60cb
ca＝12.7a663-2.69a645
cb＝22.9a645-4.68a663
ca+b＝20.2a645+8.02a663
式中，ca、cb分别为叶绿素a和叶绿素b的浓度，ca+b表示总浓度，单位mg·l-1；
叶绿素含量(mg·l-1或mg·dm-2)＝(c×v)×1000/a，其中a为取样鲜重(g)，1000为稀释倍数。
优选的，所述大田试验苗期中关于丙二醛含量的检测步骤如下：
1)丙二醛的提取：称2.0000g麻花秦艽叶片于研钵，加入10％三氯乙酸(tca)2ml及少量石英砂进行研磨，加入8mltca充分研磨后将匀浆转入试管中，接着把匀浆液以4000r/min离心10min，其上清液即为丙二醛提取液；
2)丙二醛显色反应及测定：取2ml丙二醛提取液，对照组取2ml蒸馏水，再加2ml0.6％tba溶液混匀，在试管上加棉塞，置于沸水中加热15min，迅速从水浴锅中拿出冷却，以4000r/min离心15min，于波长532nm和450nm下测定吸光值；
3)丙二醛浓度(μmol/l)＝6.45od532-0.56od450，其中od450、od532分别代表450nm和532nm下的吸光值。
优选的，所述大田试验苗期中关于过氧化酶活性的检测内容如下：
1)用愈创木酚法，以每分钟内a470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位；
2)超氧化物歧化酶活性用氮蓝四唑法测定，以抑制nbt光还原的50％为1个酶活性单位；
3)可溶蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法测定；
4)可溶性糖含量采用苯酚法测定。
本发明的有益效果是：
1、本发明系统梳理麻花秦艽栽培技术中双重胁迫技术环节，突破麻花秦艽在生产实际中耐旱、耐盐碱的技术瓶颈与不足，探寻麻花秦艽种子及幼苗在双重胁迫下的生理特点和机制，为麻花秦艽萌发期和幼苗期的抗旱性和抗盐碱性机理的研究和规范化栽培提供理论依据，为麻花秦艽规模化种植及开发利用提供技术保证，从而提高麻花秦艽的产量和质量。
2、本发明首次对麻花秦艽双重胁迫下进行实验并与大田实验相对比，实现理论技术的应用转化，保证实验数据的真实性、可靠性和普遍性。
具体实施方式
基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明的具体实施例。
实施例1
采用nacl+na2co3和peg-6000模拟不同的胁迫条件，本次实验对照组为蒸馏水，设peg-6000浓度为2％、4％、6％、8％、10％、12％，盐碱胁迫浓度为10+10、15+15、25+25、75+35、100+45、150+55mmol/l，共37个处理组，每个处理3个重复，双重胁迫实验设计见表1。
表一
实施例2
一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法，包括n1pi的组合，将盐碱胁迫浓度5+10mmol/l，以及peg-6000浓度为2％的组合10ml溶液，置于培养皿内，然后将培养皿放入人工气候箱中培养(相对湿度60％，16h/d，25℃)，每2d更换培养皿。逐日统计种子发芽数，以胚根长＞1mm为标准，持续统计8d。以第6d种子萌发率作为最终种子萌发率，依次计算种子发芽率、发芽势、发芽指数，第8d后测定幼苗茎长、根长、鲜重以及相关生理指标。
实施例3
一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法，包括n3p4的组合，将盐碱胁迫浓度25+25mmol/l，以及peg-6000浓度为8％的组合10ml溶液，置于培养皿内，然后将培养皿放入人工气候箱中培养(相对湿度60％，16h/d，25℃)，每2d更换培养皿。逐日统计种子发芽数，以胚根长＞1mm为标准，持续统计8d。以第6d种子萌发率作为最终种子萌发率，依次计算种子发芽率、发芽势、发芽指数，第8d后测定幼苗茎长、根长、鲜重以及相关生理指标。
实施例4
一种双重胁迫对麻花秦艽生长生理特性影响的测试方法，包括n6p6的组合，将盐碱胁迫浓度150+55mmol/l，以及peg-6000浓度为12％的组合10ml溶液，置于培养皿内，然后将培养皿放入人工气候箱中培养(相对湿度60％，16h/d，25℃)，每2d更换培养皿。逐日统计种子发芽数，以胚根长＞1mm为标准，持续统计8d。以第6d种子萌发率作为最终种子萌发率，依次计算种子发芽率、发芽势、发芽指数，第8d后测定幼苗茎长、根长、鲜重以及相关生理指标。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。