D-松醇在促进三七生长及诱导抗性中的应用

本发明涉及三七种植技术领域，具体而言，本发明涉及d-松醇在促进三七生长及诱导抗性中的应用。

背景技术：

三七(panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen)，别名田七、滇七、参三七、汉三七等，为多年生草本伞形目五加科人参属植物，具有止血散瘀、定痛消肿等良好功效，主要以块茎和花入药(国家药典委员会，2015；《全国中草药汇编(第三版)》，2014)。三七的药理成分复杂，具有止血、活血抗栓、抗炎、保肝护肝、保护心肌以及抗肿瘤的作用。

三七作为我国名贵中药材，其人工栽培历史已近400年。随着人们对三七需求的逐步提升，其种植规模也不断扩大。例如，云南省是我国三七的主要产区，每年三七的产量超过5万吨，产值接近千亿元，是云南省重大的经济支撑。但是，现代三七的农田生产模式主要是以照搬农作物的高产栽培模式为主，为了追求产量，大量的施用化肥和农药，甚至盲目的使用膨大剂。这种农田高产栽培模式并不符合三七的生长规律，大规模应用导致整个三七产业出现了品质低、农药重金属残留超标等重大难题，并且存在严重的连作障碍导致产业危机。

连作障碍(replantproblems)是指同一物种连续种植在同一土地上，出现的长势变弱、品质降低或者植株死亡等现象(张重义、林文雄，药用植物的化感自毒作用与连作障碍[j].中国生态农业学报，2009,17(01):189-196)。绝大部分以根和根茎类入药的药用植物在栽培时都存在着连作障碍的问题，其中以地黄、人参、三七、当归、黄连等的连作障碍问题最为严重。而三七受到连作障碍的威胁尤为突出，其田间现象多表现为：1)种子种苗萌发率大幅降低；2)三七植株长势弱品质低；3)根腐病发生严重，甚至整园绝收；4)轮作间隔年限长，种植过三七的土地需要10～30年的轮作，才能够重新种植三七(孙雪婷、李磊、龙光强等，三七连作障碍研究进展[j].生态学杂志，2015,34(03):885-893；孙萌、叶丽琴、张子龙，三七连作障碍成因及其控制研究进展[j].山地农业生物学报，2015,34(03):63-67)。

研究表明，引起三七连作障碍的原因主要有：1)土壤理化性质的恶化；2)三七病原菌的积累；3)植物根系分泌自毒物质，影响自身和后代的生存(zhus,fenl,guoc,etal.negativeplantsoilfeedbackdrivenbyreassemblageoftherhizospheremicrobiomewiththegrowthofpanaxnotoginseng[j].frontiersinmicrobiology,2019,10:1597；官会林、陈昱君、刘士清等，三七种植土壤微生物类群动态与根腐病的关系[j].西南农业大学学报(自然科学版)，2006,(05):706-709；weiw,yangm,liuy,etal.fertilizernapplicationrateimpactsplantsoilfeedbackinasanqiproductionsystem[j].scienceofthetotalenvironment,2018,633:796-807；yangm,zhangx,xuy,etal.autotoxicginsenosidesintherhizospherecontributetothereplantfailureofpanaxnotoginseng[j].plosone,2015a,10(2):e0118555)。

此外，植物病害也是影响农产品效益的重要因素之一。三七的典型病害包括黑斑病、根腐病、锈腐病等。长期以来，植物病害的防治主要依赖抗病品种的选育和化学农药的使用，且现如今社会对环境保护和生态安全问题的日益关注，限制和减少化学合成农药(肥料)被认为非常有必要。长期大量地施用化学合成肥料和农药已导致农业生态环境破坏、肥效药效降低及食品安全等诸多问题。因此，寻求一种三七增产和植物保护的新技术、新方法成为亟待解决的重要问题。

松针覆盖是三七种植的模式之一，本发明人在研究松针有效成分的过程中，首次发现了d-松醇在促进三七生长及诱导抗性中的作用，进而提出了本发明。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种d-松醇在促进三七生长及诱导抗性中的应用。

d-松醇(d-pinitol)是d-手性肌醇甲基化的一种衍生物，分子式为c7h14o6，其结构式为：

d-松醇为白色颗粒状的结晶，易溶于水，无臭味，味微甜，难溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、乙醚、丙酮等有机溶剂。d-松醇具有广泛的植物来源，最先在松科植物中被发现，松醇的名字也由此而来，之后在豆科类植物中也发现了d-松醇的存在，且其含量相当丰富，这大大扩大了d-松醇的植物来源。此外，d-松醇还广泛存在于叶子花属植物、紫花苜蓿及许多植物的花和叶中，在一些植物的汁液中也发现了该成分。近年来d-松醇成为人们研究的热点，其越来越多的功能活性也不断被发现并研究，目前报道较多的主要集中在d-松醇的降血糖、抗肿瘤、免疫调节作用以及其他活性，同时也是一类植物源杀菌剂，能够对植物病害起到治疗作用。

本发明的一个目的，在于提供d-松醇在促进三七生长中的应用。

在一个优选的实施方案中，本发明提供d-松醇在促进三七种子萌发和三七生长中的应用。

三七的种子属于典型的顽拗性种子，也就是在成熟发育期间不发生脱水，脱落时含水量较高，贮藏时不耐脱水的种子，并且还具有休眠特性，通常需要层积处理60d左右，完成胚后熟才能萌发，在浓度为25mg/l的外源赤霉素处理后，能缩短种子休眠时间，使三七提前出苗，但萌发率均比对照明显下降(崔秀明、王朝梁、李伟等，植物激素及生长调节剂对三七种子的效应[j].中药材，1994,(02):3-5,52)。另外，也有研究表明，植物激素赤霉素和脱落酸在调控三七种子萌发中起到了关键的作用，外源添加赤霉素，能够使得三七种子打破休眠，促进萌发(葛娜、杨玲、陈军文，不同浓度赤霉素和脱落酸对顽拗性三七种子后熟种胚发育和内源激素的影响[j].应用与环境生物学报，2020,26(03):574-581)。

本发明发现，用适宜浓度的d-松醇预先处理三七种植土壤，不仅能够促进三七种子的萌发，提高三七鲜重。特别是，本发明发现，仅需很低浓度的d-松醇处理就能够达到上述效果。尤其有益的是，经d-松醇处理后的连作土也能显著提高三七种子萌发率，说明很低浓度的d-松醇处理就能提高三七抗逆性，促进三七在逆境土壤环境中生长。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七生长促进剂，其包含d-松醇。

优选的，本发明所述三七生长促进剂还包括辅料，以便于制剂。进一步地，d-松醇可与辅料制成水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等剂型。优选的，在使用时可以将所述三七生长促进剂用水配制成合适的浓度。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述应用包括使用三七生长促进剂预先处理三七种植载体。本发明所述应用还包括将三七种植于上述载体中。

本发明的另一个目的在于提供一种促进种子萌发和三七生长的方法，所述方法包括使用三七生长促进剂预先处理三七种植载体。本发明所述方法还包括将三七种植于上述载体中。

优选的，本发明所述三七包括三七植株和三七种子。

在一个优选的实施方案中，所述促进种子萌发和三七生长的应用和方法包括使用三七生长促进剂浇灌三七种植载体并将三七种植于上述载体中。

在一个优选的实施方案中，所述促进种子萌发和三七生长的应用和方法包括使用三七生长促进剂浇灌三七种植载体并放置一段时间，然后将三七种植于上述载体中。优选的，所述时间可以为1-100d，优选5-60d，更优选10-40d，进一步优选20-30d。优选地，放置时将三七种植载体放置于密封空间中。

在一个优选的实施方案中，在使用时可以将所述三七生长促进剂用水配制成d-松醇的浓度为0.1～50mg/l。

优选的，所述浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l。所述浓度优选为0.5～30mg/l，进一步优选1～20mg/l。

在一个优选的实施方案中，所述三七生长促进剂或者稀释后的三七生长促进剂的用量为每100g三七种植载体使用5-100ml的三七生长促进剂。优选的，每100g三七种植载体使用5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml的三七生长促进剂。

因此，在本发明的一个实施方案中，所述d-松醇的用量为每100g三七种植载体使用0.5～5000μg，优选0.5μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg、2000μg、3000μg、4000μg、5000μg的d-松醇。优选的，所述d-松醇的用量为每100g三七种植载体使用5～2000μg，优选10～1000μg，进一步优选5～400μg的d-松醇。

在一个优选的实施方案中，所述三七种植载体包括土壤、石英沙等，尤其是三七连作土壤，但不限于此。

本发明的三七生长促进剂可应用于农田特别是三七连作农田以促进三七种子萌发和生长，提高三七抗逆性。优选的，可以以d-松醇的用量为1～200g/ha(克/公顷)来施用三七生长促进剂或稀释后的三七生长促进剂。优选的，d-松醇的用量为1g/ha、5g/ha、10g/ha、15g/ha、20g/ha、25g/ha、30g/ha、35g/ha、40g/ha、45g/ha、50g/ha、60g/ha、70g/ha、80g/ha、90g/ha、100g/ha、120g/ha、140g/ha、160g/ha、180g/ha、200g/ha。优选的，d-松醇的用量为1～100g/ha，更优选1～50g/ha，进一步优选5～20g/ha。

本发明的另一个目的，在于提供d-松醇在三七诱导抗性中的应用。

近年来，利用诱导剂诱导植物自身产生抗病性是植物病害防治的发展方向之一。植物通常以两种抗性途径，抵御外界病原菌的侵染。一种是系统获得抗性(systemicacquiredresistance,sar)，主要由病原菌侵染诱导的植物体内sa(水杨酸)、ros(活性氧)等积累进而诱使整个植株具有抗性(riedlmeierm,ghirardoa,wenigm,etal.monoterpenessupportsystemicacquiredresistancewithinandbetweenplants[j].theplantcell,2017,29(6):14401459；pietersecm,vanderdoesd,zamioudisc,etal.hormonalmodulationofplantimmunity[j].annualreviewofcellanddevelopmentalbiology,2012,28)。另一种为诱导系统抗性(inducedsystemicresistanceisr))，其特点是由非病原物诱导而使植物体产生抗性，目前研究发现，诱导系统抗性通常是由有益微生物介导下的ja(茉莉酸)和et(乙烯)激素依赖型的防御途径(李玉龙，生防菌对两种作物病害的防治作用及机理[d].西北农林科技大学，2019)。

本发明发现，d-松醇在诱导三七抗病性上具有显著效果。通过用d-松醇喷施处理三七，能够有效提高三七植株的抗病性，特别是对叶部黑斑病的抗性。所述处理使得三七叶部的病斑面积显著减小，特别是在很低浓度的d-松醇处理下就能提高三七抗病性。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七诱导抗性剂，其包含d-松醇。

优选的，本发明所述三七诱导抗性剂还包括辅料，以便于制剂。进一步地，d-松醇可与辅料制成水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等剂型。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述应用包括对三七种子或植株特别是三七叶片使用本发明所述的三七诱导抗性剂进行处理。优选的，将所述三七诱导抗性剂喷施于三七种子或植株特别是三七叶片上以诱导抗性。

本发明的另一个目的在于提供一种在三七中诱导抗性的方法，所述方法包括对三七种子或植株特别是三七叶片使用本发明所述的三七诱导抗性剂进行处理。优选的，所述方法包括将所述三七诱导抗性剂喷施于三七种子或植株特别是三七叶片上以诱导抗性。

在一个优选的实施方案中，在使用时可以将所述三七诱导抗性剂配制成合适的浓度，其中d-松醇的浓度为0.1～50mg/l。

优选的，所述浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l。所述浓度优选为0.5～20mg/l，进一步优选1～10mg/l。

在一个优选的实施方案中，本发明所述诱导抗性包括诱导三七产生抗病性和抗逆性，所述抗病性包括对三七黑斑病、三七立枯病、三七猝倒病、三七根腐病、三七黄锈病、三七炭疽病、三七白粉病、三七灰霉病、三七圆斑病等的抗性，尤其是对三七黑斑病的抗性，但不限于此。

有益效果：

本发明发现使用d-松醇预先处理三七种植载体，能够促进三七种子萌发和生长，增加单株鲜重，特别是对于三七连作土壤也有类似效果，也就是能提高其抗逆性。本发明还发现将d-松醇喷施于三七植株上，能够诱导三七产生抗病性，尤其是对三七黑斑病的抗性。特别是，本发明发现仅需很低浓度的d-松醇处理就能够达到上述效果。由于d-松醇广泛存在于松针中，是植物来源的调理剂，能够被自然界所降解，不会造成环境污染等问题，因此可广泛应用于三七种植中。

附图说明

图1：d-松醇对三七生长指标的影响；

图2：d-松醇处理连作土试验；

图3：d-松醇处理连作土瓶栽三七结果；

图4：d-松醇诱导抗性试验。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：d-松醇促进三七种子萌发和生长试验

本试验采用瓶栽沙培三七的方法，采用分析级纯度d-松醇作为实验材料，首先取1g的d-松醇加入到1l无菌水中，配制成1000mg/l母液，然后逐步稀释为1、5、20、50mg/l的溶液备用，以无菌水作为对照处理；将100g灭菌的石英沙装于玻璃组培瓶中再次用烘箱141℃烘干4h灭菌。冷却后，分别加入18ml浓度为0、1、5、20、50mg/l的d-松醇溶液，搅拌均匀后种上12粒三七种子。当第60d时，开始调查出苗的情况，第90d时调查三七单株鲜重指标。试验结果示于图1中，其中，(a)代表三七长势；(b)代表不同浓度的d-松醇处理后出苗率变化；(c)代表不同浓度的d-松醇处理后单株鲜重的变化。数据以均值±标准误的形式表示，不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one-wayanova，duncan’smultiplerangetest，p<0.05)。

试验结果表明，在5和20mg/l浓度下的d-松醇处理可以显著提高三七种子萌发率，试验中的所有浓度均能够促进种子萌发，但随着浓度的增加，促生效果先增加后减弱(图1，b)；在测定d-松醇对三七鲜重指标的影响发现，1～50mg/l浓度处理下均能够显著提高三七鲜重，1mg/l浓度处理效果最佳，但伴随浓度的增加，促生效果有所减弱(图1，c)。

实施例2：d-松醇处理连作土瓶栽三七试验

采用盆装连作土长期浇灌的方法:三七连作土取自云南文山三七农田，将取回来的连作土进行阴干处理，然后过40目网筛，去除土壤中植物残体，称取2.5千克的连作土加入到整理箱(28×20×17cm)内备用；取1g分析纯d-松醇加入到1l无菌水中，配制成1000mg/l母液，然后逐步稀释为1、10、50、100mg/l的溶液，以无菌水作为对照处理；取上述溶液500ml加入到不同整理箱内，然后盖上整理箱盖子，并用封口膜进行密封，将整理箱放置在避光阴凉处，每个处理设置3个重复(如图2所示)。处理1个月后，取经过不同浓度d-松醇处理后的上述土壤120g加入到组培瓶(220ml)内，三七种子经3％次氯酸钠浸泡消毒3分钟后用无菌水冲洗5遍，用灭菌镊子小心夹取消毒后的12粒三七种子种植于上述组培瓶中并密封瓶盖，将各个处理置于白天24℃，晚上16℃，光照强度2000lux，12小时光暗交替的培养室培养，60天后调查出苗率。结果示于图3中，其中，数据以均值±标准误的形式表示，不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one-wayanova，duncan’smultiplerangetest，p<0.05)。

试验结果表明，经过不同浓度d-松醇处理后的连作土都能显著提高三七萌发率，对照处理下三七种子萌发率为62.2％，而在10mg/l浓度d-松醇处理下，三七种子萌发率最高，达到了77.8％。随着d-松醇浓度的增加，处理间差异不明显，说明在很低的浓度处理下就能提高三七抗逆性，促进三七在逆境土壤环境中生长。

实施例3：d-松醇对三七诱导抗性试验

采用d-松醇进行喷施处理的方法：将移栽存活后的三七盆栽放置于透明塑料密封培养箱，每盆移栽10株三七，分别使用无菌水和1mg/l浓度的d-松醇对盆栽三七进行喷施，无菌水处理作为对照组，d-松醇作为处理组；叶部每天用上述液体进行喷施处理，连续处理5天后，叶面挑战接种三七黑斑病菌(alternariapanax)的菌饼，接种后移至于透明塑料培养箱内保湿培养，接种3d发病后采集病斑叶片，使用epsonperfectionv850pro扫描仪扫描病叶，并使用adobephotoshop软件截取并计算诱导处理与对照处理的相对病斑面积，评价d-松醇诱导三七抗性的效果。试验结果示于图4中，其中，数据以均值±标准误的形式表示，不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one-wayanova，duncan’smultiplerangetest，p<0.05)。

试验结果表明，三七在经过1mg/l浓度的d-松醇喷施处理后，当在叶部接种黑斑病菌时，其病斑面积显著降低，对照处理下病斑面积为0.24cm²，d-松醇处理下病斑面积为0.12cm²，说明在三七叶部喷施d-松醇后能够使三七产生抗病性，抵抗黑斑病菌的侵入。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。