一种快速高效无损鉴别高赖氨酸糯玉米籽粒的方法

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种快速高效无损鉴别高赖氨酸糯玉米籽粒的方法。

背景技术：

糯玉米是鲜食玉米的主要类型之一，具有风味独特、营养丰富等优点，是我国重要的果蔬类农产品。随着消费水平提高，消费者对高端优质、高营养农产品的需求日益增强，提高糯玉米的营养品质是糯玉米育种的发展方向。赖氨酸是人体必需氨基酸之一，在人体发育、增强免疫、提高中枢神经组织功能等方面有非常重要的作用，也被称为第一必需氨基酸、第一限制氨基酸。开展高赖氨酸糯玉米育种，提高糯玉米中赖氨酸含量，有着重要意义。

opaque-2基因能显著提高玉米籽粒中赖氨酸含量，是目前研究和利用最多的高赖氨酸基因。将opaque-2基因供体与受体亲本杂交，利用常规育种方法，或常规育种+分子标记辅助育种的方法，是目前选育高赖氨酸玉米种质的主要途径。opaque-2基因表现为隐性单基因遗传，只有在隐性纯合时才表现高赖氨酸性状，因此，无论使用哪种育种方法，准确鉴定出后代中赖氨酸含量高的籽粒是进行高赖氨酸玉米育种的关键。

现有技术多采用分子标记辅助检测高赖氨酸玉米育种过程中的高赖氨酸玉米植株，这种方法需要对所有收获的籽粒进行全部种植，然后所有单株取叶片提dna，需要耗费较多的土地资源，成本较高，时间较长。现有技术还利用化学方法检测高赖氨酸玉米育种过程中的高赖氨酸玉米籽粒，但化学方法检测赖氨酸含量需要破坏籽粒，浪费来之不易的育种材料，且因为一般是抽样检测，未取样检测的籽粒也无法保障是高赖氨酸籽粒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴别高赖氨酸糯玉米籽粒的方法。本发明所提供的方法可以高效、无损、快速的检测得到高赖氨酸糯玉米籽粒。且本发明所提供方法可实现对全部糯玉米籽粒都进行鉴别，挑选得到高赖氨酸糯玉米籽粒的准确度在90%以上，平均达93%。

糯玉米籽粒的胚乳含有近100%的支链淀粉，籽粒成熟后呈蜡质不透明状态，因此在糯玉米中导入赖氨酸调控相关基因后，即使糯玉米籽粒的胚乳呈现不透明，也不能以此判断赖氨酸调控相关基因已导入糯玉米中。使得通过常规眼观的方法不能准确鉴别高赖氨酸含量的糯玉米，增加了对高赖氨酸含量的糯玉米籽粒的鉴定难度。

利用分子标记辅助检测和化学测定是鉴别高赖氨酸糯玉米籽粒的主要方法。分子标记辅助检测时需提dna，且土地利用等成本较高，时间较长。化学方法检测赖氨酸含量需要破坏籽粒，且一般是抽样检测，未取样检测的籽粒也无法保障是高赖氨酸籽粒。

基于此，本发明第一方面，提供一种鉴别育种过程中高赖氨酸糯玉米籽粒的方法，在糯玉米蜡熟期收获籽粒，选取胚乳质地不透明的籽粒。

为了进一步确保鉴别的准确度，本发明提供的方法选在糯玉米授粉后的38-42天收获籽粒，选取胚乳质地不透明的籽粒；

进一步地，本发明提供的方法，选在糯玉米籽粒含水量在35-45%时收获籽粒，选取胚乳质地不透明的籽粒。

发明人首次发现，在上述糯玉米生长发育时期（糯玉米蜡熟期、糯玉米授粉后的38-42天和/或糯玉米籽粒含水量在35-45%）进行收获时，籽粒含水量较大，普通糯玉米籽粒胚乳中因较多水分会呈现部分晶莹状态和较亮的光泽，此时不透明的糯玉米籽粒胚乳是由赖氨酸基因导致的。随着籽粒继续成熟，籽粒胚乳失水干燥，普通糯玉米籽粒则会呈现其典型的蜡质不透明的胚乳特征，而此时高赖氨酸糯玉米籽粒仍呈现不透明状态，因此，籽粒完全成熟干燥或收获较晚、水分含量较低时，难以鉴别其中的高赖氨酸籽粒。

具体地，本发明提供的方法可以在以含有赖氨酸含量调控基因的玉米种质为基因供体，糯玉米种质为受体进行育种操作时，检测糯玉米是否为高赖氨酸糯玉米。

第二方面，本发明提供一种高赖氨酸糯玉米的选育方法，利用上述方法在选育过程对高赖氨酸糯玉米籽粒进行鉴别。

本发明所提供的选育方法，包括以下步骤：

（1）以含opaque-2的玉米种质材料为父本，以京糯6为母本，杂交得f1代种子；

（2）种植f1代种子并严格自交，得到f2代种子；

（3）以f1代植株为母本，以京糯6植株为父本进行回交，得到bc1f1种子；

（4）选择f2代种子及bc1f1种子中的蜡质不透明籽粒进行自交，得到自交1代种子；

（5）种植自交1代种子，严格自交，在籽粒处于蜡熟期、授粉后38-42天或含水量在35-45%时进行收获，保留籽粒胚乳不透明的种子。

为了得到稳定遗传的高赖氨酸糯玉米，本发明所提供的育种方法还包括，

对（5）中所述自交1代进行回交后，取回交后代严格自交，在籽粒处于蜡熟期、授粉后38-42天和/或含水量在35-45%时进行收获，保留籽粒胚乳不透明的种子。

根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护，上述方法或上述选育方法在糯玉米育种、糯玉米种质创新、制备高赖氨酸含量玉米制品中的应用。

本发明所提供的方法，可以在不损害糯玉米籽粒的情况下，准确筛选出糯玉米中高赖氨酸含量的籽粒。

本发明的有益效果至少在于：

（1）本发明所提供的方法可省去基因型检测的步骤，节省时间，节省检测人力物力资金投入；

（2）本发明所提供的方法不用破坏性取样检测，节省选育过程中得来不易的材料；

（3）本发明所提供的方法，鉴别得到的高赖氨酸糯玉米籽粒的准确度高，根据化学检测的验证，所送检样品的高赖氨酸匹配率为100%；根据分子标记验证，准确率在90%以上，平均达到93%。

附图说明

图1为本发明实施例3中授粉后38-42天内收获时，普通糯玉米籽粒与高赖氨酸糯玉米籽粒的对比图。

图2为本发明实施例3中授粉后43-50天内收获时，普通糯玉米籽粒与高赖氨酸糯玉米籽粒的对比图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、杂交

以我国糯玉米骨干自交系京糯6为母本，由北京市农林科学院玉米研究中心选育并提供，赖氨酸含量为0.33%。以含opaque-2的玉米种质材料a为父本，其基因型为纯合隐性（o2o2），籽粒赖氨酸含量为0.48%（玉米籽粒中赖氨酸含量≥0.4%即为高赖氨酸玉米），杂交，得到f1代。

2、糯玉米种子的获得

（1）自交

种植上述1中f1代种子并进行严格自交，记录授粉日期。在籽粒完熟期进行收获，得到f2代种子。

（2）回交

种植上述1中f1代种子，以该f1植株为母本，以京糯6为父本进行回交，记录授粉日期。在籽粒完熟期进行收获，得到bc1f1代种子。

（3）糯玉米种子鉴选

从上述（1）（2）中获得的种子，在完熟期，根据表型挑选其中胚乳蜡质不透明籽粒，进行下一代种植。

3、高赖氨酸糯玉米籽粒的鉴别（自交回交自由接替进行）

（1）继续自交1代

种植上述步骤2的（3）中所得到的种子，进行严格自交，记录授粉日期，及时观测灌浆进程。在授粉后38-42天，籽粒处于蜡熟期，含水量在35%-45%时进行收获。在籽粒干燥之前，根据种子表型，鉴别出其中的高赖氨酸籽粒。根据育种需求，鉴别出的高赖氨酸籽粒可进行下一步继续自交选育，或继续回交，再自交。

（2）回交1次，再自交

种植上述步骤2的（3）中得到的种子，并以其植株为母本，以京糯6为父本进行回交1次，获得回交种子。种植该世代种子，并进行严格自交，记录授粉日期，及时观测灌浆进程。在授粉后38-42天，籽粒处于蜡熟期，含水量在35-45%时进行收获。

收获后立即根据种子表型，鉴别出其中表现不透明的籽粒即为高赖氨酸籽粒。

对鉴别出的拟高赖氨酸籽粒进行表型验证：取上述自交果穗10穗，按上述方法，从每一果穗上将拟高赖氨酸籽粒和普通籽粒分离，共获得10份拟高赖氨酸籽粒和10份普通籽粒，利用化学方法分别检测其赖氨酸含量，见表1。结果表明，利用此方法鉴别出的高赖氨酸籽粒赖氨酸含量均在0.4%以上，平均为0.59%，最高达到0.64%；普通糯玉米籽粒赖氨酸含量均在0.4%以下。

对鉴别出的拟高赖氨酸籽粒进行基因型验证：取上述自交果穗10穗，按照此方法，从中鉴别出300粒拟高赖氨酸籽粒，并分成3份重复，每份100粒种子。用分子标记鉴定其opaque-2基因型，结果表明：利用此种方法鉴别高赖氨酸籽粒的准确率分别为91%、93%、95%，平均达93%。

根据育种需求，鉴别出的高赖氨酸籽粒可进行下一步继续选育。

实施例2

1、杂交

以我国糯玉米骨干自交系京糯6为母本，由北京市农林科学院玉米研究中心选育并提供，赖氨酸含量为0.33%。以含opaque-2的玉米种质材料a为父本，其基因型为纯合隐性（o2o2），籽粒赖氨酸含量为0.48%（玉米籽粒中赖氨酸含量≥0.4%即为高赖氨酸玉米），杂交，得到f1代。

2、糯玉米种子的获得

种植上述1中f1代种子，以该f1植株为母本，以京糯6为父本进行回交，记录授粉日期。在籽粒完熟期进行收获，得到bc1f1代种子。根据表型挑选其中不透明籽粒，进行下一代种植。

3、高赖氨酸籽粒的鉴别（连续回交）

种植上述挑选出的bc1f1种子，得到bc1f1代植株群体，利用分子标记辅助育种方法检测其基因型，筛选出基因型为o2o2的单株，并以其为母本，以京糯6为父本进行继续回交，得到bc2f1种子。种植得到bc2f1代群体，根据育种需求，可按上述方法继续进行回交0-4代，得到回交多代的种子。种植得到回交多代的植株群体。对该群体进行严格自交，并记录授粉日期，及时观察籽粒灌浆进程。在授粉后38-42天，籽粒处在蜡熟期，籽粒含水量在35%-45%时进行收获，收获后立即根据种子表型，鉴别出其中的高赖氨酸籽粒。

实施例3高赖氨酸糯玉米不同发育时期种质特性对比

1、杂交

以我国糯玉米骨干自交系京糯6为母本，由北京市农林科学院玉米研究中心选育并提供，赖氨酸含量为0.33%。以含opaque-2的玉米种质材料a为父本，其基因型为纯合隐性（o2o2），籽粒赖氨酸含量为0.48%（玉米籽粒中赖氨酸含量≥0.4%即为高赖氨酸玉米），杂交，得到f1代。

2、糯玉米种子的获得

种植上述1中f1代种子，以该f1植株为母本，以京糯6为父本进行回交，记录授粉日期。在籽粒完熟期进行收获，得到bc1f1代种子。根据表型挑选其中不透明籽粒，进行下一代种植。

种植上述步骤2中所得到的种子，进行严格自交，记录授粉日期，及时观测灌浆进程。在授粉后30天、35天、45天、50天分别收获10穗自交果穗。

授粉后30天，糯玉米籽粒还处于乳熟期，胚乳和胚未发育成熟，籽粒种质特性未显现，并且此时种子发芽率低，不适宜收获。

授粉后35天，籽粒进入蜡熟期，处于蜡熟初期，此时收获后挑选出穗上拟高赖氨酸籽粒，进行发芽率测定和基因型检测。测定和检测结果表明，在授粉后35天收获，种子发芽率为80%，未达到国家标准中合格种子发芽率；且在授粉后35天收获，利用本方法鉴定的准确率为78%。综合两方面来看，在此阶段收获，种子发芽率和鉴定准确率都较低，会造成土地、人力等资源的较多消耗，未达到理想状态。

授粉后38天，籽粒进入蜡熟中期，籽粒含水量逐渐下降，此时收获后挑选出穗上拟高赖氨酸籽粒，进行发芽率测定和基因型检测。测定和检测结果表明，在授粉后38天收获，种子发芽率为85%，达到国家合格种子标准；且在授粉后38天收获，利用本方法鉴定的准确率为92%。

授粉后42天，籽粒处于蜡熟中期，籽粒含水量逐渐下降，此时收获后挑选出穗上拟高赖氨酸籽粒，进行发芽率测定和基因型检测。测定和检测结果表明，在授粉后42天收获，种子发芽率为92%，达到国家合格种子标准；且在授粉后42天收获，利用本方法鉴定的准确率为93%。

图1是在授粉后38-42天内，收获得到普通糯玉米籽粒（照片上方籽粒）与高赖氨酸糯玉米籽粒（照片下方籽粒）的对比，从图1中可以看出，照片上方的籽粒在授粉后38-42天内，籽粒胚乳呈现透明状；照片下方的籽粒在授粉后38-42天内，籽粒呈现粉质不透明状态。充分证实，高赖氨酸糯玉米籽粒与普通糯玉米籽粒在授粉后38-42天内，可通过糯玉米籽粒胚乳透明与否进行鉴别。

授粉后45天，籽粒处于蜡熟后期、即将进入完熟期，籽粒含水量降低，糯玉米种质特性开始显现，此时收获后挑选出穗上拟高赖氨酸籽粒，进行发芽率测定和基因型检测。测定和检测结果表明，在授粉后45天收获，种子发芽率为94%，达到国家合格种子标准；且在授粉后45天收获，利用本方法鉴定的准确率为80%。

授粉后50天，籽粒处于完熟期，籽粒含水量低，糯玉米种质特性开始完全显现，胚乳呈蜡质不透明状。此时收获后挑选出穗上拟高赖氨酸籽粒，进行发芽率测定和基因型检测。测定和检测结果表明，在授粉后50天收获，种子发芽率为95%，达到国家合格种子标准；且在授粉后50天收获，利用本方法鉴定的准确率为60%，准确率大大降低。

图2是在授粉后43-50天内，收获得到的普通糯玉米籽粒（照片上方籽粒）与高赖氨酸糯玉米籽粒（照片下方籽粒）的对比，从图2中可以看出，照片上方的籽粒在授粉后43-50天内，籽粒胚乳呈现不透明状；照片下方的籽粒在授粉后43-50天内，籽粒也呈现粉质不透明状态。图2表明，在授粉后43-50天内，普通糯玉米籽粒与高赖氨酸糯玉米籽粒的种质在透明度上无差别，不能起到高赖氨酸糯玉米鉴定的效果。

因此，授粉后38-42天为鉴别高赖氨酸糯玉米籽粒的最佳收获期。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。