一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法

1.本发明属于环境毒理学技术领域，具体涉及一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法。


背景技术：

2.丰年虾，又名丰年虫、盐水虾、卤虫，其发育过程包括：卵、无节幼虫、后无节幼虫、拟成虫和成虫5个阶段。卵在适宜温度、盐度下，大约18
‑
30h孵化为无节幼虫。因此，丰年虾具有发育历期短、繁殖速度快、不良环境耐受力强、经济价值高等特点，可以作为鱼、虾、蟹等多种水生生物幼苗的饵料。目前，丰年虾在环境毒理学研究领域起着重要作用，是一种新兴的用于评价污染物质环境安全性的模式生物。
3.阻垢剂是一类能阻止结垢的化学药剂，其原理是通过破坏结垢过程，阻断晶体的形成和发育，从而起到阻碍结垢发生的作用。常见的阻垢剂可以分为磷酸类阻垢剂、聚羧酸类阻垢剂、磺酸类阻垢剂与绿色阻垢剂四类，目前，阻垢剂在油田回注水处理、工业系统循环冷却水防垢以及海水淡化领域应用广泛。但阻垢剂，尤其是磷酸类阻垢剂排放入海后，不可避免地会引起一些诸如海水富营养化、破坏水中生态系统平衡等的问题。然而，随着油田开发的不断进行和海水淡化工程的进一步发展，阻垢剂的应用必将进一步扩大。
4.因此，探明阻垢剂类物质对环境的潜在影响，和它对环境中生物的毒性效应是具有实际意义的。但目前有关阻垢剂类物质生物毒性的研究仍然较少，有待进一步研究和深入。


技术实现要素：

5.针对目前阻垢剂类物质生态毒性效应方面研究不足的现象，本发明提供了一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，该方法简便易行，可操作性强，在一定程度上填补了目前阻垢剂类物质生物毒性研究领域的空白。并且，该方法用丰年虾卵的孵化抑制率作为反应阻垢剂类物质生物毒性的指标，避免了使用实验室自孵化的丰年虾幼体进行实验可能会出现的幼体存活率低，存活时间短的问题。
6.本发明所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，包括以下步骤：
7.1.孵化准备：在蒸馏水中加入海水晶，配置盐度为35
‰
的人工海水，用于后续实验操作。
8.2.用步骤一中配置的人工海水作为溶剂，配置所需浓度的阻垢剂类物质的溶液。共设定六个实验组，包含一个空白组，每组设立三个平行，六个组除水质不同外，其余条件均相同。
9.3.将相同体积的空白组和实验组溶液分装入相同规格的烧杯中，按照每升溶液投入0.05g丰年虾卵的比例，称取丰年虾卵投入各个烧杯中并充气15min使丰年虾卵充分接触溶液。
10.4.充气完成后，将黏附于烧杯壁上的卵冲洗入溶液中，避免其脱水失活。
11.5. 38h后，使用移液枪于烧杯中随机取样50μl，注入培养皿中，每个烧杯中共取40次，对取出液体中含有的已孵化丰年虾幼体进行计数。
12.6.按照公式，计算各浓度组的丰年虾卵孵化抑制率，并对所得数据结果进行分析。其中，n为空白对照组丰年虾无节幼体数，ni为某实验组丰年虾无节幼体数。
13.其特征在于，步骤5中，为了避免随机因素干扰实验，每个烧杯应取样并计数三次。
14.其特征在于，孵化过程中，容器尽量保持静置，防止液体晃动使丰年虾卵黏附于烧杯壁上脱水，整个孵化过程在20
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30℃的温度条件下进行，并保持光照。
15.本发明的优点：
16.1.优先选用生态毒理学领域具有代表性的生物，丰年虾在我国近海海水中分布广泛，在表征水体毒性方面具有较强的代表意义。
17.2.选用丰年虾卵的孵化抑制率作为毒性强弱的表征指标，有利于避免使用实验室自孵化丰年虾幼体进行实验时，幼体的自然存活率得不到保障的问题。
18.3.所述的毒性实验每个浓度组设立三个平行实验，并在后续计数时，对每个实验样品计数三次，多次重复有利于消除偶然因素对实验结果的干扰，获得更可靠的实验结果。
附图说明
19.图1为所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法流程图。
具体实施方式
20.为了阐明本发明的技术方案，现结合附图及对磷酸类阻垢剂2
‑
磷酸基丁烷
‑
1，2，4
‑
三羧酸(pbtca)的毒性检测流程对本发明做进一步的详细介绍。
21.下列实施例中的方法，不限于用于2
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磷酸基丁烷
‑
1，2，4
‑
三羧酸这一种磷酸类阻垢剂毒性检测。
22.本实施例具体步骤如下。
23.1.在蒸馏水中加入海水晶，配置盐度为35
‰
的人工海水，用于后续实验操作。
24.2.用步骤一中配置的人工海水作为溶剂，分别配置0、30、60、120、480μl/l的pbtca(50％in water)溶液，每个浓度配置2l。
25.3.选择500ml烧杯作为实验容器，分别向每个烧杯中注入500ml步骤二中配好的各组溶液。
26.4.向每个烧杯中投入0.05g丰年虾卵，并充气15min，充气完成后用洁净的一次性滴管吸取烧杯中溶液将黏附于烧杯壁上的卵冲入溶液中，在室温和持续光照的条件下静置38h等待孵化。
27.5. 38h后，对每个烧杯用100μl移液枪每次取样50μl，连续随机取样40次分别注入培养皿中，对取出液体中含有的已孵化丰年虾幼体进行计数，每个烧杯平行计数三次，取平均值。并将空白组幼体数记为n，实验组幼体数记为ni。
28.6.按孵化抑制率＝(1
‑
ni/n)
×
100％的公式，计算各组丰年虾孵化抑制率，并对所得数据进行和分析。


技术特征：
1.一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，特征是包括三个步骤：孵化准备，毒性实验和分析计算。(1)孵化准备：在蒸馏水中加入海水晶，配置盐度为35
‰
的人工海水，用于后续实验操作。(2)毒性实验：
①
配置阻垢剂类物质溶液，大多数阻垢剂可以直接溶于水中，用步骤一中配置的人工海水作为溶剂，根据需要配置较高浓度的阻垢剂溶液，用于后续实验。
②
浓度组的设定，根据需要设定六个实验组，包含一个空白组，每组设立三个平行，实验组1
‑
5是使用不同浓度阻垢剂溶液的实验组，空白组是利用人工海水进行实验的对照组。六个组除水质不同外，其余条件均相同。
③
将配好的各浓度组溶液分装入相同规格的烧杯中，按照每升人工海水投入0.05g丰年虾卵的比例向每个烧杯中进行投卵，投卵后充气15min使丰年虾卵充分接触溶液，充气完成后对各组保持持续光照，静置24h后。
④
24h后，用移液枪分别于各烧杯中随机取样40次，每次50μl，注入培养皿中，对孵化出的丰年虾无节幼体进行计数。(3)分析计算：按照如下公式，计算各浓度组的丰年虾卵孵化抑制率，其中，n为空白对照组丰年虾无节幼体数，n
i
为某实验组丰年虾无节幼体数。孵化抑制率＝(1
‑
n
i
/n)
×
100％。2.据权利要求1所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，步骤(2)中选择的烧杯规格应在500ml左右为宜。3.据权利要求1所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，步骤(2)中分装各浓度阻垢剂类物质溶液时，向每个烧杯中加入的溶液体积应相同。4.据权利要求1所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，步骤(2)中投卵并充气后，应将黏附于容器壁上的丰年虾卵冲入溶液中，避免其脱水死亡。5.据权利要求1所述的一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，其特征在于，整个实验应在20
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30℃的温度条件下进行，并保持光照。

技术总结
本发明公开了一种用丰年虾卵对阻垢剂类物质毒性进行检测的方法，主要包括三个步骤：孵化准备，毒性实验和分析计算。本发明能有效避免实验室孵化丰年虾卵后所得幼虫在未添加毒性物质的条件下依然出现成活率低，存活时间短等不利于后续毒性实验进行的现象，提供了一种利用丰年虾卵进行阻垢剂类物质毒性检测的的方法。的方法。


技术研发人员：刘宪华 李贇雪 李璟玉
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2021.08.19
技术公布日：2021/11/21