一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存液及保存方法与流程

1.本发明属于鱼类育种领域，涉及一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存液及保存方法。


背景技术：

2.鞍带石斑鱼，俗称俗名龙趸，是热带亚热带暖水性鱼类，属鲈形目、鲈亚目、鮨科、石斑鱼亚科。鞍带石斑鱼生长快速，肉质鲜美，营养丰富，深受市场的欢迎，为我国的广东、福建、海南等沿海省份的重要养殖鱼类。鞍带石斑鱼受精卵市场需求量大，价格高企，单价常年在3～6万元每公斤，为企业和养殖户创造巨大的经济效益。目前，市面上的鞍带石斑鱼受精卵主要通过人工催产和人工体外受精产生，其中催产后排出的卵子必须马上受精否则就会失去活性而导致受精失败。因此如何提高鞍带石斑鱼卵子在体外的生存能力，确保卵子在排出体外一段时间内仍具有活性，且保持较好受精能力以利于苗种生产，是鞍带石斑鱼人工繁殖有待解决的问题之一。
3.目前对体外卵子保存技术的相关研究主要集中在鲟鱼类，对石斑鱼类却未曾有相关的报道。其中在西伯利亚鲟体外卵子保存技术的研究中，把氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠及牛血清白蛋白等组分按照一定比例配制成的保存液能对西伯利亚鲟卵子进行短时间的保存。然而，该保存液配制较为繁琐，且对鞍带石斑鱼卵的保存效果差，因此根据鞍带石斑鱼卵自身的特性，针对性地开发出适合自身且易于配制的卵子保存液很有必要。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存液，实现了鞍带石斑鱼卵子在体外的保存，且体外保存后还具有较高的受精率及孵化率。
5.本发明的第二目的在于提供一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存方法。
6.为实现上述的第一目的，本发明所采取的技术方案是：
7.一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存液，以l-15培养基为主溶液，按l-15培养基的体积为基准包括以下组分：10万iu/l青霉素、100mg/l链霉素、0.1ul/ml鞍带石斑鱼血清、2.38～3g/l的hepes缓冲盐。
8.本发明以l-15培养基为主要溶液配制保存液，其含有多种盐离子，还含有烟酰胺、叶酸、生物素、肌醇等多种生物机体代谢所需的营养要素，能较好地维持卵子的营养状况；而且l-15培养基使用半乳糖作为碳源，能避免卵子代谢中乳酸的形成及积累而降低卵子的活力。同时本发明添加的鞍带石斑鱼雌性亲鱼血清包含多种鞍带石斑鱼卵子所需的生长因子及营养因子，能保持维持卵子膜结构的稳定，维持正常生理代谢活动，增加卵子的抗氧化性，消除自由基，以保持卵子活力。
9.为实现上述的第二目的，本发明所采取的技术方案是：
10.一种鞍带石斑鱼卵子的体外保存方法，包括以下步骤：使用l-15培养基为主溶液，以l-15培养基的体积为基准加入如下组分：10万iu/l青霉素、100mg/l链霉素、0.1ul/ml鞍
带石斑鱼血清、2.38～3g/l的hepes缓冲盐，制得体外保存液；然后将成熟的鞍带石斑鱼卵子完全浸没在体外保存液中，避光静置保存。
11.所述体外保存液在配制时，先用naoh溶液或盐酸溶液调节其ph值至8.00～8.20后再加入hepes缓冲盐。
12.所述鞍带石斑鱼血清取自处于生殖期的、体重在40kg以上的雌性鞍带石斑鱼；从其尾静脉获取血液，4℃下析出血清，使用8000rpm离心10min，离心温度为4℃，吸取上清液，置于-80℃中保存。
13.所述鞍带石斑鱼卵子取自性成熟的鞍带石斑鱼雌性亲鱼，且在收集的过程中避免接触到海水。
14.所述体外保存液的使用比例为每1g鞍带石斑鱼卵子添加4～8ml体外保存液，优选添加6ml体外保存液。
15.所述保存的温度为20～24℃，优选为22℃。
16.所述鞍带石斑鱼卵子从体外保存液取出时使用100～200目滤网滤去体外保存液，然后可直接用于人工受精。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明的体外保存液以l-15培养基为主要溶液，并添加了鞍带石斑鱼雌性亲鱼血清，使鞍带石斑鱼卵子在体外保存时保持活力，能够有效保存不小于8小时，保证卵子在体外保存后还具有较高的受精率和孵化率，以及较低的畸形率，有利于鞍带石斑鱼的人工受精工作以及苗种生产。
19.本发明提供了一种能够让鞍带石斑鱼卵子在体外保存的方法，解决了鞍带石斑鱼卵子在体外无法保存的难题，填补了石斑鱼中卵子在体外保存技术中的空白，为生产管理和科学研究提供了可靠的技术手段。
具体实施方式
20.以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
21.实施例1
22.不同保存液的保存效果对比分析。
23.(1)按照以下配方配制保存液a～e。
24.保存液a：氯化钠120mmol/l，氯化钾5.67mmol/l，硫酸镁0.78mmol/l，氯化钙0.65mmol/l，葡萄糖4.24mmol/l，碳酸氢钠20mmol/l，牛血清蛋白1mmol/l，青霉素10万iu/l，链霉素100mg/l，上述组分均匀混合于水中后，用氢氧化钠调节ph值至8.00，最后加入3g/l的hepes。
25.保存液b：氯化钠120mmol/l，氯化钾5.67mmol/l，硫酸镁0.78mmol/l，氯化钙0.65mmol/l，葡萄糖4.24mmol/l，碳酸氢钠20mmol/l，青霉素10万iu/l，链霉素100mg/l，上述组分均匀混合于水中后，氢氧化钠调节ph值至8.00，最后加入3g/l的hepes。
26.保存液c：以l-15培养基为主溶液，加入青霉素10万iu/l、链霉素100mg/l，上述组分均匀混合后，把ph值调节至8.00，最后加入3g/l的hepes。
27.保存液d：以l-15培养基为主溶液，加入1mmol/l的牛血清蛋白、青霉素10万iu/l、链霉素100mg/l，上述组分均匀混合后，把ph值调节至8.00，最后加入3g/l的hepes。
28.保存液e：选取一尾体重在40kg以上，处于生殖期的雌性鞍带石斑鱼，麻醉后从尾部静脉抽取血液5ml，4℃中过夜析出血清，使用8000rpm离心10min，离心温度为4℃，吸取上清液，马上以0.1ul/ml的浓度与l-15培养基混合，加入青霉素10万iu/l、链霉素100mg/l，然后把ph值调节至8.00，最后加入3g/l的hepes。
29.(2)从性成熟的鞍带石斑鱼雌性亲鱼中收集成熟的卵子，在收集的过程中必须避免卵子接触到海水。
30.(3)每组实验准备3个干净的6cm细胞培养皿，每个培养皿中添加约40ml的保存液，称取约5g成熟的鞍带石斑鱼卵子放置于培养皿中，确保卵子被保存液完全浸没，避光静置保存，保存温度为22℃。
31.(4)2h后分别取出培养皿，用150目的滤网滤去保存液，把卵子从滤网中取出，马上加入0.2ml的鞍带石斑鱼精子，搅拌均匀后加入300ml的干净海水，搅拌1min后滤去海水，把受精卵放入装有干净海水的孵化桶中孵化，并对受精率及孵化率，畸形率进行统计。
32.(5)另取3份各5g的成熟鞍带石斑鱼卵子作为对照组，直接加入0.2ml的鞍带石斑鱼精子搅拌均匀后，加入300ml的干净海水，搅拌1min后滤去海水，并置于装有干净海水的孵化桶中孵化，作为对照组，统计受精率及孵化率，畸形率。
33.(6)另再取3份各5g的成熟鞍带石斑鱼卵子，置于空气中，2h后直接加入0.2ml的鞍带石斑鱼精子搅拌均匀后，加入300ml的干净海水，搅拌1min后滤去海水，并置于装有干净海水的孵化桶中孵化，作为不保存组，统计受精率及孵化率，畸形率。上述实验的结果如表1所示。
34.表1
35.组别受精率(％)孵化率(％)畸形率(％)对照组78.780.10.14保存液a5.80不统计保存液b28.555.41.28保存液c48.766.30.46保存液d11.60不统计保存液e74.673.90.13不保存组2.00不统计
36.由上述结果可知，鞍带石斑鱼卵子在空气中放置2h已基本失去受精能力，而保存液a、b、c、d对鞍带石斑鱼卵子的保存效果也并不理想。保存液a、b是根据现有技术中西伯利亚鲟卵子体外保存液的配方而配制，由于西伯利亚鲟是一种生活在淡水中的大型鱼类，其生殖及生理特点与鞍带石斑鱼存在巨大差异，因此保存液a、b对鞍带石斑鱼卵子起不到有效的保护作用；而其中保存液a在保存液b的基础上增加了牛血清蛋白，但保存液a的保存效果却显著降低。保存液c及保存液d都采用l-15培养基作为主溶液，其中保存液c对鞍带石斑鱼卵也具有一定的保存效果，其保存效果要优于用盐溶液制备的保存液b，这说明对于鞍带石斑鱼，l-15培养基能有效提高体外保存卵子的效果；保存液d在保存液c的基础上添加了牛血清蛋白，却大大降低了保存效果，这可能是由于牛血清蛋白是从哺乳类中提取的营养
成分，不利于鞍带石斑鱼卵子的保存。相比其他四种保存液，本发明的保存液e采用了l-15培养基及鞍带石斑鱼血清作为主要成分，保存效果明显优于其他四种保存液，这可能是由于l-15本身具有较好的营养成分，而鞍带石斑鱼血清中则含有维持卵子活性的重要因子，更接近鞍带石斑鱼卵子在体腔中的生理环境，因此能较好地维持卵子的活力。从上述实验可知，保存液e可作为鞍带石斑鱼卵子保存液。
37.实施例2
38.(1)本实施例的保存液与保存液e的组分和制备方法相同，区别在于本实施例保存液的ph值先调节为8.15，再加入了2.38g/l的hepes缓冲盐。
39.(2)从性成熟的鞍带石斑鱼雌性亲鱼中收集成熟的卵子，在收集的过程中必须避免卵子接触到海水。
40.(3)准备12个干净的6cm细胞培养皿，每个培养皿中添加约30ml的卵子保存液，称取约5g的鞍带石斑鱼成熟卵子放置于培养皿中，确保卵子被保存液完全浸没，避光静置保存，保存温度为20℃。
41.(3)每隔2小时取出3个培养皿，用200目的滤网去除保存液后，对卵子进行人工受精、孵化，统计受精率及孵化率，畸形率，测试时间为8h。结果如表2所示，其中对照组为收集到成熟的鞍带石斑鱼卵子后不保存，直接进行人工受精。
42.表2
43.组别受精率(％)孵化率(％)畸形率(％)对照组76.077.40.182h实验组74.576.10.174h实验组69.371.60.226h实验组66.669.80.178h实验组64.469.50.20
44.实施例3
45.(1)本实施例的保存液与保存液e的组分和制备方法相同，区别在于本实施例保存液的ph值先调节为8.20，再加入了2.67g/l的hepes缓冲盐。
46.(2)从性成熟的鞍带石斑鱼雌性亲鱼中收集成熟的卵子，在收集的过程中必须避免卵子接触到海水。
47.(3)准备12个干净的6cm细胞培养皿，每个培养皿中添加约40ml的卵子保存液，称取约8g的鞍带石斑鱼成熟卵子放置于培养皿中，确保卵子被保存液完全浸没，避光静置保存，保存温度为24℃。
48.(3)每隔1小时取出3个培养皿，用150目的滤网去除保存液后，对卵子进行人工受精、孵化，统计受精率及孵化率，畸形率，测试时间为4h。结果如表2所示，其中对照组为收集到成熟的鞍带石斑鱼卵子后不保存，直接进行人工受精。
49.表3
50.[0051][0052]
综上所述，采用本发明方法能在体外对鞍带石斑鱼卵子进行保存，体外保存一段时间后鞍带石斑鱼卵子还具有较高的受精率、孵化率，有利于鞍带石斑鱼的人工受精的工作及苗种生产，且本发明的保存液易于购买及配制，突破了石斑鱼卵子在体外无法保存的技术难题，为鞍带石斑鱼的卵子生产和研究提供了高效稳定的保存技术。
[0053]
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。