一种检测鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法及其应用

1.本发明涉及植物非生物逆境胁迫种质鉴定技术领域，尤其涉及一种检测鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法及其应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是全世界第一大作物，用途最为广泛，玉米的产量对保障国家粮食安全具有重要意义。鲜食玉米是以收获鲜嫩果穗或籽粒为主的一类玉米，主要包括甜玉米和糯玉米，因乳熟期鲜食营养丰富，食味独特，具有很高的经济价值，鲜食玉米成为当前种植业中最具发展潜力的新兴产业之一。鲜食玉米可以为居民提供营养健康的膳食纤维，满足人们健康生活的需要。但是随着全球极端天气增加，洪涝灾害造成作物产量损失成为威胁粮食安全的主要危害之一，水淹胁迫对鲜食玉米的生长和产量造成了严重影响。
3.玉米苗期对水分较为敏感，过量的水分使玉米根系处于水淹状态，根系无法从空气中吸收氧气，玉米从原来的有氧呼吸转变为无氧呼吸。水淹胁迫使玉米根毛和数量减少，玉米的叶片会出现不同程度的黄化现象，影响玉米的生育期、生物量和产量等。水淹胁迫条件对植物的伤害主要表现在渗透胁迫、离子毒害、营养失去平衡和氧化应激，它影响各种离子在植物体细胞内的分布，破坏植物体内离子平衡状态。植物遭受水淹胁迫时植物会通过形成一些渗透调节物质、关闭气孔、提高耐涝基因的表达等一系列的响应机制来适应水淹逆境。
4.鲜食玉米属于玉米的胚乳突变类型，前人的研究主要是淹涝对普通玉米杂交种的根系、叶片、产量的影响，但是对鲜食玉米水淹胁迫的评价方法尚未建立。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种检测鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法及其应用，本发明建立了鲜食玉米耐水淹评价指标，能够客观的反映鲜食玉米自交系耐水淹强弱的程度。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种鉴定鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法，包括以下步骤：
8.1)将待检测的鲜食玉米幼苗分别进行水淹处理和在正常水分条件下培养，分别得到处理组和对照组鲜食玉米；
9.2)分别测定处理组和对照组鲜食玉米的株高、地上部分干重和根干重，按照如下公式分别计算所述株高、地上部分干重和根干重的相对变化率；
[0010][0011][0012]
[0013]
3)按照如下公式计算鲜食玉米的耐水淹指数，所述耐水淹指数越低，表示鲜食玉米的耐水淹程度越强；
[0014][0015]
优选的，所述待检测的鲜食玉米幼苗为两叶一心期的鲜食玉米幼苗。
[0016]
优选的，所述水淹处理的时间为7～9d；所述水淹处理时水位淹没土壤表面的高度为5～8cm。
[0017]
优选的，在计算鲜食玉米的耐水淹指数后，还包括对所述耐水淹指数进行分级；
[0018]
所述分级的标准包括：当所述耐水淹指数≤7％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极强，表示为
ⅴ
级；当所述7％<耐水淹指数≤14％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为强，表示为ⅳ级；当所述14％<耐水淹指数≤28％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为中，表示为ⅲ级；当所述28％<耐水淹指数≤35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为弱，表示为ⅱ级；当所述耐水淹指数>35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极弱，表示为ⅰ级。
[0019]
优选的，所述鲜食玉米包括鲜食玉米自交系。
[0020]
本发明还提供了上述方案所述的方法在鉴定和/或筛选耐水淹胁迫鲜食玉米种质中的应用。
[0021]
优选的，所述鲜食玉米包括鲜食自交系。
[0022]
优选的，所述应用包括以下步骤：
[0023]
采用上述方案所述的方法测定鲜食玉米的耐水淹指数，以耐水淹指数≤14％的鲜食玉米作为耐水淹胁迫鲜食玉米种质。
[0024]
本发明提供了一种检测鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法，本发明利用鲜食玉米苗期进行水淹胁迫后与耐水淹能力相关生长指标(株高、地上部分干重和根干重)的变化，建立鲜食玉米耐水淹评价指标，能够客观的反映鲜食玉米耐水淹强弱的程度。本发明的方法操作简便、评价结果直观、可靠，能够快速鉴定和筛选出耐水淹鲜食玉米种质。
附图说明
[0025]
图1为实施例1的流程图；
[0026]
图2为鲜食玉米自交系苗期水淹胁迫后叶片光合指标比较结果；其中，a：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下叶片净光合速率的比较；b：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下叶片胞间二氧化碳浓度的比较；c：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下叶片气孔导度的比较；d：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下叶片蒸腾速率的比较；数值为三个重复的平均值。
[0027]
图3为鲜食玉米自交系苗期水淹胁迫后生理指标分析；其中，a：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下丙二醛含量的比较；b：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下过氧化氢含量的比较；c：耐水淹玉米自交系和水淹敏感玉米自交系水淹胁迫下脯氨酸含量的比较；数值为三个重复的平均值；
[0028]
图4为鲜食玉米自交系水淹胁迫下水淹相关标记基因的real
‑
time pcr结果，其中，a：zmp4h4在耐水淹和水淹敏感自交系的相对表达量；b：sicyp51在耐水淹和水淹敏感自交系的相对表达量；c：zmbri在耐水淹和水淹敏感自交系的相对表达量；内参基因为玉米的
gapdh基因；图中的值为三个重复的平均值。
具体实施方式
[0029]
本发明提供了一种检测鲜食玉米耐水淹强弱程度的方法，包括以下步骤：
[0030]
1)将待检测的鲜食玉米幼苗分别进行水淹处理和在正常水分条件下培养，分别得到处理组和对照组鲜食玉米；
[0031]
2)分别测定处理组和对照组鲜食玉米的株高、地上部分干重和根干重，按照如下公式分别计算所述株高、地上部分干重和根干重的相对变化率；
[0032][0033][0034][0035]
3)按照如下公式计算鲜食玉米的耐水淹指数，所述耐水淹指数越低，表示鲜食玉米的耐水淹程度越强；
[0036][0037]
在本发明中，所述待检测的鲜食玉米幼苗为两叶一心期的鲜食玉米幼苗，两叶一心期对鲜食玉米幼苗进行处理利于鉴定出表型。
[0038]
在本发明中，所述水淹处理的时间优选为7～9d，避免水淹处理时间过长造成鲜食玉米幼苗死亡；所述水淹处理时水位淹没土壤表面的高度优选为5～8cm。
[0039]
在本发明中，在计算鲜食玉米的耐水淹指数后，优选的还包括对所述耐水淹指数进行分级；
[0040]
所述分级的标准包括：当所述耐水淹指数≤7％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极强，表示为
ⅴ
级；当所述7％<耐水淹指数≤14％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为强，表示为ⅳ级；当所述14％<耐水淹指数≤28％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为中，表示为ⅲ级；当所述28％<耐水淹指数≤35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为弱，表示为ⅱ级；当所述耐水淹指数>35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极弱，表示为ⅰ级。
[0041]
在本发明中，所述鲜食玉米优选的包括鲜食玉米自交系。
[0042]
在本发明中，所述水淹处理优选的采用盆栽方法进行。
[0043]
本发明还提供了上述方案所述的方法在鉴定和/或筛选耐水淹胁迫鲜食玉米种质中的应用。
[0044]
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：
[0045]
采用上述方案所述的方法测定鲜食玉米的耐水淹指数，以耐水淹指数≤14％的鲜食玉米作为耐水淹胁迫鲜食玉米种质。
[0046]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属
于本发明保护的范围。
[0047]
实施例1
[0048]
流程图参见图1。
[0049]
1、鲜食糯玉米自交系水淹胁迫处理。164份鲜食糯玉米自交系，由上海市农业科学院玉米中心提供。选取大小均匀、饱满的糯玉米籽粒用清水反复冲洗干净，用滤纸吸干水分备用。将糯玉米自交系种植在人工气候室，人工气候室条件：温度为28
±
1℃/22
±
1℃(昼/夜)，光照周期为14h/10h(昼/夜)。水淹胁迫采用盆栽方法，将准备好的玉米种子放入玻璃培养皿中进行发芽，种植玉米幼苗的盆钵中装草炭土、蛭石和珍珠岩(3：1：1)，将盆钵放入长方体塑料盒中。挑选发芽整齐一致的玉米种子移栽，每个盆钵种5株。设立对照组与处理组，每组设置3个重复。处理组在糯玉米玉米自交系幼苗长至两叶一心期时进行为期7d的水淹处理，水淹处理时水位淹没土壤表面5cm以上，对照组一直正常水分条件培养。
[0050]
2、鲜食糯玉米自交系耐水淹胁迫指标测定。水淹处理结束后进行指标测定，用尺子测量鲜食糯玉米自交系的株高，每个处理取3株，3个重复取平均值。将每株幼苗的根和地上部分开，置于烘箱中用75℃烘干至恒重，称取干重。计算株高、地上部分干重和根干重的相对变化率大小。株高相对变化率(％)＝(对照植株株高值
‑
水淹胁迫后植株株高值)/对照植株株高值
×
100％。地上部分干重相对变化率(％)＝(对照植株地上部分干重值
‑
水淹胁迫后植株地上部分干重值)/对照植株地上部分干重值
×
100％。根干重相对变化率(％)＝(对照植株根干重值
‑
水淹胁迫后植株根干重值)/对照植株根干重值
×
100％。计算结果见表1。
[0051]
3、鲜食糯玉米自交系耐水淹指数计算方法。公式＝(株高相对变化率+地上部分干重相对变化率+根干重相对变化率)/3
×
100％。依据自交系耐水淹指数进行分级，分级的标准为：当所述耐水淹指数≤7％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极强，表示为
ⅴ
级；当所述7％<耐水淹指数≤14％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为强，表示为ⅳ级；当所述14％<耐水淹指数≤28％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为中，表示为ⅲ级；当所述28％<耐水淹指数≤35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为弱，表示为ⅱ级；当所述耐水淹指数>35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极弱，表示为ⅰ级。
[0052]
4、鲜食糯玉米自交系耐水淹胁迫能力评价。根据自交系耐水淹指数计算结果，按照所述的分级标准对鉴定的鲜食糯玉米自交系进行分级，结果见表1，得出自交系耐水淹胁迫的能力大小。
[0053]
表1 164份供试糯玉米耐水淹胁迫鉴定结果及耐水淹性分级结果
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
从表1可以看出，依据此发明分级标准，耐水淹胁迫
ⅴ
级的糯玉米自交系有13份，占所有供试材料的7.93％；耐水淹胁迫ⅳ级的糯玉米自交系有37份，占所有供试材料的22.56％；耐水淹胁迫ⅲ级的糯玉米自交系有74份，占所有供试材料的45.12％；耐水淹胁迫
ⅱ
级的糯玉米自交系有26份，占所有供试材料的15.85％；耐水淹胁迫ⅰ级的糯玉米自交系有14份，占所有供试材料的8.54％。
[0062]
根据表1的糯玉米自交系耐水淹胁迫能力的分级结果，可以选择耐水淹胁迫能力较强的糯玉米作为育种材料，用于培育耐水淹糯玉米新品种。
[0063]
实施例2
[0064]
1、鲜食甜玉米自交系水淹胁迫处理。37份鲜食甜玉米自交系，由上海市农业科学院玉米中心提供。选取大小均匀、饱满的甜玉米籽粒用清水反复冲洗干净，用滤纸吸干水分备用。将甜玉米自交系种植在人工气候室，人工气候室条件：温度为28
±
1℃/22
±
1℃(昼/夜)，光照周期为14h/10h(昼/夜)。水淹胁迫采用盆栽方法，将准备好的玉米种子放入玻璃培养皿中进行发芽，种植玉米幼苗的盆钵中装草炭土、蛭石和珍珠岩(3：1：1)，将盆钵放入长方体塑料盒中。挑选发芽整齐一致的玉米种子移栽，每个盆钵种5株。设立对照组与处理组，每组设置3个重复。处理组在甜玉米玉米自交系幼苗长至两叶一心期时进行为期7d的水淹处理，水淹处理时水位淹没土壤表面5cm以上，对照组一直正常水分条件培养。
[0065]
2、鲜食甜玉米自交系耐水淹胁迫指标测定。水淹处理结束后进行指标测定，用尺子测量鲜食甜玉米自交系的株高，每个处理取3株，3个重复取平均值。将每株幼苗的根和地上部分开，置于烘箱中用75℃烘干至恒重，称取干重。计算株高、地上部分干重和根干重的相对变化率大小。株高相对变化率(％)＝(对照植株株高值
‑
水淹胁迫后植株株高值)/对照植株株高值
×
100％。地上部分干重相对变化率(％)＝(对照植株地上部分干重值
‑
水淹胁迫后植株地上部分干重值)/对照植株地上部分干重值
×
100％。根干重相对变化率(％)＝(对照植株根干重值
‑
水淹胁迫后植株根干重值)/对照植株根干重值
×
100％。计算结果见表2。
[0066]
3、鲜食甜玉米自交系耐水淹指数计算方法。公式＝(株高相对变化率+地上部分干重相对变化率+根干重相对变化率)/3
×
100％。依据自交系耐水淹指数进行分级，分级的标准为：当所述耐水淹指数≤7％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极强，表示为
ⅴ
级；当所述7％<耐水淹指数≤14％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为强，表示为ⅳ级；当所述14％<耐水淹指数≤28％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为中，表示为ⅲ级；当所述28％<耐水淹指数≤35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为弱，表示为ⅱ级；当所述耐水淹指数>35％时，则判定鲜食玉米耐水淹性为极弱，表示为ⅰ级。
[0067]
4、鲜食甜玉米自交系耐水淹胁迫能力评价。根据自交系耐水淹指数计算结果，按照所述的分级标准对鉴定的鲜食甜玉米自交系进行分级，结果见表2，得出自交系耐水淹胁迫的能力大小。
[0068]
表2 37份供试糯玉米耐水淹胁迫鉴定结果及耐水淹性分级结果
[0069]
[0070][0071]
从表2可以看出，依据此发明分级标准，耐水淹胁迫
ⅴ
级的甜玉米自交系有3份，占所有供试材料的8.11％；耐水淹胁迫ⅳ级的甜玉米自交系有6份，占所有供试材料的16.22％；耐水淹胁迫ⅲ级的甜玉米自交系有18份，占所有供试材料的48.65％；耐水淹胁迫ⅱ级的甜玉米自交系有8份，占所有供试材料的21.62％；耐水淹胁迫ⅰ级的甜玉米自交系有2份，占所有供试材料的5.41％。
[0072]
根据表2的甜玉米自交系耐水淹胁迫能力的分级结果，可以选择耐水淹胁迫能力较强的甜玉米作为育种材料，用于培育耐水淹甜玉米新品种。
[0073]
实施例3
[0074]
1、鲜食玉米耐水淹自交系和不耐水淹胁迫自交系光合作用差异验证。
[0075]
玉米受到水淹胁迫后叶片变黄，气孔关闭，直接影响了玉米叶片的光合作用。从实施例1和2里面筛选的耐水淹能力极强及强的自交系中选取20份和耐水淹能力极弱和弱(水淹敏感)的鲜食玉米自交系选取20份检测了苗期水淹胁迫处理后叶片的光合作用相关指标，结果参见图2。结果表明耐水淹玉米自交系净光合速率平均值处理组比对照组减少了1.076μmol
·
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‑2·
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1，胞间二氧化碳浓度平均值处理组比对照组增加了49.1μmol/mol，气孔导度平均值处理组比对照组减少了8.5μmol
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1，蒸腾速率平均值处理组比对照组减少了0.322μmol
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‑2·
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1。净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率对照组与处理组之间均存在显著性差异。通过对水淹敏感鲜食玉米自交系光合指标分析结果显示，净光合速率平均值处理组比对照组减少了2.8765μmol
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1，胞间二氧化碳浓度平均值处理组较对照组增加了74.6μmol/mol，气孔导度平均值处理组较对照组减少了18.6μmol
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1，蒸腾速率平均值处理组较对照组减少了0.363μmol
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1。净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率对照组与处理组之间均存在极显著差异。
[0076]
耐水淹和水淹敏感鲜食玉米自交系在受到水分胁迫时，耐水淹玉米自交系处理组比对照组在净光合速率、胞间二氧化碳浓度和气孔导度这些指标上变化幅度较小。虽然耐水淹自交系在蒸腾速率指标上变化也较大，但是差异为显著性水平，而水淹敏感自交系变化差异达到了极显著差异，说明耐水淹自交系比水淹敏感自交系受到水淹胁迫时对叶片光合作用的影响较小。
[0077]
2、鲜食玉米耐水淹自交系和不耐水淹胁迫自交系生理指标差异验证。
[0078]
丙二醛、过氧化氢和脯氨酸是检测植物遇到胁迫后反应的重要生理指标，通过对耐水淹和水淹敏感鲜食玉米自交系检测苗期水淹胁迫处理后植株生理指标的分析结果表明，耐水淹鲜食玉米自交系在受到水淹胁迫后丙二醛含量处理组比对照组增加了0.1826μmol/l，差异不显著。水淹敏感自交系处理组比对照组增加了0.5181μmol/l，差异显著。耐水淹鲜食玉米自交系过氧化氢含量处理组比对照组增加了9.89μmol/l，差异显著。水淹敏感自交系过氧化氢含量处理组较对照组增加了16.27μmol/l，差异极显著。耐水淹鲜食玉米自交系脯氨酸含量处理组比对照组增加了3.39μg/g，差异显著。水淹敏感自交系脯氨酸含量处理组比对照组增加了2.37μg/g，差异显著。
[0079]
耐水淹和水淹敏感鲜食玉米自交系在水淹胁迫时，过氧化氢和脯氨酸的含量均有较大幅度的增加，耐水淹玉米自交系处理组与对照组之间丙二醛含量变化没有显著差异，说明耐水淹自交系胁迫后受到的伤害较轻。而过氧化氢含量在水淹敏感自交系处理组与对照组之间增加较大，说明水淹敏感自交系胁迫后受到的伤害比较严重。耐水淹玉米自交系脯氨酸含量增加比水淹敏感自交系增加较多，说明耐水淹自交系通过增加脯氨酸含量抵抗逆境。
[0080]
3、鲜食玉米耐水淹自交系和不耐水淹胁迫自交系耐涝相关标记基因real
‑
time pcr结果差异验证。
[0081]
挑选了已报道的耐涝相关基因zmp4h4、sicyp51、zmbri三个基因对水淹胁迫后耐
水淹和水淹敏感鲜食玉米自交系的表达量进行检测。zmp4h4是p4h基因家族成员，缺氧时p4h上调，受水淹胁迫诱导表达量升高。sicyp51基因是细胞色素p450基因家族成员，编码参与甾醇代谢途径的关键酶基因，受水淹胁迫诱导表达量升高。水分胁迫条件下，zmbri基因的表达水平随水分胁迫程度的加剧而下调，在玉米受到水淹胁迫时，zmbri基因表达受到抑制。由图4可以看出，zmp4h4在20份耐水淹自交系中水淹胁迫处理后表达量均有显著升高，处理组比对照组变化的倍数从2.16～19.22倍之间，平均倍数为6.18倍。zmp4h4在20份水淹敏感自交系中水淹胁迫处理后表达量也有升高，处理组比对照组变化的倍数从1.06～3.62倍之间，平均倍数为1.52倍。sicyp51在20份耐水淹自交系中水淹胁迫处理后表达量均有升高，处理组比对照组变化的倍数从1.18～5.57倍之间，平均倍数为2.43倍。sicyp51在20份水淹敏感自交系中水淹胁迫处理后表达量变化较少，变化的倍数从0.39～2.02倍之间，平均倍数为1.05倍。zmbri在20份耐水淹自交系中水淹胁迫处理后表达均被抑制，处理组比对照组表达量变化的倍数从1.20～2.73倍之间，平均倍数为1.64倍。zmbri在20份水淹敏感自交系中水淹胁迫处理后表达也被抑制，表达量变化的倍数从0.95～1.36倍之间，平均降低倍数为1.17倍。zmp4h4基因在所有耐水淹自交系中表达量上调的倍数较高。
[0082]
由以上实施结果可以看出，实施例1和2选出的20份耐水淹能力极强和强的鲜食玉米自交系对比选出20份耐水淹能力极弱和弱的鲜食玉米自交系在光合能力、生理指标以及水淹相关标记基因表达的结果都存在明显差异，说明按照本发明的方法选出的耐水淹能力极强和强的鲜食玉米自交系在生理及基因表达方面都有明显的耐水淹特性。因此证明本发明的方法的准确性。
[0083]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。