硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用

1.本发明涉及一种硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用，及一种用于防治番茄枯萎病的组合物，属于农业病害防控技术领域。


背景技术：

2.番茄枯萎病又称萎蔫病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(fusarium oxysproum f.sp.lycopersici(sacc.)snyder&hansen)引起的一种土传病害，该菌属半知菌番茄专化型真菌。枯萎病是一种世界性的重要病害，分布范围广泛，中国大部分地区都有发生，一般病株发病率3％
‑
5％，严重可达10％以上，甚至造成植株全部枯死。每年给番茄生产造成巨大的损失。枯萎病是茄科蔬菜一种典型的土传性病害，造成严重的连作障碍，该病主要从寄主的根部或茎基部的伤口侵入，侵入后在维管束内繁殖，向上部蔓延扩展，堵塞维管束，影响水分运输，从而造成植株萎蔫死亡，同时在侵染间还会产生毒素，造成植株细胞坏死，维管束坏死。
3.番茄枯萎病常发生在开花期以后，发病初期植株的中、下部叶片在中午时萎蔫，早晚恢复正常，随着病害的发展植株中上部更多叶片开始萎蔫，至最后全株叶片萎蔫发黄，整株枯死。发病中期植株茎基一侧出现水渍状黄褐色至暗褐色坏死条斑。空气潮湿时病部表现出少许的淡粉红色霉层，拔出病株，纵剖病茎，可见维管束变色。该菌可通过菌丝体或厚垣孢子在土壤中越冬，也可进行腐生生活，种子可携带病菌等，番茄枯萎病防治十分困难，一旦发生严重影响了番茄的产量和品质。
4.目前防治该病的主要方法有：生物防治、农业防治等措施。在防治过程中大量使用化学农药处理造成环境污染、农药残留等问题，严重危害着人类的健康发展。近年来随着农产品安全问题日益受到重视，农药安全观念发生了改变，枯萎病的防治亟待寻求新型安全高效的药剂。在国家农业供给侧结构性改革的背景下，拮抗微生物及其代谢产物对土壤病害防治成为热点，由于其培养方便、生产成本低、生态安全、专一性强等优点已成为防治土传病的首选。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用，及一种用于防治番茄枯萎病的组合物，硫代丁酸甲酯直接杀死病原菌，从而实现防控番茄枯萎的作用；该组合物来源于生防菌的天然产物，具有安全高效，低残留的特点，适合防控番茄枯萎病；在安全高效防控番茄枯萎病的同时，解决农药残留带来严重的环境污染问题，实现针对番茄枯萎病的绿色防控。
6.根据本技术的一个方面，提供了硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用。
7.根据本技术的另一个方面，提供了一种用于防治番茄枯萎病的组合物，所述组合物包含硫代丁酸甲酯。
8.在一些具体实施方案中，所述组合物还包含无水乙醇，其中硫代丁酸甲酯与无水
乙醇的质量比为1：1～5；优选的，所述硫代丁酸甲酯与无水乙醇的质量比为1：2。
9.在一些具体实施方案中，所述组合物的配置方法为：称取1000μg的丁酸甲酯液体、2000μg的无水乙醇液体，混合均匀，移至100ml的棕色容量瓶中用清水定容，震荡均匀即可使用。由于硫代丁酸甲酯及无水乙醇具有挥发性，配置的溶液要现用现配，避免挥发降解。
10.根据本技术的另一个方面，提供了硫代丁酸甲酯在调控番茄枯萎菌相关基因的表达中的应用。
11.根据本技术的另一个方面，提供了所述的组合物在调控番茄枯萎菌相关基因的表达中的应用。
12.在一些具体实施方案中，所述番茄枯萎菌相关基因选自actin、serp、folstua、folcts3和six基因的至少一种。
13.在一些具体实施方案中，所述调控番茄枯萎菌相关基因的表达为降低番茄枯萎菌相关基因的表达量。
14.在一些具体实施方案中，所述番茄枯萎菌相关基因的表达为番茄枯萎菌相关基因的mrna水平的表达或番茄枯萎菌相关基因的蛋白质水平的表达量。
15.根据本技术的另一个方面，提供了一种防治番茄枯萎病的方法，使用上述的组合物。所述组合物包含硫代丁酸甲酯和含无水乙醇，其中硫代丁酸甲酯与无水乙醇的质量比为1：1～5；优选的，所述丁酸甲酯和无水乙醇的质量比为1：2。
16.本发明的有益效果为：
17.1、本发明首次提出了硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用，硫代丁酸甲酯及无水乙醇均是生物天然产物，源自生物代谢的产物，对人类及环境无残留危害，安全性较高。
18.2、本发明提供的包含硫代丁酸甲酯的组合物，在培养基平板检测实验证实硫代丁酸甲酯溶液在浓度大于等于5mg/ml可以几乎100％的杀死番茄枯萎菌，具有显著的效果；在盆栽试验中，采用2mg/ml的me溶液处理对番茄枯萎的防治效果可以达到67.4％。在培养基平板检测及盆栽实验中组合物对番茄枯萎病表现出优良的防治效果。
19.3、本发明中组合物对番茄枯萎病具有优良的防控作用，且硫代丁酸甲酯和无水乙醇均是生物天然产物，源自生物代谢的产物，对人类及环境无残留危害，该方法有助于实现番茄枯萎病的绿色防控；同时保障蔬菜的无公害生产，解决农药超量残留等问题，具有巨大的应用潜力，适于农业发展需求。
附图说明
20.图1为不同浓度me溶液抑制枯萎病菌效果；其中，a为清水对照，b为0.1mg/ml的me溶液处理，c为5mg/ml的me溶液处理
21.图2为不同浓度me溶液杀枯萎病效果，其中，a为清水对照，b为0.1mg/ml的me溶液处理，c为1mg/ml的me溶液处理，d为5mg/ml的me溶液处理。
22.图3为me溶液处理对番茄枯萎病相关基因qpcr检测结果。
具体实施方式
23.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
24.下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.本发明的下列实施例中，硫代丁酸甲酯(c5h
10
o
s
)购买于化学物质，购买于北京华威锐科化工有限公司，厂家为九鼎化学，其纯度为98％，mw:118.20。外观与性状：透明黄色液体具有刺激作用。外观与性状：透明黄色液体，微溶于水，密度：0.966g/ml at 25℃，沸点：142
‑
143℃，757mm hg，折射率：n20/d 1.461，蒸汽压：5.87mmhg 25℃。
26.实施例1硫代丁酸甲酯对枯萎菌的抑制作用
27.1.病原菌的分离和纯化
28.1.1pda培养基
29.去皮的马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，定容至1l。
30.1.2硫代丁酸甲酯溶液(me)的配制
31.将硫代丁酸甲酯及无水乙醇按照1：2的质量比配制成母液，然后按照需求采用蒸馏水配制为相应的浓度。
32.1.2番茄枯萎病菌的分离和鉴定
33.以常规组织分离法，从发病的番茄茎部的褐色维管束组织中分离番茄枯萎病原菌(fusarium oxysproum f.sp.lycopersici)。具体操作包括：病健交界处取少许组织，经5％的次氯酸钠消毒1min后，转移至75％的酒精中处理1min，最后转移至无菌水中漂洗3次。至于pda培养基上。在25℃的培养箱中培养2
‑
3天，提取菌株的dna，采用sp13f(gtcagtccattggctctctc)和sp13r(tccttgacaccatcacagag)，及sp23f(cctcttgtctttgtctcacga)和
34.sp23r(gcaacaggtcgtggggaaa)两对引物进行pcr检测，鉴定枯萎病的种类，经过pcr鉴定分析，该菌株sp13f/r引物对可以得到一条445pb的条带经过对比，与番茄枯萎病菌的特异序列(fusarium oxysporum f.sp.lycopersici，id:xm_018395501.1)的同源性达到了100％。采用sp23f/r不能扩增出条带，结合两对引物的扩增结果，及对比结果鉴定该枯萎病菌为番茄枯萎病原菌(fusarium oxysproum f.sp.lycopersici)1号生理小种菌株。经过鉴定后的番茄枯萎治病菌株，转移至pda斜面上保存于4℃冰箱，用于测试分析。
35.1.3抑菌实验
36.用融化后的pda培养基中在温度降至约40℃时加入me母液，使pda培养基中的me终浓度为10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml(以硫代丁酸甲酯量为准)，倒培养皿(9
×
9cm)中，倒置放置并快速冷却，防止me溶液挥发。利用无菌的打孔器将培养一周左右的番茄枯萎菌的菌饼(0.5cm)放置在培养皿的中央，在28℃下培养箱中避光培养，7天后测量枯萎菌的直径，计算抑菌率及校正抑菌率。以清水及无水乙醇(10mg/ml)为对照，每个处理3皿，试验重复3次。
37.在me的不同浓度下枯萎菌的生长情况不同，但随着浓度的增大菌丝的生长速度减慢，在10mg/ml、5mg/ml的me溶液中枯萎菌几乎没有长，抑菌效果达到了100％，说明me化合物使对番茄枯萎菌有明显的抑制作用(图1)。在2mg/ml处理中，me溶液对枯萎菌的校正抑制作用达到了93.3％，而在0.1％mg/ml处理中校正抑菌效果只有20.1％，说明抑菌效果与浓度之间存在正相关性。具体数据建下表1。
38.抑菌效果计算公式：
[0039][0040][0041]
表1不同浓度药剂抑菌效果(菌落直径cm)
[0042][0043]
实施例2硫代丁酸甲酯对枯萎病的杀死作用
[0044]
采用移液器取硫代丁酸甲酯液体me放入1.5ml的离心管中，并与无水乙醇按照1:2的比例进行混合配置，震荡均匀，以硫代丁酸甲酯量为标准，分别采用蒸馏水配制成0.1mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的溶液，震荡均匀即可使用。由于硫代丁酸甲酯及无水乙醇具有挥发性，配置的溶液要现用现配，避免挥发降解。
[0045]
将番茄枯萎病菌在pda培养基上活化培养，然后在液体pd培养中震荡培养(150rpm)，在培养7d后，采用灭菌的双层纱布过滤掉菌丝，只保留病菌孢子，形成孢子悬浮液，在显微镜下检测孢子的浓度，然后吸取50ul的悬浮液，移至1.5ml的离心管中，用无菌水调整孢子浓度约1
×
107cfu/ml。分别取10μl菌液加入到配制不同浓度的me溶液1ml中，震荡均匀，处理5h，然后分别吸取20μl涂布在pda平板上，在28℃下避光培养，在3
‑
7天时检测平板上的菌落数量。试验中以清水及无水乙醇(10mg/ml)作为对照。每个处理3皿，试验重复3次。
[0046]
在培养3d后检测平板上的菌落生长情况及数量，发现在清水对照中，枯萎病菌的菌落长满培养皿，每皿pda平板上的菌体数量达到了6.7
×
102cfu，在整个培养皿上连成了整体，在无水乙醇(10mg/ml)处理中菌落生长情况与清水没有显著差异，菌落菌连成整体。在10mg/ml、5mg/ml的me溶液处理中没有长出枯萎病菌菌落，说明在这些浓度下me溶液可以有效的杀死枯萎病病菌。在1mg/ml的组合溶液中只有少数的菌落，平均为每皿4.7个菌落，杀菌效果达到了99.3％。在0.1mg/ml的处理中每皿大约为27.3个菌落，杀菌效果达到了95.9％。试验验证进一步的说明me溶液在大于1mg/ml时对枯萎病原菌具有良好的防控作用。具体见下表2及图2。
[0047]
杀菌效果计算公式：
[0048][0049]
表2不同浓度处理杀菌效果(cfu/皿)
[0050][0051]
实施例3me对枯萎病基因表达的抑制作用分析
[0052]
采用移液器取硫代丁酸甲酯液体放入1.5ml的离心管中，并与无水乙醇按照1:2的质量比例进行混合配置，震荡均匀，以硫代丁酸甲酯量为标准，分别采用蒸馏水配制成2mg/ml的溶液，震荡均匀即可使用。由于硫代丁酸甲酯及无水乙醇具有挥发性，配置的溶液要现用现配，避免挥发降解。
[0053]
将番茄枯萎病菌在pda培养基上活化培养，然后在固体pda培养基上培养5d后，采用灭菌的手术刀，轻轻刮取pda表面的菌体(包含菌丝及孢子)50mg，放入2.0ml的离心管中，加入1.5ml的2mg/ml的me溶液浸泡处理4h，然后采用离心机12000rpm，4℃离心5min，去除上清液，保留菌体，采用无菌水悬浮冲洗2次，充分去掉残余me溶液，然后再次12000rpm，4℃离心5min，去掉上清，沉淀的菌体采用天根生化(tiangen)的总rna提取试剂盒提取样品总rna。采用takara的反转录试剂盒(primerscript rt reagen kit)获得cdna，定容至50μl。分别取1μl的样品，针对靶基因进行表达量分析，采用takara的qpcr试剂盒(premix ex tagⅱ)进行基因表达量分析，基因表达分析采用绝对定量分析(
△
ct法)。试验中以清水模拟处理作为对照。试验重复3次。基因表达差异分析采用清水对照与me处理的相对表达分析(1：2
‑△
ct
)。检测的基因名称、特征及引物信息见表3，其中肌动蛋白(actin)为代表番茄枯萎病菌的活性基因、丝氨酸蛋白酶(serp)。另外还检测了番茄枯萎病菌的致病相关基因，包括枯萎病菌的几丁质酶基因folcts3，致病相关转录因子基因folstua，枯萎病菌在番茄木质部的分泌蛋白基因six1
‑
4。
[0054]
通过qpcr检测结果(图3)看出，在2mg/ml的me溶液浸泡处理4h后，番茄枯萎病菌的检测基因都呈现出显著降低现象(表4)，活性基因actin以及丝氨酸蛋白酶基因serp显著降低，分别降低了7.16倍及4.38倍。同时，番茄枯萎病菌的qpcr检测也证实了致病相关基因被显著降低，其中致病相关转录因子基因folstua降低了43.11倍，几丁质酶基因folcts3降低了10.48倍。通过qpcr检测结果看出枯萎病菌木质部分泌蛋白基因six在正常情况下与活性基因actin存在巨大的差异，actin的ct值为20.01，而枯萎病木质部分泌蛋白基因six的ct值均大于31，证实了在离体情况下枯萎病分泌蛋白基因six表达量是很低的，同时在me溶液处理后不同基因表大量下降程度也存在差异，其中six1降低了4.32倍，而six2
‑
4降低不显
著(小于2倍)。基因表达量分析试验进一步的说明me溶液对枯萎病原菌活性及致病性具有良好的抑制作用。
[0055]
表3荧光定量检测引物
[0056][0057][0058]
表4基因表达荧光定量差异值分析
[0059]
geneck对照me处理
△
ct2
‑△
ct
ck：meactin20.0122.852.841/7.161:0.14folcts328.1931.583.391/10.481:0.10folstua23.5128.945.431/43.111:0.02serp30.9933.122.131/4.381:0.23six131.7633.872.111/4.321:0.23six233.2734.070.81/1.741:0.57six332.2332.630.41/1.321:0.76six432.4533.020.571/1.481:0.67
[0060]
实施例4me对枯萎病的防控效果盆栽鉴定试验
[0061]
将番茄枯萎菌在pda平板培养基上活化培养7天后，挑取少许菌丝至pl液体培养基24℃～26℃的恒温震荡培养箱中培养2
‑
3天，过滤收集孢子，利用灭菌的蒸馏水制成4
×
106个孢子/ml的接种悬浮液，即为接种的孢子悬浮液。
[0062]
将“丽春”番茄种子消毒后，在28℃催芽，当种子露白时种植在育苗盘中，培养基质为消毒的草炭蛭石混合物，进行正常的管理，当番茄苗4片真叶时，采用浸根接种方法，将番茄苗轻轻拔起后，利用清水冲洗干净，然后整个根系浸泡在接种的孢子悬浮液中10min，然后将番茄苗种植在培养钵中(9
×9×
10cm)，每钵1株苗，me处理组中每钵浇灌2mg/ml me溶
液10ml，每个处理10株，重复3次。阴性对照为加入每钵浇灌10ml清水；同时设置80％菌多灵(上海迪盖)500倍液，每钵浇灌10ml上述菌多灵溶液为药剂处理阳性对照。接种后的温度为25℃～30℃，土壤湿度为85％～90％，每天的光照12h～14h，正常的栽培管理。在接种后约10天进行调查。
[0063]
番茄枯萎病的病情分级标准为：0级，无症状；1级，1～2片子叶明显变黄、脱落；2级，1～2真片变成黄色或者全株叶片变成黄绿色，叶片下垂呈轻微萎蔫；3级，全株明显萎蔫或叶片严重变黄，植株生长受阻、稍矮化；4级，全株叶片严重萎蔫甚至枯死。通过发病情况统计病情指数，进一步的计算防治效果，通过如下公式计算。通过表5结果可以看出在2mg/ml的me溶液处理后，番茄枯萎病的病情指数明显降低，平均病情指数为27.5。而对照的病情指数达到了84.5。三次重复试验的防治效果达到67.4％，略低于多菌灵药剂处理70.4％，方差分析，两者差异不显著。盆栽接种试验结果进一步的说明硫代丁酸甲酯及无水乙醇组合溶液在番茄上防控枯萎具有良好的应用效果，为开发应用提供了依据。
[0064]
病情指数计算：
[0065]
调查每份鉴定材料的发病情况，根据病害症状分级描述，逐份材料进行调查，记载病情级别，计算出病情指数。
[0066]
病情指数按下列公式计算：
[0067][0068]
式中：∑
──
各病情级别代表数值与其相对应病情级别病株数乘积的总和；
[0069]
s
──
各病情级别代表数值；
[0070]
n
──
各病情级别病株数；
[0071]
n
──
调查总株数；
[0072]
m——最高病情指数。
[0073]
防治效果计算公式：
[0074][0075]
表5防控番茄枯萎病盆栽效果
[0076][0077]
以上对本发明所提供的硫代丁酸甲酯在防治番茄枯萎病中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员
来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。