一种利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验的方法

1.本发明涉及环境毒理学技术领域，具体涉及一种利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验的方法。


背景技术：

2.由于我国近年来经济快速发展以及资源的大量消耗，近岸海域作为大多数陆源排海污染物的汇总，污染严重，对环境中不同污染物进行有效监测很有必要。水生生态毒理学作为生态毒理学研究重点领域之一，水生生物的毒性试验通过测定污染物在短期或长期内对生物所产生的毒性作用来为环境污染物及污染程度提供重要的评价指标，对污染物的监测具有重要意义。
3.红鳍东方鲀作为中国本土物种，由于其经济价值高，并具有较强的温度与盐度耐受性，现已成为我国北方近海养殖的重要物种之一，主要分布于东海和黄渤海，是一种大型鲀类，属于一次性产卵类型，其稚鱼体长在1cm左右，方便记录死亡数以及体长体重，因此用于海洋鱼类毒性实验较为合适，通过对红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验，同时辅以溶剂的对照实验，综合考虑实验用水的理化条件，可得出可靠的数据，作为海水水质基准推导的数据来源之一是有价值的。
4.本发明针对现有实验方法的不足，充分考虑我国海洋水生态系统特征，通过现场试验，用小型生态体系代替大型体系，对各个理化因素进行严格控制，提供一种针对性强、精准高效的利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验的方法。


技术实现要素：

5.针对现有实验方法中的不足，充分考虑我国海洋水生态系统特征，根据不同物种不同污染物质予以差异性的规定和调整，提供了一种针对性强、精准高效的利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急性、慢性实验方法。依据该方法得到的急慢性实验数据更具有科学性和可靠性，更适合于后续海水水生生物水质基准值的推导。
6.一种利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急性毒性实验的方法，包括以下步骤：
7.(a1)准备经过滤的天然海水：
8.取天然海水，经由砂滤池、200-600目筛绢过滤，得到所述经过滤的天然海水；
9.(a2)驯养红鳍东方鲀：
10.选择体长为1
±
0.5cm健康红鳍东方鲀稚鱼用步骤(a1)得到的经过滤的天然海水驯养8-15天(优选10天)，驯养结束后需将鱼的肠道排空一天后再进行急性毒性实验；
11.(a3)配制第一有机污染物溶液：
12.(a3.1)对于不溶于海水的有机污染物：根据待检测的有机污染物的成分，选择合适的助溶剂，将所述有机污染物和所述助溶剂加入经过滤的天然海水中，配制第一有机污染物溶液，所述第一有机污染物溶液具有第一浓度；
13.(a3.2)对于溶于海水的有机污染物：将所述有机污染物加入经过滤的天然海水
中，配制第一有机污染物溶液，所述第一有机污染物溶液具有第一浓度；
14.(a4)准备对照组和有机污染物实验组：
15.准备若干尺寸相同的鱼缸，分别注入预设的对照组和有机污染实验组水样，其余条件保持相同，构成所述对照组和有机污染物实验组；其中：
16.所述对照组包括一个空白对照组，所述空白对照组的水样由步骤(a1)所述的经过滤的天然海水构成；
17.对于不溶于海水的有机污染物，所述对照组除所述空白对照组外，还设置有一个助溶剂对照组，所述助溶剂对照组的水样由步骤(a3.1)所述的助溶剂和步骤(a1)所述的经过滤的天然海水构成，其中，所述助溶剂的浓度不超过1ml/l；
18.所述有机污染物实验组包括5-8个(优选6个)有机污染物实验组，其中：
19.各有机污染物实验组水样具有不同的预设有机污染物浓度，且各有机污染物实验组水样中的预设有机污染物浓度均低于步骤(a3)中所述的第一浓度；
20.各有机污染物实验组的水样为：根据各有机污染物实验组的预设有机污染物浓度，由步骤(a3)中得到的第一有机污染物溶液和步骤(a1)中得到的经过滤的天然海水配制而成；
21.(a5)进行急性毒性实验：
22.向每个对照组和有机污染物实验组的鱼缸中投入至少7条步骤(a2)中得到的红鳍东方鲀进行为期3-6天(优选4天)的急性毒性实验，
23.其中，在急性毒性实验期间，利用加热棒保持各鱼缸水温为22
±
1℃，每天光照10-14h(优选12h)，黑暗10-14h(优选12h)，保持溶解氧大于60％饱和溶氧值，实验开始后，定时观察红鳍东方鲀的死亡情况并及时捞出死鱼，统计24h、48h、72h、96h红鳍东方鲀的死亡率，采集水样并分析各项水质指标；
24.(a6)进行结果分析：
25.分析红鳍东方鲀的死亡情况，根据每天记录的死亡数，使用统计软件，通过概率单位法得到半数致死浓度(lc
50
)及95％置信区间。
26.其中，所述步骤(a1)中，经所述过滤可过滤天然海水中大颗粒沉积物、浮游动物等。
27.其中，所述步骤(a4)中，对于各对照组和有机污染物实验组，均设置2-5个(优选3个)平行实验组。
28.其中，所述步骤(a4)中，在急性毒性实验前进行急性毒性预实验，通过预实验可得到浓度梯度较小的有机污染物浓度范围，从而根据预实验浓度及实验效果来确定各有机污染物实验组水样的预设有机污染物浓度。
29.其中，所述步骤(a4)中，各组鱼缸尺寸统一为5-7l(优选6.5l)，水样体积为1.5-2.5l(优选2l)。
30.其中，所述步骤(a5)中，各鱼缸对实验鱼的承载量为0.5-2g/l(优选1g/l)。
31.其中，所述步骤(a6)中，统计并计算各污染物实验组与对照组中红鳍东方鲀稚鱼的死亡率，对污染物浓度与红鳍东方鲀稚鱼的死亡率进行概率分析，由收敛信息确定是否找到最佳解，由参数估算值得到该模型中浓度对数值和死亡率的直线回归方程，由“置信限度”中概率为0.500之后对应的“估算值”即所对应的半数致死浓度(lc
50
)，以及“上下限”为
所对应的95％的置信区间。
32.本发明还提供了一种利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物慢性毒性实验的方法，包括以下步骤：
33.(b1)准备经过滤的天然海水：
34.取天然海水，经由砂滤池、200-600目筛绢过滤，得到所述经过滤的天然海水；
35.(b2)驯养红鳍东方鲀稚鱼：
36.选择体长为1
±
0.5cm健康红鳍东方鲀稚鱼用步骤(a1)得到的经过滤的天然海水驯养8-15天(优选10天)，驯养结束后即开始慢性毒性实验；
37.(b3)配制第二有机污染物溶液：
38.(b3.1)对于不溶于海水的有机污染物：根据待检测的有机污染物的成分，选择合适的助溶剂，将所述有机污染物和所述助溶剂加入经过滤的天然海水中，配制第二有机污染物溶液，所述第二有机污染物溶液具有第二浓度；
39.(b3.2)对于溶于海水的有机污染物：将所述有机污染物加入经过滤的天然海水中，配制第二有机污染物溶液，所述第二有机污染物溶液具有第二浓度；
40.(b4)准备对照组和有机污染物实验组：
41.准备若干尺寸相同的鱼缸，分别注入预设的对照组和有机污染实验组水样，其余条件保持相同，构成所述对照组和有机污染物实验组；其中：
42.所述对照组包括一个空白对照组，所述空白对照组的水样由步骤(b1)所述的经过滤的天然海水构成；
43.对于不溶于海水的有机污染物，所述对照组除所述空白对照组外，还设置有一个助溶剂对照组，所述助溶剂对照组的水样由步骤(b3.1)所述的助溶剂和步骤(b1)所述的经过滤的天然海水构成，其中，所述助溶剂的浓度不超过1ml/l；
44.所述有机污染物实验组包括4-7个(优选5个)有机污染物实验组，其中：
45.各有机污染物实验组水样具有不同的预设有机污染物浓度，且各有机污染物实验组水样中的预设有机污染物浓度均低于步骤(b3)中所述的第二浓度；
46.各有机污染物实验组的水样为：根据各有机污染物实验组的预设有机污染物浓度，由步骤(b3)中得到的第二有机污染物溶液和步骤(b1)中得到的经过滤的天然海水配制而成；
47.(b5)进行慢性毒性实验：
48.向每个对照组和有机污染物实验组的鱼缸中投入至少20条步骤(b2)中得到的红鳍东方鲀稚鱼进行为期至少21天的慢性毒性实验，
49.其中，在慢性毒性实验期间，每天记录红鳍东方鲀稚鱼死亡情况并及时捞出死鱼，每隔七天记录水质指标，实验结束对存活的鱼进行称重且测量体长；
50.整个慢性毒性实验期间，在养殖场鱼苗室中进行所述慢性毒性实验，前期(1-30日龄)鱼的体长较小，喂食褶皱臂尾轮虫，后期(大于30日龄)随着鱼的体长增长，喂食鱼饲料，每个鱼缸每天同样水质换水3/4，喂食并且清理剩余食物和废便，利用加热棒保持鱼缸水的温度为22
±
1℃，每天光照10-14h(优选12h)，黑暗10-14h(优选12h)，保持溶解氧大于60％饱和溶氧值；
51.(b6)进行分析计算：
52.记录各有机污染物实验组和对照组的红鳍东方鲀的死亡数以及体重体长，根据统计推算各有机污染物实验组的污染物浓度与红鳍东方鲀死亡率的关系，以此推出目标污染物对于红鳍东方鲀稚鱼的无效应浓度(noec)与低效应浓度(loec)。
53.其中，所述步骤(b1)中，经所述过滤可过滤天然海水中大颗粒沉积物、浮游动物等。
54.其中，所述步骤(b4)中，对于各对照组和有机污染物实验组，均设置2-5个(优选2个)平行实验组。
55.其中，所述步骤(b4)中，在慢性毒性实验前进行慢性毒性预实验，通过预实验可得到浓度梯度较小的有机污染物浓度范围，根据预实验浓度及实验效果来确定各有机污染物实验组水样的预设有机污染物浓度。
56.其中，所述步骤(b4)中，各组鱼缸尺寸统一为25-30l(优选27l)，水样体积为15-22l(优选20l)。
57.其中，所述步骤(b5)中，各鱼缸对实验鱼的承载量为0.5-2g/l(优选1g/l)。
58.其中，所述步骤(b6)中：
59.所述无效应浓度(noec)是指与对照组相比对受试生物未产生显著效应的最高受试物设置浓度，本发明中即是与对照组相比对红鳍东方鲀鱼未产生显著效应的最高预设有机污染物浓度；
60.所述低效应浓度(loec)是指与对照组相比对受试生物产生显著效应的最低受试物浓度，本发明中即是与对照组相比对红鳍东方鲀鱼产生显著效应的最低预设有机污染物浓度。
61.其中，所述步骤(b6)中，通过数据分析进行浓度-效应之间的单因素方差分析，进而推出所述有机污染物对于红鳍东方鲀稚鱼的无效应浓度(noec)与低效应浓度(loec)。
62.其中，所述步骤(b6)中，进行分析计算的具体流程包括：统计并计算各污染物实验组与对照组中红鳍东方鲀稚鱼的死亡率，对污染物浓度与红鳍东方鲀稚鱼的死亡率进行方差分析，比较统计量f和f0.05，当f《f0.05时，差异不显著，即未产生显著效应；反之，当f》f0.05时，差异显著，即产生了显著效应；由此，将f《f0.05时的最高预设有机污染物浓度记为无效应浓度(noec)；将f》f0.05时的最低预设有机污染物浓度记为低效应浓度(loec)。
63.本发明还提供了一种检测海洋水生态毒性的方法，其通过上述的毒性实验方法来实现。
64.本发明具有以下有益技术效果：
65.1.本实验选用本地养殖敏感物种，红鳍东方鲀在我国近海海水中广泛分布，列入《世界自然保护联盟》濒危物种红色名录，因此既具有研究价值，同时可以很好的表现水体毒性强度。
66.2.本实验采用经过滤的天然海水为载体进行实验，每个鱼缸设有增氧机、加热棒和光照灯来满足鱼的最适生活条件，几乎还原红鳍东方鲀在自然环境中的生存条件，因此该实验更具有代表性。
67.3.本实验中各组鱼缸大小统一，且对实验鱼的承载量小于1g/l，一方面容器溶液负荷量满足要求，另一方面采用玻璃鱼缸会很大程度降低有机污染物的吸附问题。
68.4.慢性实验方法采用半静态暴露方式，每天换水3/4，且换水装置为一种小功率自
吸泵，采用人工换水，换水过程不会影响生物正常游动，定时喂食，根据红鳍东方鲀不同大小形态喂食不同饵料，每天清理食物残渣、粪便，记录各个项水质指标，死亡率、存活稚鱼的体长以及体重，能够得到更为可靠的用于海水水生生物水质基准值推导的慢性方法。
69.5.在分析急性毒性数据时采用概率单位法，更为简单，对数据点只有点数的要求，不固定于特定的试验过程，并且可以使用不等试验间隔和不等量分组的试样。分析慢性毒性数据时进行浓度-效应之间的单因素方差分析，从统计学角度分析不同浓度-效应之间是否有显著性差异，使结果更加清晰准确。
70.附图简要说明
71.图1是本发明的实验流程图。
72.图2是本发明实施例中急性毒性实验的各有机污染物实验组与对照组的红鳍东方鲀稚鱼的浓度-效应曲线。
73.图3是本发明实施例中慢性毒性试验的各有机污染物实验组与空白对照组的红鳍东方鲀稚鱼的浓度-效应曲线。
具体实施方式
74.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
75.本发明涉及环境毒理学技术领域，具体是涉及一种利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验的方法。该方法适用于我国海洋地区大部分有机污染物如芳香烃、多溴联苯醚等。
76.下面以有机污染物2,2’4,4
’‑
四溴联苯醚(bde-47)为例，对本发明进行进一步的描述。
77.本实施例bde-47为例，利用红鳍东方鲀稚鱼进行生物急、慢性毒性实验。具体步骤如下：
78.1.红鳍东方鲀驯养：采用过滤天然海水，选择1
±
0.5cm健康红鳍东方鲀稚鱼用过滤天然海水饲养10天，驯养结束后将鱼的肠道排空一天后进行急性毒性实验，驯养结束后即可进行慢性实验。
79.2.急性毒性实验
80.(1)配制bde-47的二甲基亚砜(dmso)溶液，称取0.2g bde-47用dmso溶解，定容至100ml，配制成浓度2g/l的母液；
81.(2)过滤天然海水：使用潜水泵抽取蓄水池中经过初步沉淀的海水，通过砂滤池、300目筛绢来过滤天然海水中未沉淀的大颗粒沉积物与浮游动物等，在所有鱼缸中添加20l过滤后海水。
82.(3)设置八个实验组，其中一个为助溶剂对照组，一个为空白对照组，各组鱼缸大小统一为6.5l，实验溶液体积2l，各组都设有3个平行组，实验组的浓度分别为100.0μg/l、200.0μg/l、400.0μg/l、800.0μg/l、1600μg/l、3200μg/l的bde-47实验组，助溶剂对照组是助溶剂dmso对照组，空白对照组是过滤天然海水对照组，各组除水质不同外，其余条件均相同，各实验组和助溶剂对照组依次分别加入3.200ml、1.600ml、0.8000ml、0.4000ml、
0.2000ml、0.1000ml、0ml的bde-47的dmso溶液和0ml、0.1000ml、0.2000ml、0.4000ml、0.80000ml、1.600ml、3.200ml的dmso；
83.(4)对每个鱼缸投入10条步骤(1)所选的红鳍东方鲀稚鱼进行急性毒性实验，急性毒性实验期间，利用加热棒保持鱼缸水的温度为22
±
1℃，每天光照12h，黑暗12h，每天记录红鳍东方鲀稚鱼死亡情况并及时捞出死鱼，每天记录水质指标。
84.(5)分析计算：
85.统计并计算各污染物实验组与对照组中红鳍东方鲀稚鱼的死亡率，对污染物浓度与红鳍东方鲀稚鱼的死亡率进行概率分析，由收敛信息确定是否找到最佳解，由参数估算值得到该模型中浓度对数值和死亡率的直线回归方程，由“置信限度”中概率为0.500之后对应的“估算值”即所对应的半数致死浓度(lc
50
)，以及“上下限”为所对应的95％的置信区间。
86.下述表1列出了红鳍东方鲀急性毒性实验数据。
87.表1红鳍东方鲀稚鱼急性毒性实验数据
88.浓度(μg/l)初始数量(条)死亡数量(条)死亡率空白对照组3026.670％助溶剂对照组30310.00％100.030413.33％200.0301446.67％400.0301860.00％800.0301963.33％1600302170.00％3200302686.67％
89.3.慢性毒性实验
90.(1)配置bde-47的二甲基亚砜(dmso)溶液，称取0.2g bde-47用dmso溶解，定容至100ml，配置成浓度2g/l的母液；
91.(2)过滤天然海水：同急性毒性实验；
92.(3)设置七个实验组，其中一个助溶剂对照组，一个空白对照组，其余五个为不同预设有机污染物浓度的有机污染物实验组，各组鱼缸大小统一为27l，实验溶液体积20l，各组都设有2个平行组，实验组的浓度分别为2.780μg/l、5.004μg/l、9.000μg/l、16.21μg/l、29.18μg/l的bde-47实验组，助溶剂对照组是助溶剂dmso对照组，空白对照组是过滤天然海水对照组，各组除水质不同外，其余条件均相同，各实验组和助溶剂对照组依次分别加入292.0μl、163.0μl、90.10μl、50.10μl、27.80μl、0μl的bde-47的dmso溶液和0μl、27.80μl、50.10μl、90.10μl、163.0μl、292.0μl dmso；
93.(4)对每个鱼缸投入30条步骤(1)所选的红鳍东方鲀稚鱼进行慢性毒性实验，慢性毒性实验期间，每个鱼缸每天同样水质换水15l，前期鱼的体长较小，喂食褶皱臂尾轮虫，每个鱼缸喂食50ml轮虫，后期随着鱼的体长增长，喂食适量鱼饲料，并且及时清理剩余食物和粪便，利用加热棒保持鱼缸水的温度为22
±
1℃，每天光照12h，黑暗12h，每天记录红鳍东方鲀稚鱼死亡情况并及时捞出死鱼，每隔七天记录水质指标，21天实验结束后对存活的鱼进行称重且测量体长。
94.(5)分析计算：
95.统计并计算各污染物实验组与对照组中红鳍东方鲀稚鱼的死亡率，对污染物浓度与红鳍东方鲀稚鱼的死亡率进行方差分析，比较统计量f和f0.05，当f《f0.05时，差异不显著，即未产生显著效应；反之，当f》f0.05时，差异显著，即产生了显著效应；由此，将f《f0.05时的最高预设有机污染物浓度记为无效应浓度(noec)；将f》f0.05时的最低预设有机污染物浓度记为低效应浓度(loec)。
96.表2-4列出了慢性毒性实验的各项数据。
97.表2红鳍东方鲀慢性毒性实验死亡数量
98.浓度(μg/l)初始数量(条)死亡数量(条)死亡率空白对照组6046.700％助溶剂对照组60610.00％2.78060610.00％5.00460711.70％9.000601220.00％16.21601830.00％29.18602745.00％
99.表3红鳍东方鲀慢性毒性平均体重和体长
[0100][0101]
表4红鳍东方鲀慢性毒性实验结果的单因素方差分析
[0102]
浓度(μg/l)ff0.05空白+助溶剂0.36283.957空白+2.7800.44573.957空白+5.0040.92953.957空白+9.0005.1253.957空白+16.2112.033.957空白+29.1822.203.957
[0103]
根据表1红鳍东方鲀稚鱼急性毒性实验浓度-死亡数量效应关系，bde-47对红鳍东方鲀稚鱼的96h-lc
50
(半致死浓度)为387.2μg/l，且卡方检验显著性为0.28》0.15，因此在置信限度计算中并未使用任何异质性因子，其95％置信区间范围243.2～568.3μg/l。
[0104]
根据表2红鳍东方鲀稚鱼慢性毒性实验浓度-死亡数量效应关系以及表4红鳍东方鲀慢性毒性实验结果的单因素方差分析，推出目标污染物bde-47对于红鳍东方鲀稚鱼的无
效应浓度(noec)为5.004μg/l，低效应浓度(loec)为9.000μg/l。实验开始前，测得红鳍东方鲀稚鱼平均体重为0.0290g，平均体长为9.500mm，根据表3可知实验结束后红鳍东方鲀稚鱼的体重和体长均有显著变化，由实验浓度-死亡数量效应关系可明显得到有效结果，根据红鳍东方鲀稚鱼体重、体长变化亦可知bde-47对于红鳍东方鲀稚鱼显著毒性作用。
[0105]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。