一种促进华重楼幼嫩植株快速繁殖种苗的方法

1.本发明涉及一种华重楼由幼嫩植株快繁试管苗的方法，属于植物生物技术领域。


背景技术：

2.七叶一枝花（paris polyphylla）为百合科（lilliaceae）重楼属(paris)植物，是著名的传统药用植物，别名蚤休、重楼、七叶莲等。生于山坡林下及灌丛阴湿处，生于海拔1 800-3 200m的林下，喜温，喜湿、喜荫蔽，但也抗寒、耐旱，惧怕霜冻和阳光。生于有机质、腐殖质含量较高的砂土和壤土种植。七叶一枝花有多个变种，其中华重楼（paris polyphylla var. chinensis）和滇重楼（paris polyphylla var. yunnanensis ）是2020年版中国药典规定的重楼药材的两个正品基原物种。随着研究的不断深入，重楼的药理功效被逐渐挖掘，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效，以及抗肿瘤、抑菌、止血、调节机体免疫力和抗氧化等作用，是中国传统中药材，用于多味中成药配制，也被cfda批准可用于化妆品，随着药用价值的不断提高，华重楼的市场需求量不断加大，价格持续走高。为了满足市场的需求和保护其野生资源，众多科研工作者对华重楼进行种子打破休眠技术及组培快繁技术等方面展开了研究，但并未取得突破性进展。目前人工栽培主要以根茎切块繁殖和种子繁殖两种方式为主，前者存在成本高、易染菌溃烂、繁殖系数低甚至会造成种质退化等问题；而种子繁殖存在休眠期长，自然条件下必须经过两冬一夏完成形态学后熟和生理学后熟才能出苗，且出苗率低以及出苗不整齐，从播种到采收往往需要7-10年。因此，当前存在种苗资源相对稀缺现状，鉴于此，组培快繁技术一直是热点研究问题。
3.众多研究显示，华重楼内生真菌丰富，外植体消毒过程难以消毒彻底，虽然已有利用顶芽、块茎、种胚、子房、幼芽、幼苗等诱导出愈伤组织，但污染率高、愈伤组织诱导率很低、增殖慢以及难分化等问题依然存在，目前并未有使用组织培养获得大批种苗的报道。因此筛选合适的外植体以及最佳消毒方式，筛选适宜的诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基，进而快速有效的获得大量试管苗，能够缩短种苗培养时间，能够更快提供优质种苗，能够保护这一濒危药材植物的资源，并促进提高生产效率具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是解决现有技术中的不足，提供一种促进华重楼幼嫩植株快速繁殖种苗的方法。本发明以具有良好开发应用前景的华重楼为材料，通过打破种子双休眠技术培养幼嫩植株，再通过对幼嫩植株的消毒和诱导培养，得到萌芽的材料，再对得到萌芽的材料切割进行增殖培养，得到分蘖的丛生芽，进行生根和结鳞茎培养，生根后，于3-5月或10-11月份移栽驯化，并进行移栽基质的筛选，同时通过合理的施肥、水分、光照等管理，提高移栽成活率及种苗质量，进而快速获得大量华重楼的种苗，克服了常规分株繁殖慢以及利用常规外植体难获得组培快繁种苗等问题。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种促进华重楼幼嫩植株快速繁殖种苗的方法，包括如下步骤：
步骤1：华重楼幼嫩植株的获得将成熟未开裂的华重楼蒴果采收后，取出种子，去掉红色外种皮，用ga3浸种后低温沙藏80-90d，再将种子带沙转室温下放置60d；室温放置后，取出种子，再次用ga3浸种后低温沙藏80-90d，再将种子带沙转室温下放置60d，得到萌芽的华重楼幼嫩植株；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒取华重楼幼嫩植株，用浓度为0.5%的洗洁精水浸泡5-10 min，洗净表面沙子，于自来水下流水冲洗至少2 h或用0.05%、0.5%的多菌灵浸泡至少2h；流水冲洗或多菌灵浸泡后，转到无菌超净工作台，用75%乙醇浸泡45s，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1%的hgcl2或5%的naclo浸泡6-10min消毒，消毒后用无菌水冲洗5次，冲洗后用滤纸吸干表面水分，备用；步骤3：诱导培养将步骤2得到的消毒后的幼嫩植株，接种于诱导培养基上，置于组培室暗培养3-5 d，转移到弱光下进行光照培养60-90d，得到萌芽的材料；步骤4：增殖培养将步骤3得到的萌芽的材料，在无菌条件下，用解剖刀平均切割，转接到增殖培养基中，继续进行光照培养60-90d，得到分蘖的丛生芽；步骤5：生根及结鳞茎培养将步骤4得到的分蘖丛生芽，于分蘖点用解剖刀平均切割，转接到生根及结鳞茎培养基中，继续进行光照培养60-90d，得到生根及结块茎的试管苗；步骤6：移栽驯化将步骤5得到试管苗于3-5月或10-11月份移出培养室，带瓶炼苗7-10d天后，洗净根部，晾干水分，再于塑料大棚内种植到移栽基质中，移栽驯化时间12-14个月，得到华重楼种苗。
6.所述方法中，步骤1所述华重楼幼嫩植株的获得，ga3浸种浓度为0-200 mg/l，浸泡时间24 h，低温为5-8℃。
7.步骤3所述诱导培养基由ms或wpm、0-2.0mg/l的6-ba、0-2.5mg/l的 zt、0.1-0.5mg/l的naa和0-0.5mg/l的 ga3组成，ph为5.8；所述光照培养的温度为25
±
2℃，强度为300-500lux，光照时间12ｈ/d。
8.步骤4所述增殖培养基由ms或wpm、0-2.0mg/l的6-ba、0-1.5mg/l的zt、0-0.5mg/l的naa、0-0.5mg/l的ga3和0-1.0 mg/l的iaa组成，ph为5.8；所述光照培养的温度为25
±
2℃，强度为300-500lux，光照时间12ｈ/d。
9.步骤5所述生根及结鳞茎培养基由wpm、1.0-2.0 mg/l的zt和0.1-0.2 mg/l的naa 组成，ph为5.8；所述光照培养的温度为25
±
2℃，强度均为300-500lux，光照时间12ｈ/d。
10.步骤4中用解剖刀把萌芽的材料平均切割为2-4份，步骤5中于分蘖点用解剖刀平均切割为2-4份，采用该方法接种材料受到伤害较小，更容易恢复生长，也方便剪切丛生芽，提高了接种速度和接种成活率，省时省力。
11.步骤6所述移栽驯化栽培基质为泥炭土、珍珠岩和河沙按体积比为1:1:1组成的混
合物；或者为树皮、泥炭土和沙壤土按体积比为1:1:1组成的混合物；或者为泥炭土、黄壤土和珍珠岩按体积比为2:2:1组成的混合物。
12.步骤6所述移栽基质经多菌灵或甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒。移栽基质经消毒处理后，不含有毒、有害物质。
13.步骤6所述炼苗以散光为主，光照强度为300-500lx,温度为15-25℃，湿度为80%以上。
14.步骤6所述移栽驯化苗成活后，每半个月喷施叶面肥 1次，连喷3次；光强300-500lux；夏季温度保持15℃-35℃，冬季自然越冬，保持土壤湿润，4月-5月份出圃下地。
15.步骤6所述塑料大棚在全年用90%遮阳网进行遮阴，自动淋水系统淋水，湿度保持80%左右。
16.本发明方法中：ga3,赤霉素（gibberellic acid），也称为赤霉素a3，一种内源性的植物生长调节剂，在植物发育过程中的主要功能包括：刺激细胞分裂和延伸从而促进根茎快速延伸；对需要层积处理或者光照诱导发芽的一些植物，赤霉素可解除休眠，诱导有丝分裂和开始；提高种子萌发率；还能参与一些生理活动，比如向重力性，张力和开花式样等。低浓度的ga3可非常显著的调控植物生长，高浓度的ga3可能会产生相反的效果。
17.6-ba，即6-(n-苄基)氨基嘌呤，又称为6-苄基氨基嘌呤。是第一个人工合成的细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。
18.zt, 玉米素，一种天然的细胞分裂素，是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素，已能人工合成。促进愈伤组织发芽，促进座果，促进苗期生长及延缓叶片发黄，还对一些作物种子具有促进发芽的作用。
19.naa，即1-萘乙酸。易溶于有机溶剂，是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于生产商用促根粉或促根剂，也被广泛应用于植物插扦繁殖中。也常用于植物组织培养中。
20.iaa，吲哚-3-乙酸 indole-3-acetic acid，是内源生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用。诱导形成不定根，也常用于组培苗的增殖。
21.本发明方法在种子萌发，获得幼嫩植株的过程中，ga3具有打破种子休眠的作用。在诱导培养、增殖培养及生根培养的培养基配方中，ms和wpm为基础培养基，6-ba、zt促进细胞分裂和生长发育，iaa和naa具有促进根的生长和发育的作用。本发明的诱导培养基和增殖培养基配方可以极大促进块茎发育和芽的发育，诱导率98.33%；生根培养基配方可以极大促进生根壮苗和鳞茎膨大发育。增殖培养60-90d后增殖率达到3.75；生根培养基中，生根率96.67%，根系数平均3.84条，根长4.15 cm，鳞茎直径0.86 cm。
22.本发明方法幼嫩植株的消毒中，外植体室外清洗干净后，经多菌灵预处理对外植体起到有效消毒作用。多菌灵是一种广谱性杀菌剂，为高效低毒内吸性杀菌剂，有治疗和保护作用。对多种作物由真菌(如半知菌、多子囊菌)引起的病害有防治效果。可用于叶面喷雾、种子处理和土壤处理等。经过0.5%浓度的多菌灵浸泡预处理2h后，外植体再经过75%乙醇浸泡45 s，0.1% hgcl2消毒10 min，污染率控制在1.67%，诱导的萌芽长势较好。
23.本发明方法的移栽驯化中，10-11月为最佳移栽时间，种苗质量整齐，质量好。
24.本发明的最佳移栽基质为泥炭土、珍珠岩和河沙按质量比为1:1:1组成的混合物，移栽成活率达到88.33%。
25.本发明方法的移栽驯化中，全年需要90%的遮阳网遮阴，保持土壤湿润，含水量80%以上。
26.本发明的有益效果：（1）本发明方法利用一定浓度的ga3浸种后低温沙藏80-90d，室温下放置60d；再次利用ga3浸种后低温沙藏80-90d，室温下放置60d，得到萌芽的幼嫩植株，萌芽率达到92.5%，发芽时间缩短至少30d。
27.（2）本发明华重楼幼嫩植株预处理及消毒处理的简易方法，幼嫩植株经洗洁精浸泡5-10 min，洗净表面沙子，自来水冲洗干净，0.5%的多菌灵浸泡2h进行预处理；75%乙醇浸泡45s，0.1%hgcl2消毒10min，这种预处理及消毒效果最好，污染率仅有1.67%。
28.（3）本发明方法，包括诱导培养、增殖培养以及生根及结鳞茎培养等步骤。采用本发明方法繁殖华重楼种苗，诱导率98.33%，培养90d的增殖系数3.75，生根及结鳞茎率96.67%，根系数平均3.84条，根长4.15cm，鳞茎直径0.86 cm。可在短期内获得大量优良试管苗，比幼嫩植株直接移栽到室外获得的种苗不仅块茎大，而且数量变多。具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点，能在较短时间内获得大量华重楼种苗，对华重楼种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景非常广阔。
29.（4）本发明还建立了华重楼移栽驯化中栽培管理技术体系，包括移栽时间、遮光、控制淋水以及施肥等；最佳移栽基质为泥炭土、珍珠岩和河沙按体积比为1:1:1组成的混合物，移栽成活率高达88.33%。
30.（5）本发明方法简单，操作容易，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
附图说明
31.图1为实施例1华重楼种子萌芽情况；图2为实施例1华重楼外植体在诱导培养基90d的萌芽情况；图3为实施例1华重楼萌芽材料在增殖培养基中生长90d的生长情况；图4为实施例1华重楼丛生芽接种到生根和结鳞茎培养基中90d后的生长情况；图5为实施例1华重楼丛生芽接种到生根和结鳞茎培养基中150d后的生长情况。
具体实施方式
32.以下结合附图对本发明方法作进一步的说明，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
33.实施例1一种华重楼由幼嫩植株快繁试管苗的方法，包括如下步骤：步骤1：华重楼幼嫩植株的获得将成熟未开裂的华重楼蒴果采收后，取出种子，去掉红色外种皮，用50mg/l的ga3浸种24h后，5-8℃沙藏80d，再将种子带沙转室温下放置60d；室温放置后，取出种子，再次用50mg/l的ga3浸种24h后，5-8℃沙藏80d，再将种子带沙转室温下放置60d，得到萌芽的华重楼幼嫩植株，如图1所示；
步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒取华重楼幼嫩植株，用浓度为0.5%的洗洁精水浸泡5-10 min，洗净表面沙子，冲洗干净后，用浓度0.5%的多菌灵浸泡2h；多菌灵浸泡后，转到无菌超净工作台，用75%乙醇浸泡45s，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1%的hgcl2浸泡10min消毒，消毒后用无菌水冲洗5次，冲洗后用滤纸吸干表面水分；步骤3：诱导培养将步骤2得到的消毒后的幼嫩植株，接种于诱导培养基上，置于组培室暗培养3-5 d，再转移到弱光下进行光照培养90d，得到萌芽的材料，如图2所示；诱导培养基由wpm、2.0mg/l的zt和 0.1mg/l的naa组成，ph为5.8，诱导率为98.33%；光照培养的温度为25
±
2℃，光照强度300-500lux；光照时间12ｈ/d；步骤4：增殖培养将步骤3得到的萌芽材料，在无菌条件下，用解剖刀平均切割为2-4份，转接到增殖培养基中，继续进行光照培养90d，得到分蘖的丛生芽，增殖系数为3.75，如图3所示；增殖培养基由ms、2.0mg/l的6-ba和1.0 mg/l 的iaa组成,ph为5.8；光照培养的温度为25
±
2℃，强度为300-500lux，光照时间12ｈ/d；步骤5：生根及结鳞茎培养当步骤4得到的分蘖丛生芽，用解剖刀于分蘖点平均切割为2-4份，转接到生根及结鳞茎培养基中，继续进行光照培养90d，得到生根及结块茎的试管苗，如图4所示；但叶片展开需要培养120-150d，培养150d生长情况如图5所示；生根及结鳞茎培养基由wpm、0.1 mg/l的naa和2.0 mg/l的zt组成，ph为5.8；光照培养的温度为25
±
2℃，强度为300-500lux，光照时间12ｈ/d；步骤6：移栽驯化将步骤5得到的试管苗于10-11月份移出培养室，带瓶炼苗7-10d天后，洗净根部，晾干水分，再于塑料大棚内种植到移栽基质中，移栽驯化时间12-14个月，得到华重楼种苗。
34.炼苗以散光为主，光照强度为300-500lx,温度为15-25℃，湿度为80%以上。
35.移栽驯化的栽培基质为泥炭土、珍珠岩和河沙按体积比为1:1:1组成的混合物，移栽前经多菌灵或甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒，30d后统计，移栽成活率达到88.33%。
36.移栽驯化苗成活后后，每半个月喷施叶面肥 1次，连喷3次；遮阴网遮阴，保持80%左右的湿度，光照强度为300-500lux；夏季温度保持15℃-30℃，冬季自然越冬，保持土壤湿润，4月-5月份出圃下地。
37.实施例2步骤1：华重楼幼嫩植株的获得两次浸种用的ga3的浓度均为0 mg/l，即对照，用清水浸种24h；其它条件同实施例1；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒取华重楼幼嫩植株，用浓度为0.5%的洗洁精水浸泡5-10 min，洗净表面沙子，转入超净工作台下，用75%乙醇浸泡45s，接着用无菌水冲洗1次，再用0.1%的hgcl2浸泡10min消毒，消毒后用无菌水冲洗5次，冲洗后用滤纸吸干表面水分；
其它过程同实施例1；步骤3：诱导培养诱导培养基由ms、1.0mg/l的6-ba和0.25mg/l的naa组成，ph为5.8，诱导率为57.67%；其它条件同实施例1；步骤4：增殖培养增殖培养基由wpm、1.0 mg/l的zt和0.1mg/l的naa组成，ph为5.8，增殖系数为1.75；其它条件同实施例1；步骤5：生根及结鳞茎培养生根及结鳞茎培养基由wpm、1.5 mg/l的zt和 0.1 mg/l的naa 组成，ph为5.8；其它条件同实施例1；步骤6：移栽驯化将步骤5得到试管苗的移栽基质为树皮、泥炭土、沙壤土体积比为1:1:1，其它移栽条件同实施例1。
38.实施例3步骤1：华重楼幼嫩植株的获得两次浸种用的ga3的浓度均为100 mg/l；其它条件同实施例1；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒取华重楼幼嫩植株，用浓度为0.5%的洗洁精水浸泡5-10 min，洗净表面沙子，转入超净工作台下，用75%乙醇浸泡45s，接着用无菌水冲洗1次，再用5%的naclo浸泡10min消毒，消毒后用无菌水冲洗5次，冲洗后用滤纸吸干表面水分；其它过程同实施例1；步骤3：诱导培养诱导培养基由ms、2.0mg/l的6-ba和0.25mg/l的naa组成，ph为5.8，诱导率为70.0%；其它条件同实施例1；步骤4：增殖培养增殖培养基由wpm、1.5 mg/l的zt和0.1mg/l的naa组成，ph为5.8，增殖系数为2.25；其它条件同实施例1；步骤5：生根及结鳞茎培养生根及结鳞茎培养基由wpm、1.0 mg/l的zt和 0.1 mg/l的naa 组成，ph为5.8；其它条件同实施例1；步骤6：移栽驯化移栽驯化的栽培基质为泥炭土、黄壤土和珍珠岩体积比为2: 2:1组成的混合物，其它条件同实施例1。
39.实施例4
步骤1：华重楼幼嫩植株的获得两次浸种用的ga3的浓度均为200 mg/l；其它条件同实施例1；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒外植体室外洗净后，自来水流水冲洗2 h进行预处理；其它步骤同实施例1；步骤3：诱导培养诱导培养基由ms、0.1 mg/l的6-ba、0.5 mg/l的naa和0.5 mg/l的ga3组成，ph为5.8，诱导率为83.33%；其它步骤同实施例1；步骤4：增殖培养增殖培养基由ms、0.1 mg/l的6-ba和0.5 mg/l的 naa组成，ph为5.8，增殖系数为2.33；其它条件同实施例1；步骤5：生根及结鳞茎培养生根及结鳞茎培养基由wpm、2.0 mg/l的zt和 0.2 mg/l的naa 组成，ph为5.8；其它条件同实施例1；步骤6：移栽驯化移栽驯化的移栽时间为3-5月份；其它条件同实施例1。
40.实施例5步骤1：华重楼幼嫩植株的获得步骤同实施例1；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒外植体室外洗净后，0.05%的多菌灵预处理2h；其它步骤同实施例1；步骤3：诱导培养诱导培养基由wpm、1.5 mg/l的zt和0.1 mg/l的naa组成，ph为5.8，诱导率为96.67%；其它步骤同实施例1；步骤4：增殖培养增殖培养基由ms、0.1mg/l的6-ba、0.5 mg/l的 naa、0.5mg/l的 ga3组成，ph为5.8，增殖系数为3.25；其它条件同实施例1；步骤5：生根及结鳞茎培养其它步骤同实施例1；步骤6：移栽驯化移栽驯化时间为3-5月份，栽培基质为树皮、泥炭土、沙壤土按体积比为1:1:1的混合物；其它步骤同实施例1。
41.实施例6步骤1：华重楼幼嫩植株的获得同实施例1；步骤2：华重楼幼嫩植株的消毒
外植体经0.1%浓度的hgcl2消毒6 min，其它步骤同实施例1；步骤3：诱导培养诱导培养基由wpm、2.5 mg/l的zt和0.1 mg/l的naa组成，ph为5.8，诱导率为91.67%；其它步骤同实施例1；步骤4：增殖培养增殖培养基由ms、1.0 mg/l 的6-ba、1.0 mg/l的 iaa组成，ph为5.8，增殖系数为2.50；其它条件同实施例1；步骤5：生根及结鳞茎培养同实施例1；步骤6：移栽驯化移栽驯化时间为3-5月份，栽培基质为泥炭土、黄壤土和珍珠岩体积比为2: 2:1的混合物。
42.实施例对比试验如下：试验1：不同ga3浓度对华重楼萌发的影响 (n＝3) 。
43.试验2：不同预处理和消毒方式对消毒效果的影响。
44.试验3: 华重楼幼苗不同外植体诱导情况
。
45.试验4：华重楼丛生芽增殖培养 。
46.试验5：华重楼丛生芽生根及结鳞茎培养 。
47.试验6：华重楼组培苗移栽驯化以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。