一种MLL-AF4融合基因阳性人源化动物模型构建方法及应用与流程

一种mll-af4融合基因阳性人源化动物模型构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及人源化动物模型的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种mll-af4融合基因阳性人源化动物模型构建方法及应用。


背景技术：

2.mll(mixed lineage leukemia)基因异常是急性白血病中一种十分常见的染色体异常，其中由t(4；11)(q21；q23)易位而形成的mll-af4融合基因是急性淋巴细胞白血病中第二大常见的染色体异常，是一个独立的预后不良因素，mll-af4融合基因阳性的急性淋巴细胞白血病患者对常规化疗耐药，即使行异基因造血干细胞移植也容易复发，往往预后差、复发率高、死亡率高。该类白血病发病机制尚不清楚，且缺乏有效的治疗手段。
3.白血病小鼠模型是白血病发病机制研究以及药理学实验研究必不可少的重要工具。然而，目前较为成熟的mll-af4融合基因阳性的急性淋巴细胞白血病小鼠模型较少，且主要局限于mll-af4基因转染或者以细胞系构建的急性淋巴细胞白血病小鼠模型。这些建模方法较为复杂，且不能完全模拟病人体内的真实环境。因此，本领域存在对能够满足研发需求，并且构建方法更加简便易行的mll-af4融合基因阳性的白血病小鼠模型的需求。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，在第一个方面，本发明的目的在于提供一种mll-af4 融合基因阳性人源化动物模型的构建方法，所述方法包括将mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的骨髓单个核细胞和外周血单个核细胞注入免疫缺陷的动物体内。
5.在具体的实施方案中，本发明的所述免疫缺陷的动物为白消安预处理的动物。
6.在具体的实施方案中，本发明的所述免疫缺陷的动物为重度免疫缺陷的动物。
7.在具体的实施方案中，本发明的所述骨髓单个核细胞经尾静脉注射给免疫缺陷的动物。
8.在具体的实施方案中，本发明的所述外周血单个核细胞经腹腔注射给免疫缺陷的动物。
9.在具体的实施方案中，本发明的所述免疫缺陷的动物为免疫缺陷的小鼠、大鼠或猕猴。
10.在具体的实施方案中，本发明的方法包括：(1)细胞注射前用白消安对重度免疫缺陷动物进行预处理；(2)用淋巴细胞分离液分离出mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的骨髓单个核细胞和外周血单个核细胞；(3)取 2.4
×
106个骨髓单个核细胞和2.32
×
106个外周血单个核细胞分别经尾静脉和腹腔注射给所述重度免疫缺陷的动物体内。
11.在本发明的第二个方面，本发明的目的在于提供一种mll-af4融合基因阳性人源化动物的组织、体液、细胞及其破碎物或提取物，其特征在于，所述 mll-af4融合基因阳性人源化动物是使用第一方面所述的构建方法构建的。
12.在本发明的第三个方面，本发明的目的在于提供使用第一方面所述的构建方法构
建的mll-af4融合基因阳性人源化动物或其组织、体液、非干细胞的细胞及其破碎物或提取物在急性淋巴细胞白血病致病机理研究以及药物或疫苗研发中的应用。
13.与现有技术相比，本发明的方法构建的动物模型为白血病临床前药物试验、基因治疗及白血病发病机制研究提供可靠的实验工具，并且具有以下优点：
14.(1)利用病人来源的mll-af4融合基因阳性白血病细胞构建mll-af4 融合基因阳性人源化的白血病动物模型方法较为简便；
15.(2)构建的动物模型能够稳定、真实模拟病人体内的疾病状态和环境，这对研究mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病的发病机制以及靶向治疗具有重大意义，也是开展以mll-af4为靶点的基因编辑治疗的必须前提条件。
附图说明
16.图1a是采用本发明的方法构建的小鼠模型与对照组小鼠的脾脏和肝脏的对比照片；
17.图1b是患有mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病的病人的骨髓涂片以及采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的外周血涂片；
18.图1c是采用本发明的方法构建的小鼠模型的照片；
19.图2a是采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的肝脏组织病理学表现；
20.图2b是采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的脾脏组织病理学表现；
21.图2c是采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的肾脏组织病理学表现；
22.图2d是采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的肺脏组织病理学表现；
23.图2e是采用本发明的方法构建的小鼠模型和对照组小鼠的脑组织病理学表现。
24.图3a是患有mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病的病人骨髓cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果；
25.图3b是采用本发明的方法构建的小鼠模型的外周血cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果；
26.图3c是采用本发明的方法构建的小鼠模型的骨髓cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果；
27.图3图d是患有mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病的病人骨髓 cdna与白血病小鼠外周血cdna、白血病小鼠骨髓cdna的测序对比。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
29.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
31.实施例1：构建mll-af4融合基因阳性人源化的白血病小鼠模型
32.(1)取mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的骨髓血3ml 加入等体积
的pbs稀释混匀，再缓慢加入淋巴细胞分离液的上层，采用密度梯度离心法分离出mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的骨髓单个核细胞；取mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的外周血10ml 加入等体积的pbs稀释混匀，再缓慢加入淋巴细胞分离液的上层，采用密度梯度离心法分离出mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人的外周血单个核细胞；
33.(2)在细胞注射前12小时经重度免疫缺陷小鼠(ncg小鼠)腹腔注射 15mg/kg的白消安溶液进行预处理；取mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人2.4
×
106个骨髓单个核细胞和2.32
×
106个外周血单个核细胞分别经尾静脉和腹腔注射给经白消安预处理的ncg小鼠体内。
34.实施例2：对小鼠模型(f1代白血病小鼠)的检验
35.(1)注射细胞后第12周，将所构建的mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病小鼠与对照组小鼠对比，白血病小鼠的肝脏和脾脏对比对照组小鼠均明显肿大(参见图1a)。白血病小鼠外周血涂片可见其幼稚淋巴细胞，呈圆形或椭圆形，胞体较大，胞浆量较多，呈天蓝色，其形态大致与病人骨髓中的幼稚淋巴细胞类似(参见图1b)。同时，白血病小鼠出现弓背、全身脱毛、眼睑炎等体征(参见图1c)。
36.(2)采用流式细胞术检测ncg小鼠外周血和骨髓中人源白血病细胞的表达。
37.注射细胞后第7、8、9、10、11周采用流式细胞术检测ncg小鼠外周血 hcd45
+
hcd19
+
hhla-dr
+
细胞的比例分别为23.9％、42.8％、32.4％、45.2％、 32.4％。
38.(3)取白血病小鼠和对照组小鼠的肝、脾、肾、肺、脑组织进行病理学检查，白血病小鼠肝脏可见疑似淋巴细胞及白血病细胞浸润(参见图2a：1和2 分别为200、400倍镜下对照组小鼠肝脏病理切片；3和4分别为200、400倍镜下白血病小鼠肝脏病理切片)；与对照组小鼠相比，白血病小鼠脾脏未见淋巴细胞及白血病细胞浸润(参见图2b：1和2分别为200、400倍镜下对照组小鼠脾脏病理切片；3和4分别为200、400倍镜下白血病小鼠脾脏病理切片)；与对照组小鼠相比，白血病小鼠肾脏未见淋巴细胞及白血病细胞浸润(参见图2c：1 和2分别为200、400倍镜下对照组小鼠肾脏病理切片；3和4分别为200、400 倍镜下白血病小鼠肾脏病理切片)；白血病小鼠肺脏可见疑似淋巴细胞及白血病细胞浸润(参见图2d：1和2分别为200、400倍镜下对照组小鼠肺脏病理切片； 3和4分别为200、400倍镜下白血病小鼠肺脏病理切片)。图2e(1-4)：与对照组相比，白血病小鼠大脑未见淋巴细胞及白血病细胞浸润。
39.(4)pcr法检测mll-af4融合基因的表达(参见图3)，其中图3a是 mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人骨髓cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果，图3b是白血病小鼠外周血cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果，图c 是白血病小鼠骨髓cdna pcr扩增后琼脂糖电泳结果，图b和c中条带位置均与图a中一致。
40.(5)dna序列检测，图3d为mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病病人骨髓cdna、白血病小鼠外周血cdna、白血病小鼠骨髓cdna的测序对比(从上到下依次为病人骨髓cdna、白血病小鼠外周血cdna、白血病小鼠骨髓cdna)，序列一致性达95.80％。
41.经过上述实验可证实mll-af4融合基因阳性急性淋巴细胞白血病小鼠模型构建成功。
42.实施例3：小鼠模型的传代稳定性
43.(1)颈椎脱臼法处死f1代白血病小鼠，解剖并摘取其脾脏，将脾脏研磨后分离出脾脏单个核细胞，取f1代白血病小鼠9
×
106个脾脏单个核细胞经尾静脉注射给新的ncg小鼠，第10周时流式细胞术检测ncg小鼠外周血中人源白血病细胞的比例证实可以成功构建f2代mll-af4融合基因阳性白血病小鼠模型；颈椎脱臼法处死f1代白血病小鼠，解剖并摘取其股骨和胫骨，取出小鼠骨髓液分离出骨髓单个核细胞，取f1代白血病小鼠9
×
105个骨髓单个核细胞经尾静脉注射给新的ncg小鼠，第10周时流式细胞术检测ncg小鼠外周血中人源白血病细胞的比例，证实也可以成功构建f2代mll-af4融合基因阳性白血病小鼠模型；基因测序比对检测出mll基因重排。
44.(2)颈椎脱臼法处死f2代白血病小鼠，解剖并摘取其脾脏，将脾脏研磨后分离出脾脏单个核细胞，取f2代白血病小鼠5
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106个脾脏单个核细胞经尾静脉注射给新的ncg小鼠，第8周时流式细胞术检测ncg小鼠外周血中人源白血病细胞的比例证实可以成功构建f3代mll-af4融合基因阳性白血病小鼠模型。基因测序比对检测出mll基因重排。
45.(3)颈椎脱臼法处死f3代白血病小鼠，解剖并摘取其脾脏，将脾脏研磨后分离出脾脏单个核细胞，取f3代白血病小鼠5
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106个脾脏单个核细胞经尾静脉注射给新的ncg小鼠，第7周时流式细胞术检测ncg小鼠外周血中人源白血病细胞的比例证实可以成功构建f4代mll-af4融合基因阳性白血病小鼠模型。基因测序比对检测出mll基因重排。
46.(4)颈椎脱臼法处死f4代白血病小鼠，解剖并摘取其脾脏，将脾脏研磨后分离出脾脏单个核细胞，取f4代白血病小鼠5
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106个脾脏单个核细胞经尾静脉注射给新的ncg小鼠，第5周时流式细胞术检测ncg小鼠外周血中人源白血病细胞的比例证实可以成功构建f5代mll-af4融合基因阳性白血病小鼠模型。基因测序比对检测出mll基因重排。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解，在本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。