1.本发明属于花卉种质制备技术领域，特别是涉及一种抗根腐病红掌种质的制备方法及应用。
背景技术：
2.根腐病是一种普遍的红掌病害,主要发生在植株根部，初期营养根先出现腐烂，进而导致茎叶部分生长不良，叶片失去光泽边缘变黄，甚至可能出现地上部分局部枯萎死亡的情况。后期植株的根部会逐渐变为褐色并呈现出腐烂，严重时可能完全腐烂。红掌出现根腐病后植株生长缓慢，株型变小、花苞变小，使红掌的养护期延长，增加了成本。严重时会使植株死亡，直接造成经济损失。
3.选育抗根腐病红掌是预防红掌根腐病发生最有效的途径。目前，生产中主要优化栽培养护管理预以防红掌根腐病的发生。国内有关红掌育种重点的多集中在观赏性上，使用的育种手段也以杂交育种为主，进行抗性育种的研究报道较少。通过诱变育种进行种质资源创新的也相对较少，且多为辐射诱变方面的研究，以离体化学诱变育种为主要目的的系统研究鲜见报导。红掌诱变研究中一般选用红掌普通愈伤组织作为诱变对象，而采用松散型胚性愈伤组织的诱变研究未见报道。采用红掌普通愈伤组织进行化学诱变，只是通过诱变再生植株的生长表现进行突变株的筛选，而没有采用定向诱变技术，在这种方法下红掌的诱变效率极低。而本方法采用的是红掌松散型胚性愈伤组织进行定向诱变筛选，通过定向筛选获得抗根腐病红掌种质资源，为进一步选育抗根腐病红掌品种奠定基础。
技术实现要素：
4.本发明克服了一般红掌体细胞离体诱变技术的缺陷，提供一种采用红掌松散型胚性愈伤组织进行定向筛选抗根腐病红掌的方法。本发明的目的是解决红掌体细胞离体诱变效率低的问题。
5.为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：一种抗根腐病红掌种质的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）采用红掌组培苗叶片外植体，用剪刀将其剪成1-2cm2大小的外植体，接种到1/2ms+1-3 mg/l 2,4-d+0.05-0.2 mg/l naa+20 g/l蔗糖的培养基上，在28℃，1000 lx光照强度下进行培养，40-60d诱导出松散的愈伤组织；（2）将松散的愈伤组织转接到ms+1 mg/l ba+1-2 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上，诱导条件与步骤一相同；同时每15 d继代培养1次，继代培养时选择结构松散的愈伤组织转接，3-5次继代培养后获得红掌松散型胚性愈伤组织；（3）将诱导出的红掌松散型胚性愈伤组织进一步在ms+0.5-1 mg/l ba+0.5-1 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上继代增殖培养；（4）取红掌松散型胚性愈伤组织，将其在超净台中分成直径大小5-10mm的小块，同时配制0.1%的ems溶液，溶液采用0.1m磷酸缓冲液，ph7.0作溶剂，将配好的溶液抽滤灭菌备
用；将胚性愈伤组织浸泡到ems溶液中，在25℃下浸泡24 h；（5）将浸泡好的愈伤组织从溶液中捞出，用灭菌的蒸馏水浸泡10分钟，洗掉诱变剂，再用无菌滤纸将多余的水分吸干；（6）将诱变处理后的红掌愈伤组织转接到事先配制好的筛选培养基上，筛选培养基是在ms+0.5-1 mg/l ba+0.5-1 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖+3-4mm羟脯氨酸；（7）将接种好诱变愈伤组织的培养瓶放到25℃,2000 lx光照24 h的条件下进行抗逆性愈伤组织筛选，经过大约15 d继代一次，每次继代时，将变黄褐变的愈伤组织淘汰，经过3-5次继代培养后即可获得抗逆性愈伤组织突变体；（8）将筛选出的愈伤组织转接到ms+10-20% 根腐病菌粗毒素+30-50 mg/l水解酪蛋白的培养基中，其余培养条件和突变愈伤组织筛选时相同；（9）将获得的再生芽经过dna水平的检测确定突变的可靠性；再对突变植株进行生理生化指标的检测，主要对抗根腐病进行检测；（10）将鉴定后的再生植株进行扩繁并进一步保存利用。
6.本发明进一步公开了抗根腐病红掌种质制备方法在有效提高红掌体细胞离体诱变效率方面的应用。实验结果显示过此方法获取的红掌组培苗根腐病抗性显著提升。
7.本发明更加详细的描述如下：（1）采用红掌组培苗叶片外植体，用剪刀将其剪成1-2cm2大小的外植体，接种到1/2ms+1-3 mg/l 2,4-d+0.05-0.2 mg/l naa+20 g/l蔗糖的培养基上，在28℃，1000 lx光照强度下进行培养，40-60d诱导出松散的愈伤组织；（2）将松散的愈伤组织转接到ms+1 mg/l ba+1-2 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上，诱导条件与步骤一相同。同时每15 d继代培养1次，继代培养时选择结构松散的愈伤组织转接，3-5次继代培养后可获得红掌松散型胚性愈伤组织。这种愈伤组织在不含激素的培养基上可以再生出红掌小苗，可以通过这一方法鉴别愈伤组织诱导效果。
8.（3）将诱导出的红掌松散型胚性愈伤组织进一步在ms+0.5-1 mg/l ba+0.5-1 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上继代增殖培养，以便扩大愈伤组织数量；（4）取红掌松散型胚性愈伤组织，将其在超净台中分成直径大小5-10 mm的小块，同时配制0.1 %的ems溶液，溶液采用0.1m磷酸缓冲液（ph7.0）作溶剂，将配好的溶液抽滤灭菌备用。将胚性愈伤组织浸泡到ems溶液中，在25℃下浸泡24 h;（5）将浸泡好的愈伤组织从溶液中捞出，用灭菌的蒸馏水浸泡10分钟，洗掉诱变剂，再用无菌滤纸将多余的水分吸干；（6）将诱变处理后的红掌愈伤组织转接到事先配制好的筛选培养基上，注意只转移大小5 mm的愈伤组织团。筛选培养基是在ms+0.5-1 mg/l ba+0.5-1 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖+3-4mm羟脯氨酸；（7）将接种好诱变愈伤组织的培养瓶放到25℃,2000 lx光照24 h的条件下进行抗逆性愈伤组织筛选，经过大约15 d继代一次，每次继代时，将变黄褐变的愈伤组织淘汰，经过3-5次继代培养后即可获得抗逆性愈伤组织突变体；（8）将筛选出的愈伤组织转接到ms+10-20% 根腐病菌粗毒素+30-50 mg/l水解酪蛋白的培养基中，其余培养条件和突变愈伤组织筛选时相同；（9）将获得的再生芽经过dna水平的检测确定突变的可靠性；再对突变植株进行生
理生化指标的检测，主要对抗根腐病进行检测；（10）将鉴定后的再生植株进行扩繁并进一步保存利用。
9.本发明ms培养基其组成是：kno31900mg/l、nh4no31650mg/l、cacl2•
2h2o440mg/l、mgs04•
7h2o370mg/l、kh2p04700mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mns04•
4h2o22.3mg/l、zns04•
7h208.6mg/l、na2mn04•
2h2022.3mg/l、cus04•
5h200.025mg/l、cocl2•
6h200.025mg/l、fes04•
7h2027.8mg/l、na
2-edta
•
2h2037.3mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡多辛0.5mg/l、盐酸硫胺素0.5mg/l、肌醇100mg/l、琼脂粉7g/l、蔗糖30g/l；ba指的是苄氨基腺嘌呤；naa指的是吲哚丁酸。
10.ems指的是甲基磺酸乙酯。
11.本发明主要考察了红掌体细胞离体定向诱导，重点是解决红掌体细胞离体诱变过程中诱变效率低下的问题，发明的难点在于胚性愈伤组织的诱导和对变异红掌愈伤组织进行定向筛选。
12.本发明的创新点在于采用松散型胚性愈伤组织来进行诱变，同时使用了一种定向筛选的技术。
13.本发明公开的高效体细胞离体诱变及定向筛选技术与现有技术相比所具有的积极效果在于：能对经过诱变后的红掌愈伤组织进行定向筛选，进而获得抗根腐病红掌种质资源。
附图说明
14.图1为通过羟脯氨酸筛选获取的愈伤组织；图2为抗根腐病再生植株。
具体实施方式
15.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
16.实施例1材料供试材料为天津农学院园艺系园林植物实验室从荷兰引进的巨型红掌盆栽品种（对于进行科学研究的单位和个人，对外可以免费为提供）。以巨型红掌无菌组培苗的幼嫩叶片为外植体为材料，进行胚性愈伤组织的诱导。
17.方法（1）红掌愈伤组织的诱导在超净台中将红掌组培苗叶片的边缘剪下，剪成1cm
×
1cm大小的小块，将剪好的外植体接种到事先配制的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为1/2ms+2mg/l 2,4-d+0.2 mg/l naa+20 g/l蔗糖，ph5.8-6.0，琼脂粉7.0 g/l。在28℃，1000 lx光照
强度下进行培养，经过40天的培养后诱导出质地松散的愈伤组织；（2）红掌胚性愈伤组织的诱导及增殖将上一步骤诱导出的愈伤组织从外植体上切下，转接到ms+1 mg/l ba+1 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上继续诱导，诱导条件与步骤一相同。同时每15 d继代培养1次，继代培养时选择结构松散的愈伤组织转接，经过3次继代培养后获得红掌松散型胚性愈伤组织。将诱导出的红掌松散型胚性愈伤组织转接到ms+0.5 mg/l ba+0.5 mg/l 2,4-d+30 g/l蔗糖的培养基上继代增殖培养，扩大松散型胚性愈伤组织数量；（3）红掌胚性愈伤组织离体诱变取红掌松散型胚性愈伤组织，将其在超净台中分成直径大小5 mm的小块，将胚性愈伤组织浸泡到0.1 %的ems溶液中，在25℃下浸泡24 h。ems溶液采用0.1m磷酸缓冲液（ph7.0）作溶剂，在配置好之后进行抽滤灭菌以备用;（4）对诱变后红掌胚性愈伤组织的定向筛选将浸泡好的愈伤组织从溶液中捞出，用无菌水浸泡10分钟，洗掉诱变剂，再用无菌滤纸将多余的水分吸干。之后将诱变处理后的红掌愈伤组织转接到事先配制好的筛选培养基上。筛选培养基是在ms+0.5mg/l ba+0.5mg/l 2,4-d+30g/l蔗糖的培养基中加入羟脯氨酸，其中羟脯氨酸的浓度为4mm，在事先配制好母液，经过抽滤灭菌，在培养基融化时加入。将接种好诱变愈伤组织的培养瓶放到25℃,2000 lx光照24 h的条件下进行抗逆性愈伤组织筛选，每15 d继代一次。每次继代时，将变黄褐变的愈伤组织淘汰，经过5次继代培养后，通过逐代筛选没有出现褐变现象的愈伤组织，进而获得抗逆性愈伤组织突变体；（5）红掌抗逆性变异体再生将筛选出的愈伤组织转接到ms培养基上继续培养，同时，在培养基中加入20 %根腐病菌粗毒素和30 mg/l水解酪蛋白，其他培养条件和突变愈伤组织筛选条件相同。经过一段时间的培养即可再生出红掌小苗。采用炭吸附法提取根腐病菌粗毒素，首先将根腐病菌株接种于pda培养基上，于25℃条件下培养7天后取直径为8 mm的菌块4块，接种于有150 mlpsc培养液的250 m l三角瓶内。将培养瓶置于25℃恒温箱中暗配养14天，培养期末用双层滤纸滤去菌丝体，获得具有毒素活性的培养滤液。在培养滤液中加5 %的活性炭后放置于5~6℃冰箱内，12 h后用滤纸过滤炭末,然后按体积比1:10的比例将炭末浸泡于45摄氏度热甲醇中1 h后过滤，浓缩甲醇提取液至淡黄色，再将浓缩物溶于50 ml热甲醇中过滤。上清液加3倍体积的氯仿沉淀，移出黄色不溶物，剩下甲醇氯仿溶解液旋转蒸发至黑色粘稠，即获得粗毒素；（6）变异红掌遗传性检测将获得的再生芽经过dna水平的检测确定突变的可靠性；再对突变植株进行生理生化指标的检测，主要对其对根腐病的抗性进行检测。将鉴定后的出现稳定变异的再生植株进行扩繁并进一步保存利用。
18.（7）再生植株抗根腐病检测根腐病病原菌接种采用蘸根接种法。从pda培养基上培养的菌株中，在菌落边缘挑取菌丝块转入麦麸培养基，25℃培养7d。用无菌水冲洗麦麸培养基，使用4层灭菌纱布过滤后获得分生孢子液。在瓶苗株高达到4 cm、叶片数6叶、生根数达到5根时，对红掌进行开瓶炼苗，在炼苗进行6天后对瓶苗进行移栽。移栽前将苗的根部用自来水进行冲洗，洗去多余
的培养基，清洗时注意不要损伤气生根。之后将幼苗根系完全浸泡于病原菌孢子悬液中30 min, 然后将幼苗种植于灭菌基质中，以接种无菌水作为空白对照。培养条件：温度25℃，14 h光照，10 h黑暗，空气相对湿度40 %，每2 d浇水一次。
19.在接种35 d后对幼苗进行病情分级调查，检测再生植株的抗病性。根系有较多病斑且出现腐烂现象的，即为感病植株；根系有零星凹陷的条斑，地上部分植株生长正常的即为中抗植株；根系健康无变色症状，地上部分植株生长正常的即为高抗植株。
20.在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。