一种斑马鱼记忆评价模型的构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及药物评价与筛选的技术领域，尤其涉及一种斑马鱼记忆评价模型的构建方法及其应用。


背景技术：

2.斑马鱼幼鱼因其与人类基因同源度高(87％)、个体较小，是目前唯一适用于高通量药物筛选的高等脊椎类动物，可用于记忆功能的快速评价。斑马鱼幼鱼会因光线的突然消失(暗闪光)而出现突然的快速运动反应，该反应在反复暗闪光刺激训练后出现长期习服表现。习服是生物体对反复出现的无危险刺激的习惯现象，根据保持时间可分为短期与长期习服(24h以上)，记忆能力的好坏与长期的习服密切相关。
3.现有技术在利用习服来评价斑马鱼记忆能力好坏时，一般采用高速摄像机捕捉声光等刺激之下，斑马鱼个体的体态表型。因体态反应维持时间非常短(20ms以内)，肉眼无法辨别，必须借助高速摄影机捕捉，而后通过人工或软件方式识别。其存在以下弊端：第一，实现方式单一；第二，通量小带来的实验效率低；第三，相关设备和分析软件专业化程度高，投入成本较大，相关设备等专用化程度高，用途单一；第四，图片数据类型分析时主观性较大，科学性不足。
4.公开号为cn112034113a的中国发明专利公开了一种检测保健食品记忆改善功效的方法，包括以下步骤：(1)随机选取若干尾斑马鱼，记忆训练后，投放诱导剂，建立记忆障碍模型对照组；(2)记忆训练后，投放诱导剂和待测试样，建立试样组；(3)记忆训练后，投放诱导剂和依达拉奉，建立阳性对照组；(4)记忆训练，建立正常对照组；(5)分别将记忆障碍模型对照组、试样组、阳性对照组和正常对照组的斑马鱼进形t迷宫实验，记录斑马鱼从起点到进入富营养区的潜伏时间(t)，计算待测试样的记忆改善功效(％)。但是，该方法的记忆训练仅对短期记忆有效，且通量较低，科学性不足，不适用于评价长期记忆功效的好坏。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种斑马鱼记忆评价模型的构建方法及其应用，结合斑马鱼行为学领域普遍适用的行为分析系统和微孔板技术，改良现有的评价方法，该方法构建出对测量设备和分析软件专用化要求程度低、测量过程高通量、测量结果数字化的斑马鱼记忆评价模型，最大化地发挥出斑马鱼作为目前唯一适用于高通量药物筛选的高等脊椎类动物在记忆评价上的优势。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种斑马鱼记忆评价模型的构建方法，包括如下步骤：(1)取受精后的斑马鱼幼鱼分别设置正常组和模型组，正常组加入二甲基亚砜溶液，模型组加入环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应后，分别移入微孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼；(2)打开行为分析系统，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡一段时间；
(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练130～150次，作为1个训练循环；持续光照条件下，休息10～20min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段，洗去斑马鱼幼鱼上的二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，持续光照4～6h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练10～20次；(7)计算各组记忆强度习服率。
7.在暗闪光刺激下，导致的斑马鱼快速运动反应的表现变化发生在20ms以内，维持时间非常短，肉眼无法辨别。本发明通过行为分析系统可以对该快速运动反应进行识别，行为分析系统是一个在斑马鱼幼鱼行为学研究中运用非常广泛的设备，借助这套设备可以完成很多斑马鱼幼鱼的行为分析，比如普通行为学(轨迹、速度、活跃度)、位置偏好等。再配合微孔板技术，可以实现高通量的分析，缩减试验周期，也减少了个体间运动的干扰，解决原有技术下通量不够、实验效率低的问题。
8.另外，本发明在斑马鱼的训练阶段采用“15s亮-1s暗”的高频刺激方式循环刺激训练较高频次，在该训练频率下，正常组的习服率已经达到了70-80％，已经可以在实际实验中为后续的模型组提供足够的造成记忆衰退的空间，能在统计学上形成显著性差异，继续增加训练次数延长试验周期，不符合斑马鱼实验快速筛选的初衷。训练循环后，为强化幼鱼记忆，给予其休息时间，该段时间内幼鱼持续暴露在与实验过程相同强度的光照下。经过持续光照，形成长期习服记忆，测试阶段用于检验长期习服现象的保持情况，经过前期大量重复训练以后，斑马鱼在这一阶段的运动反应比例会从一个较低的值开始，因为有自发运动和其他诱因的存在，设置10～20次的循环刺激频率已足够用于斑马鱼的记忆评价。
9.诱导剂环已酰亚胺通过阻碍蛋白质合成中的多肽链延伸来抑制生物体蛋白质合成，从而破坏了记忆的物质基础，导致模型组记忆减退，在测试阶段就无法很好的保持对暗闪光的习服表现。而正常组中的二甲基亚砜溶液对斑马鱼幼鱼的记忆能力不产生影响，可以观察到较好的习服表现，各组间通过比较这种习服的保持程度就可来评价记忆力强弱。
10.作为优选，步骤(1)中，所述斑马鱼幼鱼为受精后第5～7天的幼鱼；所述光照条件下适应的时间为30～60min。斑马鱼幼鱼(5-7dpf)的记忆能力较好，有利于模型的构建与评价。
11.作为优选，步骤(1)中，所述正常组和模型组分别设置5～8个平行组，每个平行组有32～48条斑马鱼幼鱼；所述正常组中二甲基亚砜溶液的体积分数为1～3
‰
；所述模型组中环已酰亚胺溶液的浓度为10～15μm。
12.作为优选，步骤(2)中，所述斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10～20min。
13.作为优选，所述光照条件均为同一强度的光照，设置为行为分析系统上的8～15％光照。
14.作为优选，步骤(7)中，所述记忆强度习服率的计算公式为：所述a为步骤(6)中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值；所述b为步骤(4)中第1个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值。
15.斑马鱼幼鱼保持习服时不会对暗闪光做出快速运动反应，也就不会被仪器检测到，以此计算习服率。测试阶段因为大量的训练，正常组的运动反应会在10次循环左右降到最低，前10次循环以后的数据基本差别不大，相对应地，训练阶段也取第1个训练循环中前10次循环数据，提高习服率计算时的准确性。
16.作为优选，步骤(7)中，还包括计算学习能力习服率，其计算公式为：所述c为步骤(4)中第4个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值；所述d为步骤(4)中第1个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值。
17.作为优选，所述运动反应为运动速度超过行为分析系统设置的速度阈值；所述速度阈值为13～15mm/s。
18.通过设置行为分析系统的速度阈值，当暗闪光施加以后，斑马鱼的运动速度大于该速度阈值时就会被记录下来，以此统计每一次暗闪光里出现反应的个体比例。另外，斑马鱼会因为多种原因出现运动，比如自发的游动、受声音影响、受震动扰动，为了尽量过滤无关的原因，尤其是自发运动，提高快速运动反应和暗闪光之间的高度关联性，这个速度阈值在实际操作中最合适。
19.另一方面，本发明还提供了一种上述斑马鱼记忆评价模型的构建方法在评价辅助改善记忆功能药物或保健食品中的应用。
20.作为优选，除实验组和模型组外，再设置一组阳性对照组，阳性对照组加入药物或保健食品的药液和环已酰亚胺溶液，按照步骤(1)到步骤(6)的构建方法计算各组习服率；各组习服率的统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用dunnett’s t-检验进行统计学处理，p《0.05为差异性显著。
21.与现有技术对比，本发明的有益效果是：(1)斑马鱼行为分析系统技术成熟，设备性能稳定，适用范围几乎包括所有斑马鱼的行为学实验，且还有运用拓展的空间，设备投入相对合理和灵活；(2)借助微孔板技术，可以实现高通量的分析，缩减试验周期，也减少了斑马鱼个体间运动的干扰，解决原有技术下通量不够，实验效率低的问题；(3)数字化的数据类型分析处理更为客观化和科学化，提高实验结果分析的效率。
附图说明
22.图1为实施例1中斑马鱼幼鱼学习过程散点图；图2为实施例2和实施例3中阳性药1的记忆强度图；图3为实施例4和实施例5中阳性药2的记忆强度图；图4为实施例6、实施例7和实施例8中阳性药3的记忆强度图；图5为实施例2和实施例3中阳性药1的学习能力图；图6为实施例4和实施例5中阳性药2的学习能力图；图7为实施例6、实施例7和实施例8中阳性药3的学习能力图。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
24.实施例1构建斑马鱼记忆评价模型：(1)取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；分别设置正常组和模型组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼，六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300μl；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率；记忆强度习服率的计算公式为：a为步骤(6)中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值；b为步骤(4)中第1个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值；学习能力习服率的计算公式为：c为步骤(4)中第4个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值；d为步骤(4)中第1个训练循环中前10次循环斑马鱼幼鱼运动反应的个体百分比的平均值。
25.其中，光照条件均为行为分析系统上的8％光照；运动反应为运动速度超过行为分析系统设置的13mm/s速度阈值。
26.实施例2利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价盐酸甲氯芬酯(阳性药1，低浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；
阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 5mg/ml的盐酸甲氯芬酯溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
27.实施例3利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价盐酸甲氯芬酯(阳性药1，高浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 10mg/ml的盐酸甲氯芬酯溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
28.实施例4利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价奥拉西坦(阳性药2，低浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 40mg/ml的奥拉西坦溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
29.实施例5利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价奥拉西坦(阳性药2，高浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 80mg/ml的奥拉西坦溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑
马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
30.实施例6利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价银杏叶苁蓉片(阳性药3，低浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 125mg/ml的银杏叶苁蓉片溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
31.实施例7利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价银杏叶苁蓉片(阳性药3，中浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，
正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 250mg/ml的银杏叶苁蓉片溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
32.实施例8利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价银杏叶苁蓉片(阳性药3，高浓度)：(1)分别设置正常组、模型组和阳性对照组，每组各5个平行组，每个平行组有32条斑马鱼幼鱼；正常组、模型组：取6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，挑选活跃个体置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，正常组每孔加入12μl 100％的二甲基亚砜溶液，模型组加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液；在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；阳性对照组：在实验前一天，取5dpf的斑马鱼幼鱼置于六孔板内，每孔35-40条，每孔以标准稀释水定容至12ml；六孔板每孔扣除加样体积后，加入12μl 500mg/ml的银杏叶苁蓉片溶液，进行过夜预暴露至6dpf的斑马鱼幼鱼；在实验当天，6dpf的斑马鱼幼鱼在光照条件下适应30min后，再加入12μl 10mm的环已酰亚胺溶液诱导造模；再次在光照条件下适应30min后，分别移入96孔板内，每孔一条斑马鱼幼鱼，每孔液体体积添加300ul；(2)打开行为分析系统，参数正确设置并预热之后，打开背景灯，使微孔板内的斑马鱼幼鱼在光照条件下平衡10min；(3)进入训练阶段，按照“15s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练150次，作为1个训练循环，耗时40min10 s；持续光照条件下，休息10min；(4)重复步骤(3)4次，共计4个训练循环；(5)结束训练阶段。立即对96孔板内的幼鱼洗去二甲基亚砜溶液或环已酰亚胺溶液，后在训练过程相同光照强度下持续光照暴露4h；
(6)进入测试阶段，按照“60s亮-1s暗”的刺激方式循环刺激训练20次，总耗时20min10s；(7)计算记忆强度习服率和学习能力习服率。
33.由图1可知，随着训练循环次数的增加，斑马鱼幼鱼发生高速运动个体百分比逐渐降低，测试阶段的习服保持性较好。利用实施例1中的斑马鱼记忆评价模型评价阳性药1-3的改善记忆功效，各组习服率的统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用dunnett’s t-检验进行统计学处理，p《0.05为差异性显著。
34.如图2和图5所示，不同浓度阳性药1的记忆强度习服率与正常对照组相比，#p《0.05，其与模型对照组相比，*p《0.05；不同浓度阳性药1的学习能力习服率与正常对照组相比，#p《0.05，其与模型对照组相比，*p《0.05。
35.如图3和图6所示，不同浓度阳性药2的记忆强度习服率与正常对照组相比，#p《0.05，其与模型对照组相比，*p《0.05；不同浓度阳性药2的学习能力习服率与正常对照组相比，#p《0.05，其与模型对照组相比，*p《0.05。
36.如图4和图7所示，不同浓度阳性药3的记忆强度习服率与正常对照组相比，#p《0.05，##p《0.01，其与模型对照组相比，*p《0.05，**p《0.01；不同浓度阳性药3的学习能力习服率与正常对照组相比，#p《0.05，##p《0.01，其与模型对照组相比，*p《0.05。
37.由结果可知阳性药1(盐酸甲氯芬酯)在实验浓度下可显著改善模型组记忆强度和学习能力的下降，且有一定的量效关系；阳性药2(奥拉西坦)在实验浓度下可显著提升模型组的记忆强度和学习能力；阳性药3(银杏叶苁蓉片)除中浓度外，在各实验浓度下均可显著改善模型组的记忆强度和学习能力，通过阳性药的验证，说明了本模型具有评价记忆强度和学习能力的功能。
38.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。