一种预防土传病害的微生物菌剂的制作方法

1.本品属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种预防土传病害的微生物菌剂。


背景技术：

2.土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、细菌、放线菌、线虫等。而上述的这些病原，其都存在于土壤中或借助病残体于土壤中越冬。因此，抑制根系周围病原微生物的活动就成了防治土传病害的重中之重。
3.γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，简称γ-pga），是一种新型可生物降解的水溶性髙分子材料，其优良的性能已经在医药、日化、轻工和食品等许多领域得以应用，随着研究的深入，γ-pga在农业中的应用也逐渐崭露头角，γ-聚谷氨酸能将土壤中的钙镁等金属阳离子固定在根系附近，增大根系营养吸收效率，促进根系快速生长。
4.褐藻寡糖（oligosaccharide）是一种来自褐藻的低聚糖，为淡黄褐色粉末，能溶于水，稳定性强，在医药、食品、日化、饲料和农业方面有广泛的应用。其含有大量的海藻多糖、海藻酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，能够促进植物生长及改善土壤。
5.枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis），广泛分布于土壤及腐败的有机物中, 因其易在枯草浸汁中繁殖而得名。其生理特征多样，分布较为广泛，易在环境中的存活、定殖，且能产生抗生素和脂肽等活性抗菌物质。目前枯草芽孢杆菌已于水稻、番茄、辣椒等农作物上表现出良好病害防治效果。枯草芽孢杆菌生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期较长，适合开发为生防菌剂。
6.地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。在居住在地面的鸟类的羽毛中也能找到这种细菌。它可能以孢子形式存在，以此抵抗恶劣的环境；在良好环境下，则可以以生长态存在。该菌可调整菌群失调达到治疗病害的目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生拮抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
7.巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）能够降解土壤中难溶的磷酸盐，使之转化为作物能吸收的可溶性磷酸盐，部分巨大芽孢杆菌还具有固氮增效作用，非常适合制成微生物肥料。
8.胶冻样类芽孢杆菌（bacillus mucilaginosus）能够分解土壤当中的硅酸盐矿物，还能产生多种有益物质如赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等，能够快速促进作物生长。
9.矿源黄腐酸（fulvic acid）是一种是从低级别煤中提取而来的天然混合物。主要是芳香族羟基羧酸类物质。其具有促进植物生长，提高植物抗逆能力，增加作物产量和改善品质等诸多效果。


技术实现要素：

10.本发明的目的在提供一种预防土传病害的微生物菌剂。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种预防土传病害的微生物菌剂，按质量百分比计，其配方包括以下组分：10%-20%枯草芽孢杆菌发酵液，0.5%-5%巨大芽孢杆菌粉剂，0.5%-5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，10%-20%褐藻寡糖原液，10%-30% γ-聚谷氨酸发酵原液，1%-10% 矿源黄腐酸钾，0.5%-1.5%山梨酸钾，0.5%-1.5%苯甲酸钠，7%
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67%水；其中γ-聚谷氨酸发酵原液中包含地衣芽孢杆菌wx-02和地衣芽孢杆菌dyf7-02。
12.上述预防土传病害的微生物菌剂中所述微生物菌剂中枯草芽孢杆菌发酵液中活菌浓度为1.2
×
10
10
cfu/ml、巨大芽孢杆菌粉剂中活菌浓度为1.0
×
10
10
cfu/g、胶冻样类芽孢杆菌粉剂中活菌浓度为2.0
×
10
10
cfu/g、γ-聚谷氨酸发酵原液中地衣芽孢杆菌总活菌浓度为1.2
×
10
10
cfu/ml，γ-聚谷氨酸含量为30-60 g/l。
13.上述预防土传病害的微生物菌剂中所述微生物菌剂中所述褐藻寡糖原液为称取计料总体积10wt%-15wt%的海藻酸钠加入到酶解罐的水中，同时加入0wt%-2.2wt%氯化钠，搅拌混合，控制反应温度为60℃-70℃，空气流量0.3vvm-0.5vvm溶胀24h-36h，氨水控制ph 6.9-7.0；按海藻酸钠投料量的10wt%-20wt%添加褐藻酸裂解酶，酶解反应温度40℃-60℃，酶解时间12h-36 h，灭酶，制得褐藻寡糖原液。
14.上述预防土传病害的微生物菌剂的制备方法：按配方称取γ-聚谷氨酸发酵原液、枯草芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌粉剂、胶冻样类芽孢杆菌粉剂、矿源黄腐酸钾、褐藻寡糖原液、山梨酸钾、苯甲酸钠和水；清洁的配制罐中加入γ-聚谷氨酸发酵原液和水，1200 r/min开启搅拌，依次缓慢加入巨大芽孢杆菌粉剂、胶冻样类芽孢杆菌粉剂、矿源黄腐酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、枯草芽孢杆菌发酵液、褐藻寡糖原液，1400 r/min搅拌1.5小时使料液均匀混合，ph控制在4.0-7.0，即得预防土传病害的微生物菌剂。
15.上述预防土传病害的微生物菌剂在促进作物生长中的应用。
16.上述预防土传病害的微生物菌剂在提高作物抗病力中的应用。
17.本发明的有益效果：本发明的预防土传病害的微生物菌剂是利用具有强解磷固氮作用的地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，具有抗菌性的枯草芽孢杆菌，以及具有分解土壤当中的硅酸盐矿物且能产生多种植物内源性激素的胶冻样类芽孢杆菌进行复配，并添加了能将土壤中的钙镁等金属阳离子固定于根系周围，增大根系营养吸收效率，促进根系快速生长的，且具有保水保肥功能γ-聚谷氨酸；含有大量的海藻多糖、海藻酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂的褐藻寡糖。所述预防土传病害的微生物菌剂富含有益菌群，多菌种协同作用，促进作物新陈代谢，增强植物的萌发能力，使根系发达，提高养分吸收能力，促进作物生长；能够提高作物防病、抗病能力。因此，本发明提供了一种对作物具有强防病促生作用的的微生物菌剂。
18.附图说明：图1 各处理微生物菌剂稀释液在离体叶片上对马铃薯晚疫病菌抑制效果。a：处理a，b：处理b，c：处理c，d：处理d，e：处理e，f：处理f。
19.图2 各处理微生物菌剂稀释液在离体叶片上对马铃薯晚疫病菌的抑制率。b：处理b，c：处理c，d：处理d，e：处理e，f：处理f。
20.具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
22.菌种材料：（1）地衣芽孢杆菌wx-02：其分类命名为：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis） wx-02；已于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctcc no: m 208065。
23.（2）地衣芽孢杆菌dyf7-02：其分类命名为：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）dyf7-02；已于2021年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctcc no: m 2021817。
24.地衣芽孢杆菌wx-02和地衣芽孢杆菌dyf7-02能在缺氮培养基和无机磷培养基上生长，两株地衣芽孢杆菌均具有固氮、解磷的作用。
25.（3）枯草芽孢杆菌bfs2832：其分类命名为：枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）bfs2832；已于2013年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctcc ab 131141。
26.（4）巨大芽孢杆菌xz16-18：其分类命名为：巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）xz16-18；已于2007年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctcc ab 207465。
27.（5）胶冻样类芽孢杆nkts-3：其分类命名为：胶冻样类芽孢杆菌（bacillus mucilaginosus）nkts-3；已于2004年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：cctcc kb 20082790。
28.培养基：固体肉汤培养基（lb）：10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，琼脂粉12g，去离子水1l。将胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉于高压瓶中，加去离子水定容至1l，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min。
29.液体肉汤培养基（lb）：10g胰化蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，去离子水1l。将胰化蛋白胨、酵母提取物于高压瓶中，加去离子水定容至1l，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min。
30.实施例11、枯草芽孢杆菌发酵液的制备：（1）菌悬液制备：将100ml 0.5wt%-0.7wt%灭菌氯化钠溶液倒入枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) bfs2832培养成熟的斜面培养基中，用接种铲将菌苔刮下，倒入灭菌过的空茄子瓶内，制得菌悬液，置于2℃-6℃冰柜内保存，在48h内使用。
31.（2）种子培养：按12vol%的接种量将菌悬液接入发酵罐。接种完毕后，罐温控制34℃-40℃，罐压：0.01mpa-0.05mpa，培养周期12h-24h，ph：6.5-9.0，制得种子液。
32.（3）发酵培养：将发酵培养基倒入料池，边加边搅拌，由泵输送入发酵罐内，并加饮用水至配料体积，开动搅拌使原料充分混合，直接导入蒸汽，升温到125℃-130℃、压力
0.10mpa-0.20mpa、保温保压20min-35min，然后通入无菌空气保持罐正压，并立即通入冷却水将培养基降温到34℃-40℃，待接种。
33.使用压差法将种子液接种到发酵罐中，接种量为5vol%-10vol%。接种结束后，控制罐温温度：34℃-40℃，罐压：0.05mpa-0.08mpa，发酵周期18h-36h，ph：7.0-9.0，芽孢形成率70%以上，发酵液中枯草芽孢杆菌活菌eb-28浓度1.2
×
10
10
cfu/ml以上，放罐，即可得到枯草芽孢杆菌发酵液。
34.所述种子培养基配方：大豆分离蛋白50g/l、麦芽糊精40g/l、磷酸氢二钾2g/l、硫酸锰0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、消沫剂0.5g/l。
35.所述发酵培养基配方：大豆分离蛋白60g/l、玉米淀粉45g/l、酵母浸膏4g/l、磷酸二氢钾4g/l、磷酸氢二钾4g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙3g/l、硫酸锰0.05g/l。
36.2、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌粉剂的制备：（1）菌悬液制备：将100ml 0.5wt%-0.7wt%灭菌氯化钠溶液分别加入巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)xz16-18、胶冻样类芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus) nkts-3培养成熟的斜面培养基中，用接种铲将菌苔刮下，分别倒入灭菌过的空茄子瓶内，制得巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium) xz16-18、胶冻样类芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)nkts-3的菌悬液，置于2℃-6℃冰柜内保存，在48h内使用。
37.（2）种子培养：按10vol%的接种量分别将巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium) xz16-18、胶冻样类芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)nkts-3的菌悬液接入种子培养基中。接种完毕后，控制31℃-37℃，压力：0.03mpa-0.07mpa，培养周期16h-32h，ph：7.0～8.5，制得巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)xz16-18、胶冻样类芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)nkts-3的种子液。
38.③
发酵培养：将发酵培养基倒入料池，边加边搅拌，由泵输送入发酵罐内，并加饮用水至配料体积，开动搅拌使原料充分混合，直接导入蒸汽，升温到120℃-125℃、压力0.10mpa-0.13mpa、保温保压25min-35min，然后通入无菌空气保持罐正压，并立即通入冷却水将培养基降温到34℃-40℃，待接种。使用压差法将种子液接种到发酵罐中，接种量为7%-10%。移种结束后，控制罐温温度：31℃-37℃，罐压：0.02mpa-0.07mpa，发酵周期16h-32h，ph：7.0-8.5，芽孢形成率75%以上，放罐。
39.④
添加填料：根据生产指令单要求及发酵水平的高低，发酵液中添加一定量重质碳酸钙辅料，搅拌50min-80min。
40.⑤
干燥、包装：将添加填料的混合液用泵输送至喷雾干燥塔，进风温度控制在180℃-260℃，出风温度控制在70℃-100℃，喷雾干燥机组压力控制在-1000 pa—-100pa，在喷雾塔出料口装袋，检验合格后得巨大芽孢杆菌xz16-18粉剂、胶冻样类芽孢杆菌nkts-3粉剂。其中巨大芽孢杆菌xz16-18粉剂中活菌浓度1.0
×
10
10
cfu/g以上；胶冻样类芽孢杆菌nkts-3粉剂中活菌浓度2.0
×
10
10
cfu/g以上。
41.所述种子培养基配方：淀粉10g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、酵母浸膏0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、豆饼粉10g/l、硫酸氨1g/l、碳酸钙3g/l。
42.所述发酵培养基配方：淀粉20g/l、磷酸氢二钾3g/l、氯化铁0.01g/l、酵母浸膏2g/l、硫酸镁0.5g/l、豆饼粉15g/l、硫酸氨3g/l、碳酸钙3g/l。
43.3、γ-聚谷氨酸发酵原液的制备：γ-聚谷氨酸发酵原液是由地衣芽孢杆菌wx-02
和地衣芽孢杆菌dyf7-02按质量比1:1混合发酵产生，其中γ-聚谷氨酸含量为30g-60g/l；两种地衣芽孢杆菌总活菌浓度为1.2
×
10
10
cfu/ml。
44.所述γ-pga发酵液的制备方法，包括以下步骤：
①
斜面培养：取甘油管保藏的地衣芽孢杆菌wx-02和地衣芽孢杆菌dyf7-02，分别涂布于pda斜面培养基上，30℃培养24h-48h，至菌体生长对数期；
②
混合菌悬液制备：使用生理盐水将两种地衣芽孢杆菌斜面上的菌落洗脱制成10
11-10
13
cfu/ml的菌悬液，按体积比1∶1混合得到混合菌悬液；
③
种子罐发酵：种子培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将混合菌悬液接入种子罐进行种子培养，培养工艺如下：静置10小时后开始15r-75r/min搅拌，温度37
°
空气流量0.1vvm-0.8vvm，当菌体断裂为单体时移种；
④
发酵培养：发酵培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将种子液接入发酵罐，按以下工艺进行培养：溶氧控制：
①
流量：30小时前0.2vvm-0.8vvm，控制do不低于30%；
②
搅拌：60r-120r/min，30小时，控制do不低于5%；温度：30℃；ph控制：氨水控制ph6.9-7.0；压力：罐压0.05mpa；取样：0h、4h、8h、
……
每4h取样一次，记录ph值、do值、温度、空气流量、罐压、搅拌转速、运行体积，直到放罐，记录放罐体积；放罐指标：
①
还原糖耗尽；
②
发酵液ph达到7.6以上；放罐后得4wt%含量的γ-pga发酵液。
45.所述种子培养基配方：柠檬酸钠15g/l、氯化钠10g/l、硝酸钠5g/l、酵母粉0.5g/l、硫酸铵1g/l、麦芽糊精20g/l、葡萄糖15g/l。
46.所述发酵培养基配方：谷氨酸钠20g/l、葡萄糖50g/l、麦芽糊精50g/l、氯化钠50g/l、磷酸氢二钠30g/l、硝酸钠30g/l、硫酸镁10g/l、硫酸锌10g/l、磷酸氢二钾10g/l、碳酸钙10g/l、消泡剂0.1g/l、硫酸亚铁0.15g/l、酵母粉25g/l。
47.、褐藻寡糖原液的制备：（1）海藻酸钠溶胀：称取海藻酸钠（计料总体积的10wt%-15wt%）加入到酶解罐的水中，同时加入0wt%-2.2wt%氯化钠，搅拌混合，控制反应温度为60℃-70℃，空气流量0.3vvm-0.5vvm溶胀24h-36h。氨水控制ph6.9-7.0；（2）酶解：按海藻酸钠投料量10wt%-20wt%添加褐藻酸裂解酶，酶解反应温度40℃-60℃，酶解时间12h-36h，灭酶，放罐，制得褐藻寡糖原液。
48.实施例2预防土传病害的微生物菌剂在马铃薯离体叶片上的防效试验（1）试验时间：2020年03月25日至2020年04月28日。
49.（2）试验地点：福建省南平市浦城县园区大道2号，绿安生物农药有限公司。
50.（3）供试微生物菌剂：微生物菌剂配方
①
，按质量百分比计，包括以下组分：10%枯草芽孢杆菌发酵液，0.5%巨大芽孢杆菌粉剂，0.5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，10%褐藻寡糖原液，10%γ-聚谷氨酸发酵原液（含地衣芽孢杆菌）,2%矿源黄腐酸钾，0.5%山梨酸钾，0.5%苯甲酸钠，66%水。
51.微生物菌剂配方
②
，按质量百分比计，包括以下组分：20%枯草芽孢杆菌发酵液，0.5%巨大芽孢杆菌粉剂，0.5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，10%褐藻寡糖原液，10%γ-聚谷氨酸发酵原液（含地衣芽孢杆菌）,1%矿源黄腐酸钾，1.5%山梨酸钾，1.5%苯甲酸钠，55%水。
52.微生物菌剂配方
③
，按质量百分比计，包括以下组分：微生物菌剂配方d（10%枯草芽孢杆菌发酵液，3.5%巨大芽孢杆菌粉剂，3.5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，10%褐藻寡糖原液，10%γ-聚谷氨酸发酵原液（含地衣芽孢杆菌），1%矿源黄腐酸钾，1.5%山梨酸钾，1.5%苯甲酸钠，59%水。
53.微生物菌剂配方
④
，按质量百分比计，包括以下组分：15%枯草芽孢杆菌发酵液，3.5%巨大芽孢杆菌粉剂，3.5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，15%褐藻寡糖原液，20% γ-聚谷氨酸发酵原液（含地衣芽孢杆菌）,6%矿源黄腐酸钾，1%山梨酸钾，1%苯甲酸钠，35%水。
54.微生物菌剂配方
⑤
，按质量百分比计，包括以下组分：20%枯草芽孢杆菌发酵液，5%巨大芽孢杆菌粉剂，5%胶冻样类芽孢杆菌粉剂，20%褐藻寡糖原液，30%γ-聚谷氨酸发酵原液（含地衣芽孢杆菌）,10%矿源黄腐酸钾，1.5%山梨酸钾，1.5%苯甲酸钠，7%水。
55.（4）微生物菌剂的制备方法：清洁配制罐，按上述配方称取γ-聚谷氨酸发酵液、枯草芽孢杆菌粉剂、巨大芽孢杆菌粉剂、胶冻样类芽孢杆菌粉剂、矿源黄腐酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠和水。加入γ-聚谷氨酸发酵液、水，1200 r/min开启搅拌，缓慢并依次加入巨大芽孢杆菌粉剂、胶冻样类芽孢杆菌粉剂、矿源黄腐酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、枯草芽孢杆菌发酵液，1400 r/min搅拌1.5小时使料液均匀混合，即得到四株芽孢杆菌与褐藻寡糖、γ-聚谷氨酸、矿源黄腐酸组合的微生物菌剂。
56.（5）试验方法处理a：无菌水与马铃薯晚疫病菌（致病疫霉phytophthora infestans）孢子囊悬浮液等比例混合；处理b：微生物菌剂配方
①
稀释液（500倍稀释）与马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液等比例混合；处理c：微生物菌剂配方
②
稀释液（500倍稀释）与马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液等比例混合；处理d：微生物菌剂配方
③
稀释液（500倍稀释）与马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液等比例混合；处理e：微生物菌剂配方
④
稀释液（500倍稀释）与马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液等比例混合；处理f：微生物菌剂配方
⑤
稀释液（500倍稀释）与马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液等比例混合。
57.马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液的制备：取生长10天的马铃薯晚疫病菌（致病疫霉（phytophthora infestans））平板，加入5ml无菌水使用涂布棒均匀涂布，使用移液枪将孢子囊悬浮液吸出浓度调整至4.0
×
105cfu /ml。
58.取完整、饱满、健康、大小相近的马铃薯叶片，清水冲洗干净后放置室内避光自然晾干，将叶片背面朝上，摆放在倒好的90mm水琼脂一次性培养皿中。取 各配方微生物菌剂稀释液与上述孢子囊悬浮液1:1等比例混合，取10μl接种于叶片背面的基部接近主脉处点。置于18℃恒温培养箱中，进行光暗交替培养（光16 h/暗8 h），每个处理进行3次重复，直到
有对照长满菌丝为止，并计算抑制率。
59.抑制率（%）=（对照病斑面积－处理病斑面积）/对照病斑面积
×
100%。
60.（6）试验结果各处理在接种点附近会产生面积较小的黄斑，且病程较缓，未见整片叶片发病（见图1）。各处理微生物菌剂稀释液在离体叶片上对马铃薯晚疫病菌的抑制率为：处理b抑制率：100%；处理c抑制率：55%；处理d抑制率：98%；处理e抑制率：88%；处理f抑制率：83%；具体见图2。
61.实施例3微生物菌剂所含各菌株对马铃薯黑胫病菌的拮抗效果取lb液体摇瓶培养2天的马铃薯黑胫病菌（胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种erwiniacarotovorasubsp.atroseptica(vanhall)dye）酵液（活菌数＞10
10
/ml）稀释至10-5
，按1wt%的接种量接种涂布至lb固体平板。将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆、地衣芽孢杆菌wx-02、地衣芽孢杆菌dyf7-02五种微生物菌株分别在lb固体平板涂布28℃培养2天；将五种微生物菌株混合物在lb固体平板涂布28℃培养2天。使用孔径1cm的打孔器取上述5种菌株的单一菌种菌饼及5种菌株混合物菌饼倒置于涂布黑胫病菌的平板正中央，封口倒置于28℃培养箱内培养2-3天。观察抑菌圈的大小并记录抑菌圈半径。
62.结果表明：其中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌wx-02、地衣芽孢杆菌dyf7-02、巨大芽孢杆菌4株菌产生了抑菌圈，抑菌圈半径从大到小依次为：枯草芽孢杆菌（1.74cm）＞巨大芽孢杆菌（1.22cm）＞地衣芽孢杆菌wx-02（0.79cm）＞地衣芽孢杆菌dyf7-02（0.64cm）。而胶冻样类芽孢杆菌未产生抑菌圈。
63.实施例4微生物菌株所含菌株各对马铃薯黑痣病菌（立枯丝核菌rhizoctoniasolani）的拮抗效果使用孔径1cm的打孔器在pda平板上培养5天长满立枯丝核菌的平板边缘打孔，将立枯丝核菌菌饼对称置于pda平板平板两端；使用孔径1cm的打孔器取枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆、地衣芽孢杆菌wx-02、地衣芽孢杆菌dyf7-02五种菌株的菌饼，以及五种菌株混合物的菌饼置于有立枯丝核菌菌饼的pda平板正中心，使用封口膜封口并倒置于25℃培养箱内培养5-6天。观察、拍照记录抑菌圈的大小并计算抑制率。
64.抑制率（%）=（对照菌丝面积－处理菌丝面积）/对照菌丝面积
×
100%。
65.结果表明：5株芽孢杆菌对马铃薯黑痣病菌立枯丝核菌抑制率大小不一，但均有一定的拮抗效果，抑制率从大到小依次为：枯草芽孢杆菌（55%）＞巨大芽孢杆菌（32%）＞地衣芽孢杆菌dyf7-02（21%）＞地衣芽孢杆菌wx-02（16%）＞胶冻样类芽孢杆菌（15%）。
66.实施例5微生物菌剂在小白菜上的肥效试验试验地基本情况：前茬作物亩施肥量：亩底施有机肥100千克,磷酸二铵50千克，硫酸钾25千克，追肥复合肥40千克。前茬作物产量：580千克/亩。试验田土壤养分状况见表1。
67.表1试验田土壤养分状况表供试肥料：实施例2制备的微生物菌剂
①‑⑤
。
68.试验方法：供试肥料每次每亩用量1升，兑水200千克，浇灌于小白菜根部，每次间隔7-10天，连续施用3次。共8个处理组；处理1：常规施肥；处理2-7分别施用微生物菌剂
①‑⑤
；处理8：施用等量水做空白对照。
69.田间管理：试验田露地小白菜于2019年8月19日整地施肥，处理1-7分别亩施鸡粪500千克，磷酸二铵40千克；处理8空白对照不施肥。8月20日播种，并浇水，8月28日定植。生长期间浇水3次，追肥一次，亩追45%复合肥(15-15-15)15千克。生长期间，处理2、3、4、5、6、7、分别在9月10日、9月17日、9月24日施用不同配方微生物菌剂灌根，每次亩用量1升，兑水200千克；处理1分别在9月10日、9月17日、9月24日施用基质灌根，每次亩用量1升，兑水200千克；10月13日收获。
70.试验结果：不同处理对小白菜的生物学性状的影响结果见表2。试验田露地小白菜施用微生物菌剂灌根后，叶色浓绿，品质好。
71.表2. 小白菜生物学性状调查表不同处理对小白菜产量的影响，见表3。
72.表3. 小区产量统计表（产量单位：千克/72平方米）
如表3所示，试验田露地小白菜在常规施肥的基础上施用微生物菌剂灌根比常规施肥亩增产均大幅增加，其中增产较为显著的为：处理2、处理6、处理7、增产率为：17.66%、16.48%、14.22%；比空白对照亩增产率为24.06%、22.82%、20.43%；增产效果极显著。
73.实施例6 微生物菌剂在水稻种植中的防病效果供试作物：水稻品种：杂交稻冈优364。
74.供试肥料：实施例2制备的微生物菌剂
①‑⑤
。
75.试验方法：本试验设8个处理，4次重复，采用完全随机区组设计。小区面积8米
×
9米=72平方米。
76.供试肥料每次每亩用量1升，兑水200千克，浇灌于水稻根部，每次间隔7天，连续施用2次。
77.处理1-7分别亩施鸡粪500千克，磷酸二铵40千克；处理8空白对照不施肥。生长期间处理1亩追45%复合肥(15-15-15)15千克。生长期间，处理2、3、4、5、6、7施用不同配方微生物菌剂灌根，每次亩用量1升，兑水200千克。
78.田间防病效果：调查方法和分级标准：施肥前调查发病基数，根据水稻叶鞘和叶片危害症状分级，以株为单位，每小区，对角线，5点取样法取样，每点调查附近相邻5丛，没丛3株（用红线标记），共75株，记录病株数和病情指数，并进行分级，分级标准如下：0级：全株无病1级：第四片叶及其以下各叶鞘、叶片发病（以顶叶为第一片叶）；3级：第三片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第二片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；
7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。
79.调查时间和次数：施肥前调查基数，施肥21天后调查防病效果，共调查三次。
80.调查数据及计算：每次防效调查后计算病情指数，比较施肥前后处理区与对照区病情指数，计算相对防效。数据代换后，进行方差分析，检验其差异显著性；结果见表4。
81.不同配方菌剂处理对水稻纹枯病病情指数的影响表4.微生物菌剂防治水稻纹枯病调查表 从试验结果（见表4）看，水稻破口初期进行处理，处理后 21天，对水稻纹枯病的防治效果：处理1-处理7分别为 60.3%、75.7%、66.2%、65.4%、62.7%、77.4%、82.2%。微生物菌剂对水稻纹枯病具有一定的防治效果；对作物安全。其中处理2、处理6、处理7的防治效果极显著。
82.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。