海藻栽培方法和系统与流程

atlantic coast”，于2018年9月在journal of applied phycology(应用藻类学杂志)上接受发表)已表明，能够对绉杉藻(sarcothalia crispata)进行实验室培育，并且如果已经接种了孢子，则这种海藻可使用已知的悬浮养殖系统来生长。还提出了诸如直接在天然底物上接种孢子的技术。然而，迄今为止，由于在扩增实验室方法期间出现的各种困难，所以这些提议尚未在商业规模水产养殖系统上实施。一个问题是含有λ-角叉菜胶的海藻具有很强的季节性，并且它的叶不能在冬季存活，此时只剩下海藻的固定盘。这限制了实验室方法的适用性，并且使得扩增困难。
8.本发明尝试通过提供大规模栽培角叉菜植物海藻的方法来解决上述缺点。本发明的方法能够提供工业批次的纯λ角叉菜胶。
9.本发明提供一种栽培角叉菜植物海藻的方法，该方法包括：
10.a.提供海藻的繁殖组织，优选地是含有孢子的叶；
11.b.通过以下方式从繁殖组织中释放孢子：
12.(i)使繁殖组织与非盐水溶液接触；
13.(ii)使繁殖组织至少部分地脱水；
14.(iii)使至少部分地脱水的组织与第一盐溶液接触以产生含孢子盐水；以及
15.(iv)任选地过滤该含孢子盐水；
16.c.将含孢子盐水添加到含有第二盐溶液和底物的容器中并且允许孢子沉降在底物上，其中所述底物至少部分地浸没在所述第二盐溶液中；
17.d.使孢子在底物上萌芽；以及
18.e.从萌芽的孢子生长海藻。
19.步骤a的繁殖组织优选地是从野生收获物中获得的叶。优选地，叶是呈现含有孢子的繁殖结构的全叶。
20.本发明人已经发现，步骤b(i)处描述的非盐水接触有助于使囊果的细胞壁变得脆弱，这有助于随后大量孢子释放。另外，该步骤消除了可能的污染物和不需要的生物体。优选地，非盐水是淡水或自来水，并且也可以是饮用水。
21.发明人发现，过滤步骤b(iv)是优选的，用于去除杂质诸如硅藻，从而确保用于接种底物的孢子溶液尽可能清洁。
22.发明人发现，与现有技术相比，用于用淡水清洗、脱水和渗透压休克(即步骤(ii)中的盐溶液接触)的时间段提供了更好的结果。
23.第一盐溶液和第二盐溶液可具有相同的盐浓度并且它们优选地含有海水，更优选地是从大海中养殖海藻的地点的提取的海水。优选地，海水已经被过滤和消毒，如稍后将描述的。盐溶液的盐度可优选地与收获叶的当地区域中的天然海水的盐度相匹配。因此，盐度为优选地2％-6％、更优选地3％-5％、还更优选地3％-4％、并且最优选地3.1％-3.8％或3.5％的盐。盐度在本文中被理解为1kg水含有的盐的量(以％表示)。
24.本文所描述和要求保护的盐溶液的温度优选地介于10摄氏度和14摄氏度之间，并且最优选地介于10摄氏度和12度之间。
25.本发明的方法包括在步骤b(i)处，使海藻的繁殖组织与非盐水溶液接触，该非盐水溶液为例如包含水并且不含盐或尽可能少含盐的溶液，例如相对于非盐水的总重量为至多3.5重量％、优选地至多3.0重量％的盐。最优选地，非盐水溶液含有的固体残余物的总量
至多1.5g/l、更优选地至多1.0g/l、最优选地至多0.7g/l。固体残余物的总量可通过将1l水蒸发至干燥并称重固体残余物来测量。固体残余物含有盐，例如钠、钾、钙、镁、氯化物、硫酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐和/或硝酸盐。优选地，使繁殖组织与该非盐水溶液接触长达一小时并且优选地至多30分钟、更优选地至多15分钟、甚至更优选地至多5分钟、最优选地在15秒与3分钟之间。在实践中，可通过将繁殖组织浸没或浸泡在非盐水溶液中至少一次、2次至3次或更多次来进行该接触。发明人惊奇地发现，该淡水处理步骤进一步增强了孢子释放机制。
26.在步骤b(ii)中，繁殖组织至少部分地脱水。优选地，所述组织所含有的水分的量为至多95重量％、更优选地至多85重量％、最优选地至多75重量％。可使用任何脱水方法，例如，在烘箱中、在太阳下或在通风空间中干燥，或使用吸水纸。
27.在步骤b(iii)中，通过使所述组织经受渗透压休克来从部分脱水的组织中释放孢子。渗透压休克是通过使所述至少部分脱水的组织与第一盐溶液接触来实现。第一盐溶液与部分脱水的组织的比率优选地高达每10l盐溶液5kg组织、更优选地1kg至3kg组织并且最优选地约2kg组织。在实践中，可将组织浸入含有10l盐溶液的容器中。
28.优选地，所述至少部分脱水的组织与第一盐溶液的接触是在足以产生孢子浓度为每升至少1000万个孢子、更优选地每升至少3000万个孢子、最优选地每升至少5000万个孢子的含孢子盐水(在步骤b中)的时间段内实现。优选地，所述孢子的浓度为每升5000万至9000万个孢子、更优选地每升5500万至7500万个孢子、最优选地每升6000万至7000万个孢子。
29.在发现孢子浓度不够高的情况下，这可能是由于繁殖组织不够成熟。如果是这种情况，则过程可使用更成熟的繁殖组织再次开始，例如，在收获第一繁殖组织的几天后。
30.在本发明的步骤c处，使底物与含孢子盐水接触，从而使得孢子沉降在底物上。为了确保所述底物与含孢子盐水之间的有效接触，所述底物优选地至少部分地、更优选地完全地浸没在含有第二盐溶液的容器中，并且将含孢子溶液添加到所述第二盐溶液中。优选地，添加所述溶液是为了确保孢子在容器中均匀分布。优选地，对容器中的第二盐溶液的量进行调节以在添加了含孢子盐水之后得到至少250万/升、更优选地至少350万/升、最优选地至少450万/升的孢子浓度。优选地，容器中的孢子浓度介于250万/升和1000万/升之间、更优选地介于350万/升和750万/升之间、最优选地介于450万/升和550万/升之间。将孢子浓度调节为上述水平会确保有效的孢子萌芽。
31.可使用任何底物，例如织物、绳、面板、任何确定或不确定形状的物体。优选地，底物是纱线、绳或网。纱线是含有多根长丝的细长主体，而绳是含有多根纱线的细长主体。绳可进行铺设、缠绕或编织。网通常是由绳间隔接合以形成网格。优选地，所述纱线是合成纱线，并且优选地，绳是由所述合成纱线制成。合成纱线是长丝由聚合物制成的纱线，最优选的聚合物是聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚芳酰胺和聚酰胺。优选地，底物是网，其中所述网的网格具有直径(当网悬浮在水下并且没有在网上施加任何负载时测量的开口的最大尺寸)为至少5mm的开口。优选地，所述网由含有聚酰胺(例如尼龙)绳的绳制成。在测试中，发明人发现这种类型的网适合于孢子的萌芽。已经发现这些浓度在底物上的高萌芽率与降低孢子死亡率之间取得平衡。
32.有利地，在使用之前，将底物用非盐水进行洗涤和例如用沸腾的水或接近沸腾的水进行消毒。优选地，在孢子固定之前去除底物上存在的任何化学品(例如防污化合物)。然
而，在底物先前未用任何化学品进行处理的情况下，该步骤可能没有必要。
33.有利地，在步骤d处在底物上萌芽的孢子的数量为每线性厘米底物至少50个、更优选地至少100个、甚至更优选地至少150个。最优选地，在底物上萌芽的孢子的数量为每线性厘米底物至少500个。这些萌芽孢子水平确保了海藻的高产率，特别是当将底物转移到公海时。本发明人已经发现，本文所描述的方法和系统因该方法释放大量孢子的能力、这些孢子的质量(可使用显微镜观察)以及用于接种底物的所述孢子密度而提供这些高萌芽孢子水平。本发明提供了底物上的高孢子萌芽水平以及低孢子死亡率。
34.方便地是从绉杉藻(sarcothalia crispata)收获繁殖组织，但本发明也可用于其他类型的海藻，包括皱波角叉菜(chondrus crispus)或杉藻属红藻类植物(gigartina skottsbergii)。优选地，当海藻是绉杉藻(sarcothalia crispata)时，海藻繁殖组织从海藻的囊果期获得，如下所述。
35.囊果期产生果孢子，该果孢子萌芽以产生四孢子体期。这一时期的叶含有λ角叉菜胶，这在食品工业中是特别理想的。
36.本发明还提供了一种用于栽培海藻的系统，该系统包括：
37.·
设备，该设备用于从海藻繁殖组织释放孢子以产生含孢子盐水，该设备包括用于使海藻繁殖组织与非盐水溶液接触的非盐水溶液站、用于使海藻繁殖组织至少部分地脱水的脱水站、用于使海藻繁殖组织与第一盐溶液接触的盐溶液站和任选地至少一个过滤器；
38.·
底物，该底物用于使孢子萌芽；
39.·
容器，该容器用于第二盐溶液以至少部分地浸没底物，以使底物与含孢子盐水接触和使孢子萌芽；和
40.·
生长站，该生长站用于从孢子生长海藻。
41.使用本发明经由孢子来繁殖海藻诸如绉杉藻(sarcothalia crispata)具有几个优点，这些优点已被发明人注意到，包括但不限于以下：
42.·
繁殖叶可产生和释放数千个孢子，这意味着海藻的繁殖潜力非常高；
43.·
因此，从相对少量的繁殖材料开始，本发明的用户可栽培出大量海藻；
44.·
孢子容易放在人工底物上，该人工底物优选地被洗涤以去除化学物质；
45.·
海藻从孢子的生长在公海相对较快，从而导致海藻在4个月到5个月内可收获；
46.·
角叉菜植物物种的栽培允许本发明的用户根据食品工业的需要以及需要提取的特定角叉菜胶来选择要收获的叶的类型，这将在下文进一步解释。
47.现在将参考绉杉藻(sarcothalia crispata)和附图描述本发明的各个方面，但不限于此，在附图中：
48.图1是绉杉藻(sarcothalia crispata)的成熟示例的表示；
49.图2描绘了绉杉藻(sarcothalia crispata)的生命周期的示意图；并且
50.图3描绘了与本发明一起使用的播种装备。
51.绉杉藻(sarcothalia crispata)生命周期
52.绉杉藻(sarcothalia crispata)是层状海藻，即具有叶片状结构，其通常分布于大海的下潮间带至潮下带，深度约10m，并且其在自然保护环境和半保护水域(即主要不在公海)中丰富并且生长在坚硬底物(诸如岩石或软体动物壳)上，形成广阔的草甸。图1中示
出了物种的示例1的示意图。该海藻的叶2呈红紫色至红棕色，大小不一，长度可达到长达1.5m。海藻通过小基盘3固定到底物，从该小基盘3上形成短气孔，带有一个或几个宽的圆形的叶片，大小不一。海藻可在叶的边缘上呈现小增殖，类似于物种的纤毛特性。它呈现出三相同构生命周期，并且主要分布于智利和阿根廷的海岸。例如，在智利，该物种分布在纬度36
°
s至54
°
s。
53.绉杉藻(sarcothalia crispata)的天然草甸在生物量和密度方面显示出季节性变化，这意味着草甸中存在的海藻的质量以及因此密度全年都在变化。在南半球的夏季(一月至三月)观察到最大量的生物量。这些生物量在秋季(四月至六月)减少，并且在冬季(七月至九月)和春季(十月至十二月)达到最低水平。随后在晚春和初夏生物量又开始再生。该资源的生物量的量在深秋或冬季减少与繁殖叶的成熟和孢子的大量释放相关联，其后通常会发生随后的组织坏死和叶的碎裂。因此，该物种的叶是季节性出现的，而基盘通常存活两年以上并且在接下来的季节能够在草甸上再次再生生物量。与夏季天然草甸的成熟期有关，生物量主要是植物性的。
54.在图2中示出了的绉杉藻(sarcothalia crispata)的生命周期。从图2的右手侧开始，示出了四孢子叶4(也称为四孢子体)，它为二倍体(2n)，即每个细胞含有2组染色体。
55.海藻的成熟四孢子体期形成四孢子囊，通过减数分裂产生单倍体(n)四孢子5，平均大小为20μm。这些四孢子5在与底物接触时萌芽以形成具有叶的配子体，其中配子体可以是雌性6a或雄性6b。
56.雌配子体6a在其叶中产生具有雌配子7a的繁殖结构。从雄配子体6b释放雄配子7b会导致受精(由图2中的虚线表示)。受精的雌配子被称为果孢子体(2n)，并且它与雌配子体一起作为一个包膜生活在具有囊果叶的所称的囊果8中。接下来，果孢子体释放平均大小为22μm的果孢子9(2n)，其萌芽以产生四孢子体4，从而结束生命周期。
57.因此，在天然草甸中，能够同时发现来自所有三个时期(四孢子体、配子体和果孢子体)的个体，并且这三个时期不一定严格隔开。然而，已在野生中发现，超过75％的草甸可由配子体叶和果孢子体叶组成。这些叶是同构的，除在显示出繁殖结构时之外。
58.生命周期对本发明很重要，因为海藻的不同时期产生含有不同角叉菜胶的叶。配子体叶6a和6b含有κ和ι角叉菜胶。四孢子叶4主要含有λ角叉菜胶。因此，作为本发明的一部分，可以取决于需要哪种类型的角叉菜胶而对特定类型的片段起作用。有利地，如果市场需要λ角叉菜胶，则本发明可用于通过使果孢子9萌芽来栽培四孢子叶4。如稍后解释的，这将需要最初收集囊果叶8以提供果孢子9。
59.本发明涉及一种用于栽培海藻以产生角叉菜胶并且特别是用于栽培绉杉藻(sarcothalia crispata)的新颖方法和系统。虽然本领域已知用于海藻栽培的方法，但本发明人发现这些方法不适于大量生长并且因此无法用于栽培绉杉藻(sarcothalia crispata)。本发明人研发了用于生产高密度作物的新颖技术，导致比本领域先前已知的更高质量叶的更大收获。这导致角叉菜胶(尤其是λ角叉菜胶)的产率更高，具有比先前实现的更高的纯度。
60.通常，本发明的方法涉及两个主要部分：首先，在孵化场中，用孢子对底物进行授精，其次在公海中生长海藻。现在将参考优选的进行方式来描述本发明的方法和系统。
61.然而，应当理解，本发明由权利要求书限定，并且可优选地不被视为限于下文所描
述的特定方法，该特定方法仅被呈现为执行本发明的一种方式。
62.底物的选择
63.本技术的发明人解决的首要问题之一是找到最合适的底物，该底物允许实现足够密度的盘或幼苗，以便随后在大海中成功培育海藻。为方便起见，本发明人使用渔网作为底物，因为它们相对便宜并且在水产养殖业中容易获得。在研发本发明时，本发明人测试了三文鱼养殖业中常用的三种类型的渔网作为人工底物。
64.通常，用作本发明中的底物的网可具有大于零至2cm、优选地1mm至1.5cm、更优选地4mm至1.1cm以及最优选地5mm至1cm的网格大小。在此网格大小是指构成网的栅格的编织或单丝线的直径。通常，孔径大小(栅格中的开口的大小)可大于零并且高达15cm、优选地高达10cm或11cm、更优选地为5cm至8cm并且最优选地为2英寸(5.08cm)或4英寸(10.16cm)。
65.有利地，构成网的一条或多条线可以是按任何比例包含聚丙烯和/或尼龙和/或聚乙烯的合成材料，该比例为例如所列塑料中的任何两种中的每一者为50％、所列塑料中的任一者为100％、或所有所列三种塑料中的每一者为33％。特别优选的底物包含尼龙和聚丙烯，优选地每种塑料的比率为50:50、40:60或30:70。还可优选的是使底物包含基本上100％的尼龙或聚丙烯。另选地，一条或多条线可包含非合成材料，诸如剑麻、大麻、黄麻或棉。在实践中，底物可以是允许孢苗萌芽的任何合适的材料。
66.发明人测试的第一个网是直径为1厘米并且开口为4英寸的厚网格，由50％的尼龙和50％的聚丙烯制成，接缝光滑且打结。第二个测试网具有5mm直径的网格和约10cm的开口，由尼龙和聚丙烯制成，具有光滑的接缝和结。第三个测试网具有约5cm的孔径，网格直径为5mm，并且在没有结的情况下仅由尼龙制成。在实践中，发明人发现，具有4cm至15cm开口的尼龙网最适用于海藻的萌芽。这种网表现出最好的孢子固定效果，并且此外当网转移到大海中时，允许足够的水流过网，以促进海藻的生长。然而，测试的其他类型的网也是足够的。使用渔网作为底物的优点是其可重复使用，并且可从一个季节使用到下一个季节。另外，此类网已经在市场上销售，这意味着不需要研发和购买特殊底物。
67.底物的准备
68.在制造过程的一部分中，诸如渔网等全新底物通常会在网的线中含有化学品。本发明人发现，在使用前彻底洗涤底物以去除任何不需要的化学品，对于成功栽培海藻是有利的。
69.根据本发明的一个方面，优选地可通过用淡水(非盐水)反复洗涤底物以从底物基质中释放出任何化学品来准备底物以供使用。洗涤后，可优选地更换淡水以去除化学杂质，并且该过程可优选地重复至少三天至四天。然后优选地通过与先前煮沸的或正在沸腾的水反复混合至少3分钟来对底物进行消毒。然后可在远离环境污染物的受控位置干燥底物，例如在户外悬挂五天以干燥。
70.孵化池的准备
71.为大规模播种海藻，诸如绉杉藻(sarcothalia crispata)，优选的是使用孵化池作为容器，因为此类池塘可容纳大量人工底物并且以受控方式维持温度、盐度和氧气和光照条件，如下所述。该池塘可优选地是轻质的以便于容易处理，并且可优选地是白色的，使得操作员可知道池塘是否清洁。在这方面，由玻璃纤维材料(典型厚度为3mm或4mm)制成的池塘非常合适。池塘可优选地在使用中每七天清洁一次，在这种情况下，底物暂时被移出并
放入装有经过过滤和紫外线消毒的海水的容器中，直到池塘准备好再次使用。池塘可优选地不使用氯化溶液来洗涤，因为发明人发现这会阻碍孢子的生长。洗涤溶液的氯含量优选地为零，但可高达1ppm至3ppm。
72.成熟繁殖生物量的收集
73.为了开始播种人工底物的过程，第一步是从公海中现有的草甸收获海藻繁殖组织。这可优选地从大海的尽可能靠近孵化场的区域进行，因为提取地点和孵化场越远，叶的分解程度可能就越大。提取和孵化之间的转移时间可优选地不超过10小时、更优选地至多7小时、甚至更优选地至多5小时、最优选地至多3小时。发明人发现，一年中最有利的叶收集时间是六月至八月中旬，尽管原则上只要野外有繁殖组织可用，本发明就可在任何时间进行。作为从公海收获繁殖组织的替代方案，应当理解，繁殖组织也可从人工环境(例如生长在槽罐或池塘中的海藻)获得。
74.如前所述，在本发明的有利方面，待使用的繁殖组织是囊果叶8，该囊果叶释放果孢子9，从而导致含有λ角叉菜胶的四孢子叶4。因此，从大海中收集这些囊果叶8的个体潜水员可优选地能够识别它们并且还能够识别它们处于成熟的繁殖状态。当海藻成熟并且繁殖结构可见时，训练有素的潜水员能够通过眼睛区分囊果和四孢子。潜水员通过切割叶并将基盘原位留在草甸上来收获叶。这是一种可持续的做法，并且也可防止收获的海藻带入杂质。
75.一旦收获，繁殖组织优选地被保护免受阳光、干燥和雨水的影响，例如在聚苯乙烯容器中。阳光/雨水/干燥造成的损害可能导致孢子释放不良，并且导致海藻产率下降。
76.一旦收获，可对所收集的叶进行进一步选择，以选择最佳繁殖材料。理想地，所选择的叶可优选地长度大于10cm、更优选地为至少20cm、最优选地为至少30cm，并且可优选地不存在任何损伤或坏死。另外，繁殖组织可优选地不含内生菌，例如在组织上被观察为黑点的细菌或真菌；这些黑点可通过在阳光下观察组织来最佳识别。
77.一旦运送到孵化场，繁殖组织就会被收集在容器(例如池塘)中，并且优选地用经过滤(1微米网格)和经紫外线消毒的海水进行洗涤以去除杂质(沙子、食草动物、藻类和可能通常附着在所述组织上的其他生物体)。为了在下一阶段(孢子形成)中使用，可优选地选择全叶作为繁殖组织，其具有丰富的繁殖结构并且处于明显的成熟状态、清洁并且具有最小的坏死。所选择的叶可优选地在叶片中不显示内生菌，并且叶的整个区域可优选地存在繁殖结构(囊果)。叶可优选地不显示任何坏死迹象，因为这可能污染容器的其余部分。另外，在具有坏死的叶中，孢子可能无法完全存活。
78.理想地，所选择的叶可优选地在收集后立即或尽可能快地(例如从收获时起长达6小时但优选地长达4小时或更优选地长达2小时或1小时)用于下一孢子形成阶段。然而，如果需要，可将叶留在装有经过滤和消毒的海水并持续曝气的容器中或者优选地在没有额外水的隔热容器(例如聚苯乙烯)中长达24小时。在这之后，不建议使用叶进行孢子形成，因为孢子的密度及活力可能已经降低。
79.孢子释放(孢子形成)
80.本发明人已经发现，通过控制若干环境因素，诸如容器中的盐水温度、水(其优选地为海水)的盐度、盐水的氧含量、光强度和光质量(即光的光谱分布(波长的组合)，其优选地尽可能与自然阳光相匹配)，可获得良好的孢子产率并且因此获得良好的海藻作物。另
外，优选的是，容器中的萌芽孢子的放养量不要太高，以避免死亡并有利于生长。
81.可向容器中添加营养物以促进生长。发明人已经发现，提供介于3000mg/l与15000mg/l之间、更优选地介于5000mg/l与8000mg/l之间的可用磷酸盐(例如5000mg/l-7500mg/l p)、介于50mg/l与1000mg/l之间、优选地介于100mg/l与500mg/l之间的可用钾碱(例如100mg/l-300mg/l k)以及介于0.01mg/l与1mg/l之间、优选地介于0.1mg/l与0.5mg/l之间的可用氮(例如0.2mg/l-0.4mg/l n)的营养组合物适合于与本发明一起使用。
82.水的盐度可优选地与收获叶的当地区域中的天然海水的盐度相匹配。理想地，待使用的水可以是天然海水，其优选地经过消毒，如本文所述。因此，盐度为优选地2％-6％、更优选地3％-5％、还更优选地3％-4％、并且最优选地3.1％-3.8％或3.5％。通常，氧含量可为1ppm-10ppm溶解氧、或者3ppm-9ppm并且优选地高于6ppm、7ppm或9ppm溶解氧。溶解氧可通过使用公知的且广泛市售的溶氧计来测量。这些盐度和氧参数适用于本说明书中提及的所有盐水。容器中的盐水的温度优选地保持在6℃至16℃、优选地10℃-14℃并且最优选地10℃-12℃的范围内。
83.关于物理因素，如已经提到的，重要的是使孵化场尽可能靠近大海，以便最小化收获繁殖组织和孢子形成之间的时间。此外，大海优选作为容器的海水源。在用于容器和本文所述的其他过程之前，海水可优选地用一个或多个(并且优选地两个)过滤器(任选地具有0.5μm-2.0μm或约1μm的网格大小)进行过滤并且使用紫外线源进行消毒以消除细菌和原生动物。当在本说明书中提到海水的消毒时，应当理解，这些过滤器和紫外线参数也是意指的。
84.现在描述从收获的繁殖组织获得孢子的过程。在本发明之前，本领域已知通过涉及叶脱水、施加渗透压休克、筛分含孢子液体和孢子计数的方法从果孢子体期的成熟叶获得含孢子液体。在本发明的研发期间，发明人测试了几种传统的孢子释放方法，但这些方法未能成功地提供高浓度的活孢子。
85.虽然本领域已知的方法可潜在地从繁殖组织释放孢子，但孢子沉降和盘萌芽的成功率在所使用的底物上非常低。
86.因此，下文将描述的根据本发明的方法和系统是对现有技术的改进，通常提供每千克繁殖组织超过7000万个孢子，其中孢子质量远比现有技术更好。使用本发明获得的孢子是高度可存活的并且具有强烈的微红色、球形形状并且基本上没有不规则性。提供更有活力的孢子可确保在所用底物上的沉降概率更高，并且减少因无活力孢子死亡而导致的原生动物和细菌引起的污染。
87.因此，本方法中使用的孢子形成方法不仅提供了高密度的孢子(即每千克繁殖组织有大量孢子)，而且提供了高质量的孢子。
88.通常，本发明的孢子形成方法通过在清洁叶以消除附生植物之前从成熟的繁殖海藻中去除繁殖叶的固定盘来提供繁殖组织。
89.在本发明的方法中，首先将繁殖组织并且特别是叶浸泡在装有淡水而不是盐水/海水的容器中，例如长达1小时并且优选地长达至少1分钟、更优选地至少5分钟、最优选地1分钟至30分钟。该步骤可涉及将海藻浸泡或泡在淡水中至少一次、或多达2次-3次或更多次，而不是永久浸没在水中。发明人惊奇地发现，该步骤有助于促进孢子的释放。其次，使繁殖组织并且特别是叶至少部分地脱水，其方式是通过从其中去除水分，例如通过使用吸水
纸并将叶放在铺有吸水纸的桌子上以使叶脱水。该步骤优选地执行至少5分钟、更优选地至少15分钟、最优选地至少30分钟。优选地，脱水步骤进行至多1小时。优选地，从浸泡的叶中去除至少5重量％的水、更优选地至少10重量％的水、最优选地至少25重量％的水。
90.脱水后，发明人应用渗透压休克，这会破坏层状组织并且使得释放孢子(孢子形成)，其方式是通过将脱水海藻浸泡在装有第一盐溶液的容器中长达至少15分钟、更优选地至少30分钟、最优选地至少1小时的时间，因此可释放孢子。在去除繁殖组织以留下含孢子液体之前，还可用手按压繁殖组织以从组织释放尽可能多的孢子。
91.一旦获得含孢子液体，就可对其进行过滤以去除杂质和组织碎片。绉杉藻(sarcothalia crispata)的孢子的平均大小为19μm至22μm。因此，例如，孔隙大小为44μm或45μm的筛允许孢子在保持碎片的同时通过。可使用多于一个筛，例如两个筛。
92.作为本发明的过程中的任选步骤，可对含孢子液体进行采样以检查孢子密度。可从主要批次的含孢子液体中取出等分试样的含孢子液体，并且可在显微镜下观察孢子的状态(颜色和形状)。可生长且未死亡的状态良好的孢子呈现橙色和球形形状。可例如使用sedgewick rafter计数室对孢子进行计数，该计数室用于对一毫升水或其他透明液体中的颗粒和微生物进行计数。这样，可计算和提供每毫升的孢子数量。发明人已经发现，本发明的特别有利的孢子计数是每升2000万-1亿个孢子，优选地为每升4000万-8000万、更优选地5000万-7000万并且最优选地6000万-6500万个孢子，即每毫升60,000-65,000个孢子。如果孢子计数大于所公开的最大范围，则可以本领域已知的方式有利地将含孢子液体稀释至最优选的范围。通过处理适量的繁殖组织，可达到优选的孢子计数，一旦知道目标孢子数量，就可常规确定。
93.底物的接种
94.在提供含孢子盐溶液之后，将该溶液倒在底物(例如，先前描述的渔网)上，该底物布置在孵化场中的容器中。已经如上所述那样准备底物。在这方面，将底物放入填充有第二盐溶液(优选地为海水)的槽罐中。搅拌或摇动含孢子盐水以获得整个盐水中的均匀孢子分布，这是因为孢子倾向于沉降在溶液的底部。然后将摇动或搅拌的含孢子盐水倒在底物上，并且优选地向海水中添加营养物，例如每升海水1ml液体营养物。发明人已经发现，如果底物在孢子释放之后尽可能快地接种，但优选地在孢子释放的2小时内、更优选地在1小时内并且最优选地在30分钟内接种，则实现最佳结果。
95.为了以均匀方式将孢子溶液添加到容器中，发明人研发了图3中描绘的播种机10。播种机10包括支撑一系列平行管11的框架12，所有管在其下表面(未示出)上都有孔以允许孢子溶液通过。溶液经由开口14被倒入保持罐13中并穿过管11，其中其通过孔沉降并进入容器中。
96.关于槽罐中的孢子浓度，发明人已经发现，合适的值为每500l盐水10亿至100亿个孢子，优选地为每500l盐水15亿至80亿个孢子、更优选地20亿至60亿个孢子、最优选地21亿至40亿个孢子或24亿至26亿个孢子。表1示出了每个底物的干燥收获生物量的平均量，其中基于孵化罐(每个罐容纳500l盐水)的水中的孢子浓度计，底物是具有2mx4m的面积的网。
97.表1：每500l罐的孢子数量(左栏)与每2mx4m网的平均干燥收获叶以kg计(右栏)。
[0098][0099][0100]
将接种的底物置于静置状态(不更换盐水或营养物并且不添加空气)优选地长达至少1天、更优选地至少3天、最优选地5天至7天。在该接种期之后，有利的是更换容器中的盐水和营养物。盐水的温度可优选地保持在至少6℃并且优选地6℃-16℃、更优选地10℃-14℃并且最优选地10℃-12℃。
[0101]
在接种期期间，光照条件可优选地为8:16小时的光照:黑暗比率。
[0102]
在接种期之后，优选地通过采样和使用显微镜来观察孢子的生物状态。同样，在接种期之后，优选的是更换容器中的水和营养物。如果在采样期间观察到存在大量生物体(例如硅藻)，则优选的是添加一定量的消毒剂，例如二氧化锗，其浓度为每升2ml，在水中停留48小时，然后再次更换海水和营养物。
[0103]
在接种期之后，将底物保持在容器中长达至少1天、更优选地至少5天、甚至更优选地至少15天、最优选地至少20天。随后，可轻轻洗涤底物以避免硅藻或其他附生植物的增殖或增加。可通过从容器中取出底物并将它们放入装有经过滤的海水(例如1微米过滤和紫外线辐射消毒)的容器中来实现底物的洗涤。发明人发现，这种洗涤不会损坏与底物良好附接的固定盘。有利地，用于接种的容器可在清洁底物的同时进行清洁以避免不必要的干扰。
[0104]
关于非生物因素，发明人已经发现，容器中盐溶液的温度可优选地介于10℃至14℃之间。盐度可优选地介于30ppm至33ppm的盐之间。氧气可优选地介于5mg/l至8mg/l的盐水之间。光强度可优选地为约25ppfd至55ppfd(μmol m-2
s-1
)。在海水的温度升高超过建议限度的情况下，可优选地每三天至四天补充一次盐水。
[0105]
最后，有利的是，在转移到大海中之前，播种底物的固定盘密度为每线性厘米底物至少150个盘，并且优选地为每厘米至少200个或250个盘。发明人发现，该盘密度在大海中
提供了足够高密度的幼苗以产出高产量的海藻。最优选地，每线性厘米至少500个盘的值保证了栽培海藻的高生产力。表2示出了每线性厘米的盘数与海藻的平均干产率。
[0106]
表2：每线性厘米底物的盘数(左栏)与从2mx4m面积的网产出的平均干海藻以kg计(右栏)。
[0107]
59-791,201014,291172,081233,401551,361661,512442,422512,162810,452972,633231,6534411,783782,234001,964302,404502,395262,645362,695723,16
[0108]
将播种的底物转移到大海
[0109]
孢子萌芽后，可将播种的底物转移到大海。这可优选地仅在幼苗出现直立轴后完成。底物可从容器中取出并运输到大海。然后，可在水面下优选地1m至3m的深度处将底物连接到已知的耕种系统。为了使生长良好，同样重要的是将作物种植在具有足够水运动以及水清澈度的区域。在大约四个月到五个月内，发明人发现海藻中将出现可收获的叶。
[0110]
使用本发明的方法，发明人已经能够实现平均每m2网0,4kg干海藻质量和高达1kg/m2的产率。
[0111]
结果
[0112]
角叉菜胶是从由本发明生产的绉杉藻(sarcothalia crispata)的已收获四孢子体叶中提取的，并且使用改编自以下文章的方法来准备以用于分析：“hybridicity of carrageenans water
–
and alkali-extracted from chondracanthus chamissoi,mazzaella laminaroides,sarcothalia crispata,and sarcothalia radula”，j appl.phycol(应用藻类学杂志)(2011)23:105-114，作者为diane jouanneau、patrick boulanguer、jacques mazoyer、william helbert。
[0113]
使用1h-nmr分析角叉菜胶样品，假设100％钾作为抗衡离子。如下表3所示，样品主
要包含来自λ家族(λ和ξ；每栏代表角叉菜胶家族成员，含量以百分比计)的角叉菜胶。1h-nmr以质量％表示，每个角叉菜胶分数是相对于角叉菜胶的总量表示。这表明了本发明的方法和系统生产提取自海藻的高纯度λ角叉菜胶的能力。
[0114]
表3.
[0115][0116]
结论
[0117]
绉杉藻(sarcothalia crispata)的繁殖潜力非常高，并且该物种的孢子很容易附着在人工底物上，条件是底物在接种前经过适当处理，如上所述。绉杉藻(sarcothalia crispata)孢子在孵化场的生长速度很快，并且在45天内就能够获得可转移到大海中的幼苗。
[0118]
在野外，已经发现可实现每平方米约200克-300克的湿生物量。另一方面，使用本发明的方法和系统，已经发现能够实现平均每平方米网2kg并且甚至高达5kg的湿生物量，这与野外收获相比是很大的提高。
[0119]
本发明允许以工业规模生产纯批次的λ角叉菜胶，例如，相对于批次总质量含有优选地至少80重量％、更优选地至少90重量％、最优选地约100％的λ角叉菜胶并且重量为至少100kg、更优选地至少500kg、最优选地至少1000kg的批次。也就是说，对于一批收获的海藻，λ角叉菜胶含量基于所有角叉菜胶的质量计为至少90重量％、更优选地至少95重量％、最优选地约100％，并且λ角叉菜胶的质量为至少100kg、更优选地至少500kg、最优选地至少1000kg。在本文中，“收获批次”是指在一个实例中收获的单个海藻批次，其不与其他批次混合或组合，并且其中λ角叉菜胶的浓度没有以其他方式浓缩。
[0120]
当用于本说明书和权利要求中时，术语“包含(comprises)”和“含有(comprising)”及其变型意指包括指定的特征、步骤或整体。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
[0121]
在前面的描述或以下权利要求或附图中公开的特征以其特定形式或以用于执行所公开的功能的装置来表示，或用于适当地获得所公开的结果的方法或过程可单独地或以此类特征的任何组合用于以其各种不同的形式实现本发明。尽管已描述了本发明的某些示例性实施方案，但所附权利要求书的范围并非旨在仅限于这些实施方案。权利要求应按字面意思、有目的地和/或涵盖等同物进行理解。