脱落酸作为负调控因子在调控植物体内5-羟色胺合成中的应用

1.本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及脱落酸作为负调控因子在调控植物 体内5-羟色胺合成中的应用。


背景技术：

2.前期水稻根部蛋白质组学研究表明，5-羟色胺合成基因ost5h敲除可以促进栓质 的沉积。主要表现为两个方面：第一，ost5h基因敲除造成5-羟色胺合成受阻可以促 进次级代谢物质合成基因的表达，这些芳香类次级代谢化合物中就包含有栓质芳香部 的成分，例如p-香豆酸(p-coumaric acid)，阿魏酸(ferulic acid)；第二，ost5h基因 的缺失也会促进糖酵解途径，其中多个蛋白质表现出上调。糖类作为主要的能源物 质，正常情况下进入tca循环而产能，但是ost5h基因缺失突变中，tca途径被抑 制而脂肪合成途径上调。脂肪类化合物中就包含栓质脂肪部的成分。我们从gc-ms 测定中也证实了敲除ost5h基因促进栓质的合成。芳香部以及脂肪部均表现出上升 的趋势，从而促进其复合物栓质的沉积。所以，在水稻根部中ost5h作为负向调控 因子，抑制栓质的沉积，两者存在拮抗关系。相关研究结果已经在前期专利申请(申 请号：202010914857.x)中进行了详细阐述；表明5-羟色胺抑制栓质合成。
3.aba作为一种抗逆激素已经得到广泛认可，它能够在多种逆境胁迫反应中发挥 调控作用，降低逆境胁迫对植物的损伤。例如高盐胁迫下，aba大量诱导合成， aba可以通过调控气孔开闭，减少水分散失，同时也可以通过诱导抗逆相关基因的 表达，提高植物抗逆性。
4.目前，还未有关于aba是否参与5羟色胺调控途径的研究。


技术实现要素：

5.本发明提供了脱落酸作为负调控因子在调控植物体内5-羟色胺合成中的应用，首 次发现脱落酸与5-羟色胺之间的关系，并进一步地发现脱落酸通过抑制植物体内 ost5h合成基因的表达来负调控植物体内5-羟色胺的浓度，从而促进植物的栓质化， 提高植物的抗盐性，可为保水抗旱型水稻种植资源的培育奠定基础。
6.具体技术方案如下：
7.本发明提供了脱落酸作为负调控因子在调控植物体内5-羟色胺合成中的应用，所 述植物为水稻或拟南芥。
8.进一步地，所述脱落酸通过抑制植物体内ost5h合成基因的表达来负调控植物体 内5-羟色胺的浓度。
9.更进一步地，所述脱落酸为内源脱落酸或外源脱落酸。
10.本发明还提供一种降低植物体内5-羟色胺含量的方法，包括：向植株的根部外源 施加脱落酸；所述植株为水稻或拟南芥；所述脱落酸的浓度为0.1～10μm。
11.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
12.本发明发现脱落酸与5-羟色胺之间的关系，并进一步发现脱落酸通过抑制植物体 内ost5h合成基因的表达来负调控植物体内5-羟色胺的浓度，从而促进植物的栓质 化，提高植物的抗盐性，可为保水抗旱型水稻种植资源的培育奠定基础。
附图说明
13.图1为实施例1中aba负向调控5羟色胺合成基因ost5h表达的试验结果；
14.其中，a为外源添加5羟色胺对转基因植株ost5hpro::ost5h-gus-his和 oshsp900中ost5h基因表达量的影响结果；b为基因ost5h在野生型植株nipp与 osaba1突变体、osaba2突变体中的表达量结果；c为野生型植株nipp与osaba1突 变体中5羟色胺的浓度；d为野生型植株nipp与osaba2突变体中5羟色胺的含量比 较结果；e为jz-wt植株和jz-ko植株中5羟色胺的含量比较结果；f为xd-wt植 株、xd-ko植株和xd-oe植株中5羟色胺的含量比较结果。
15.图2为不同植株中5羟色胺及aba的测定结果；
16.其中，a为野生型nipp与osaba1突变体中5羟色胺含量测定的液相图谱；b为 野生型nipp与osaba2突变体中5羟色胺含量测定的液相图谱；在锡稻1#背景下， ost5h突变体xd-ko以及ost5h过表达植株xd-oe中aba含量测定的液相-质谱 图；在锡稻1#背景下，ost5h突变体xd-ko以及ost5h过表达植株xd-oe中aba 含量测定的液相-质谱图。
17.图3为在锡稻1#背景下，ost5h敲除突变体xd-ko以及ost5h过表达植株 xd-oe中aba合成通路上各基因的表达量。
18.图4为拟南芥中5羟色胺减弱栓质形成的数据结果；
19.其中，a为拟南芥添加外源5羟色胺后栓质区域变化情况；b为添加外源5羟色 胺后根部栓质化覆盖区域占比，suberized表示完全栓质化，patchy表示不连续栓质 化，non-suberized表示未栓质化；c为拟南芥经aba处理，再经5羟色胺后，栓质区 域变化情况；d为拟南芥经aba处理，再经5羟色胺后，根部栓质化覆盖区域占比， suberized表示完全栓质化，patchy表示不连续栓质化，non-suberized表示未栓质化； e-f为在添加不同浓度5羟色胺且含有75mm nacl的1/2ms培养基中培养的拟南芥 种子的照片、根长浓度结果和生物量结果。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施 例，但本发明的保护范围不仅限于此。
21.下列实施例采用的野生型水稻材料为嘉浙b(简称jz-wt)，并通过辐射诱变获得 5羟色胺缺失的突变体嘉浙lm(简称jz-ko)，该突变体在5羟色胺合成基因ost5h 中缺少一个碱基“g”，导致移码突变；另外，在野生型粳稻品种锡稻一号xi1(简称 xd-wt)的基础上，通过crispr获得5羟色胺合成基因ost5h的沉默品系ost5h-ko (简称xd-ko)，过表达品系ost5h-oe(简称xd-oe)。其中，制备突变体嘉浙lm 的方法来自γ射线诱变；制备5羟色胺合成基因ost5h的敲除品系ost5h-ko，过表 达品系ost5h-oe是通过将相应的dna片段连接进载体pcambia1301之中，并通 过农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得(制备过程均采用现有技术手段)。
22.下列实施例中所涉及的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，主要参考由 ausubel编写的current protocols in molecular biology,以及green mr和sambrook j 编写的molecular cloning:a laboratory mannual,4th ed.。实施例中所用的实验材料如 无特殊说明均为市售产品。
23.下列实施例中涉及的western印迹法，具体方法为：将研磨均匀的幼苗根部组织 加入至蛋白质提取液中(50mm tris
–
hcl,ph 7.4；2mm edta；2％triton x-100；1mmpmsf；5％mercaptoethanol；20mm naf).取上清，进行sds-page，进行蛋白分离， 湿转，将蛋白转移至pvdf膜，经一抗，二抗孵育之后进行曝光。
24.栓质层染色方法：各种水稻材料的根部切片，滴上荧光黄溶液(0.01％(w/v)，用 高温处理1h(70℃)，清洗，并用带有gfp过滤器的外荧光显微镜观察。
25.aba方法测定如下：称取0.1g经液氮研磨的粉末，加入1ml甲醇，同时混有稳 定同位素aba-d6作为内标，涡旋震荡，12.000g离心十分钟，取上清。真空旋转离 心直至干燥，加入100μl50％甲醇溶解，取上清。经hplc-ms测定。
26.实施例1
27.1、aba负向调控5羟色胺合成，aba-|5羟色胺
28.为了探究aba与5羟色胺合成酶基因ost5h之间的上下游关系，构建了转基因 植株ost5hpro::ost5h-gus-his。
29.具体构建方法为：构建ost5h启动子(启动子序列如seq id no.2所示)驱动下 的报告基因gus并进行转基因。截取基因ost5h上游2500bp作为启动子区域，通过 pcr的方法扩增获得并连接进载体pcambia1300，形成ost5hpro::ost5h-gus-his 载体，以gus作为报告基因，并以农杆菌转化法将片段转入水稻植株内，并筛选获得 阳性且纯合植株。
30.在水培液中加入不同浓度的aba，依次为0，0.1，1，10μm，对转基因植株 ost5hpro::ost5h-gus-his(简称ost5h-gus-his)处理12小时(以oshsp90作为 内参)。经水培液处理12小时后，提取根部组织蛋白并通过western bloting实验，观 察ost5h的表达是否受到aba处理影响。
31.具体方法如下:取经液氮研磨的根部组织粉末0.1g，加入1ml提取缓冲液(50mmtris-hcl，2mm edta，2％triton x-100,1mm pmsf，20mm naf,5％β-巯基乙醇)， 12000g离心10min，取上清即为蛋白粗提取物。蛋白质浓度定量根据thermo scientific 的bca protein assay kit进行测定。sds-page电泳胶的配置：10％分离胶5ml： 1.7ml 30％聚丙烯酰胺，1.3ml1.5m tris-hcl(ph8.8)，10％sds 50μl，10％过硫酸铵 50μl，2μl temed加水至5ml。2ml浓缩胶：0.33ml 30％聚丙烯酰胺，0.25ml1 mtris-hcl(ph6.8)，10％sds 20ul，10％过硫酸铵20ul，2ul temed，加水至5ml。 蛋白质加入上样缓冲液，100℃煮沸，上样。100v恒定电压下，待样品压缩至一根线， 切换电压至120v进入分离胶。电泳结束前开始准备转膜。剪取适当大小的pvdf 膜，甲醇活化：甲醇10ml浸泡5min，之后加入40ml水，慢慢加入，摇床快速 摇。之后pvdf膜移至转膜缓冲液中，浸泡15min。5
×
转膜缓冲液母液：tris，1.51％； 甘氨酸7.2％。工作转膜缓冲液：20ml母液加20ml甲醇加水至100ml。滤纸在 转膜缓冲液中浸透。依次按照滤纸-pvdf膜-胶-滤纸叠放，每次注意去除气泡，进行 半干转，15v，1-2小时。转膜结束后，ttbs缓冲液(tris：0.242％；nacl：0.8％； hcl：1.48ml，调节ph至7.6；每100ml加100ultween-20)冲洗几次。5％的ttbs 脱脂奶粉进行过夜封闭。之后一抗
进行过夜孵育，二抗孵育1小时。显影主依据 thermo scientific公司的超敏发光液supersignal west dura kit，a液和b液按照1： 1比例混合，现配现用。
32.如图1a所示，ost5h的表达量受到aba的影响而降低，5羟色胺合成基因ost5h 被大大抑制，这种抑制效果伴随着aba浓度升高而变得更加显著。
33.在野生型植株日本晴(nipp)以及aba合成突变体osaba1及osaba2根部组织 rna，并通过定量pcr比较基因ost5h在aba缺陷突变体中的表达量。方法如下： 取0.1g经液氮研磨的植株根部粉末，rna提取方法根据天根rna提取试剂盒；反转 录方法是根据takara反转录试剂盒；rt-pcr定量配方：1μlcdna为模板，10ml 2
×
sybgreen缓冲液，前后引物各0.5μl，补水至20μl。rt-pcr定量方法：94℃充 分变性2min，进入两步法35个循环：变性，94℃，30秒；复性及延伸，60℃，1min。 如图1b所示，从osaba1和osaba2也可以观察到由于aba的缺失对基因ost5h的 抑制效果降低，从而表现出较高的表达水平。
34.同时也比较了野生型及aba突变体中，基因ost5h产物5羟色胺含量。方法 如下：1克叶片，茎秆或者根部组织在液氮中充分研磨至粉末，加入9ml甲醇。10℃ 下，180rpm摇床混匀，充分浸提30min。13,500
×
g，10℃离心15min，可以抽出8 ml的上清液，按照1:4的比例，加入2ml蒸馏水，混匀。c18固相萃取小柱用三 倍柱床体积的甲醇活化，之后用蒸馏水冲洗。将已加水的样品过小柱，流出液回收； 再用10ml 80％的甲醇冲洗，冲洗出来的溶液也回收，与之前的流出液合并。最后， 旋转蒸发，加入500μl 50％的甲醇溶解待测。5羟色胺的含量通过高效液相色谱 (hplc)来测定。分离柱为c18小柱，流动相为10％甲醇。0.3％三氟乙酸，流速 控制在0.8ml/min。流动相分离30分钟之后，用100％甲醇冲洗5min，再用流动 相跑平基线10min，以保证柱子中的其余杂质冲洗干净。检测器波长设置为280nm。
35.如图1c-f和图2a-b所示，从化合物含量测定上，也可进一步证实，无论是突 变体osaba1还是osaba2，aba的缺失促进5羟色胺含量上升。另外一方面，图2c-d 中ost5h突变体jz-ko或是xd-ko，甚至是过表达植株xd-oe均没有表现出aba 含量上的差异，暗示着5羟色胺的缺失或者过量均不会对aba的含量产生影响。从 上述结果中可以观察到aba对5羟色胺的抑制作用，然而在突变体jz-ko(在嘉浙b 背景下ost5h基因因γ射线诱变获得)或者xd-ko(在锡稻1#背景下ost5h基因通 过crispr定点编辑获得)，亦或是过表达植株xd-oe(在锡稻1#背景下过表达ost5h 基因)之中，均不影响aba含量。
36.此外，我们通过提取了水稻xd-wt，xd-ko，xd-oe根部的rna进行aba合 成通路上基因的表达分析。方法如下：取0.1g经液氮研磨的植株根部粉末，rna提 取方法根据天根rna提取试剂盒；反转录方法是根据takara反转录试剂盒；rt-pcr 定量配方：1μlcdna为模板，10ml2
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sybgreen缓冲液，前后引物各0.5μl，补水 至20μl。rt-pcr定量方法：94℃充分变性2min，进入两步法35个循环：变性，94℃， 30秒；复性及延伸，60℃，1min。
37.本实验定量pcr所用引物
38.primer nameforward sequence(5
’‑3’
)reverse sequence(5
’‑3’
)ost5h-os12g0268000caccatcggcgacttcttcccagctccgtcatcacccactccosaba1-os04g0448900ataccacatcctggaagagttaccttcgttgtcggtaatcosaba2-os03g0810800gtttctagtgtcattggagggtcatagggagatacgcagttcaosaba3-os06g0670000gatagacctggaacttgggaaactaacaaggttgggacggaatosaba4-os01g0128300ggatggcgtcgtctcagattggggtgtcgggagtccaggata
osaao3-os07g0282300agatcatgtcggaagaagtcaggatgtagaggctgggtaaaosnecd1-os02g070400ccgttcgtgacgtacttccggaaccaccgcatctccgactosnecd2-os12g0435200tttggtgtaagtggtccgttgcgcgagaagttcggcctgtttosnecd3-os03g0645900tggtgttcaagctccaggagatgctcgccgtactcgaacttggtgagosnecd4-os07g0154100cagcaaccgtgccaaccaacgagccgaacagcagaagcosnecd5-os12g0617400tccacgacttcgccatcaccgcctcctcccacgcattccaca
[0039] 如图3所示，aba合成相关基因的表达量不受5羟色胺的含量的变化而变化。
[0040]
综上所述，aba对5羟色胺合成起到抑制作用，即aba-|5羟色胺。
[0041]
实施例2双子叶植物拟南芥也同样存在“aba-|5羟色胺”调控机制
[0042]
在双子叶植物中，由于目前并没有克隆到5羟色胺合成基因，我们采用直接外源 添加5羟色胺的处理方式。
[0043]
将拟南芥种于含有1μm aba的ms培养基上，之后移栽于含有不同浓度5羟色 胺的ms培养基上，浓度依次：0，20，150，250μm，之后进行根部栓质染色。拟南 芥根部的栓质染色方法为：取5天大小的整株拟南芥，经荧光黄fluorol yellow 088 (0.01％w/v)在70℃条件下染色30分钟，之后用蒸馏水冲洗两次，甲苯胺蓝anilineblue(0.5％w/v)室温下染色30分钟，之后用蒸馏水冲洗两次。用gfp激发光波长观 察栓质情况，分成三种不同程度的栓质沉积状态：未栓质化(non-suberized)，不连续 栓质化(patchy)，完全栓质化(suberized)。结果如图4所示，从图4a-b中可以观察 到，随着5羟色胺浓度增加，根部栓质逐渐减弱。当浓度达到250μm时，几乎观察 不到栓质沉积(图4a-b)。栓质化的区域(suberized)逐渐减少，而未栓化的区域逐 渐增多(non-suberized)。另一方面，从图4c-d中可以观察到，尽管aba处理可以 促进栓质化的形成，但在此之后再添加5羟色胺则可以弱化栓质的形成，尤其是不连 续栓质化(patchy)比例上升。
[0044]
另外，在含有75mm nacl的1/2ms培养基中，添加不同浓度的5羟色胺，浓度 依次：0，50，100，150，200μm。5羟色胺对栓质的抑制作用，也可以进一步从盐胁 迫实验中反映出来。从图4e中可以发现，将经过3天春化的拟南芥种子点在培养基 上，随着5羟色胺浓度的升高，拟南芥植株表现得更加敏感，同时无论是根长还是植 株生物量都有显著抑制(图4f-g)。