胡椒碱在制备用于防治番茄病原菌的抑菌剂中的应用

1.本发明属于农业生物技术领域，具体涉及胡椒碱在制备用于防治番茄病原菌的抑菌剂中的应用。


背景技术：

2.番茄是世界种植面积第二大的蔬菜，也是我国重要的经济作物。番茄灰霉病是一种世界性番茄病害，其特点是传播速度快、危害重等，是番茄上最严重最频繁发生的病害，该病主要危害果实，造成果实腐烂，也可危害叶、茎和花，极大影响了番茄产量，严重时减产可达20％-30％，给农户带来巨大的经济损失。
3.目前，国内外有关植物体内生物碱化合物的分离及抑菌作用研究较多，也通过报道证明生物碱对植物病原菌具有显著抑制作用。如小檗碱能抑制水稻细菌性条斑病菌的正常生长，并使其致病力降低，0.5％苦参碱水剂防治苹果树腐烂病效果优异，明显优于市产上常用的40％福美砷的伤口愈合率，胡椒碱的类似物荜茇宁酰胺对枯草芽孢杆菌具有很强的抑制活性。
4.胡椒碱是胡椒科植物特有的一种生物碱，具有良好的抗炎、抗菌作用，黑胡椒石油醚提取物对大肠杆菌以及金葡萄球菌细菌细胞壁和细胞膜进行破坏，从而达到抑菌效果。但胡椒碱对植物病原菌有效性的研究却鲜有报道。


技术实现要素：

5.本发明提供了胡椒碱在制备用于防治番茄病原菌的抑菌剂中的应用。本发明对胡椒碱在抑制番茄灰霉病菌的过程中具体作用部位进行探索，对番茄灰霉病菌菌丝菌丝形态变化、孢子的产生以及萌发、酶活性变化以及对番茄实体实验进行了作用。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明提供了胡椒碱在制备用于防治番茄病原菌的抑菌剂中的应用。
8.进一步的，所述番茄病原菌包括番茄灰霉病菌。
9.进一步的，所述胡椒碱的有效使用浓度为10mg/l～200mg/l。
10.进一步的，所述胡椒碱的最佳有效使用浓度为200mg/l。
11.进一步的，所述胡椒碱对番茄灰霉病菌的孢子萌发的抑制率呈剂量依赖性。
12.进一步的，所述胡椒碱对番茄灰霉病菌的sod、pod、cat、sdh和nad-mdh酶活性的抑制率呈剂量依赖性。
13.进一步的，所述胡椒碱能够改变番茄灰霉病菌的菌体超微结构。
14.进一步的，所述胡椒碱能够显著抑制番茄感染番茄灰霉病菌的发病率。
15.进一步的，所述胡椒碱浓度为200mg/l，番茄感染番茄灰霉病菌的发病率小于25％。
16.与现有的技术相比，本发明的技术效果和优点是：
17.1)胡椒碱作为新型农业杀菌剂，杀菌活性高。对番茄灰霉病菌引起的病害，在浓度
为18.72mg/l时，抑制率仍可达到50％，可作为新的天然源杀菌剂进行生物合理性设计与开发。
18.2)作用部位广。对番茄灰霉病菌孢子产生萌发，酶活性，以及菌丝状态都有很大程度的影响和抑制。
19.3)胡椒碱是天然有效成分。其作为杀菌剂具有低毒、低残留、环境相容、不易产生抗性等特点。
附图说明
20.图1为胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子浓度的影响。
21.图2为胡椒碱对番茄灰霉病菌萌发率的影响。
22.图3为胡椒碱对番茄灰霉病菌的菌丝形态的影响。
23.图4为胡椒碱对番茄灰霉病菌的sod、cat、pod酶活性的影响。
24.图5为胡椒碱对番茄灰霉病菌的sdh和nad-mdh酶活性的影响。
25.图6为胡椒碱对感染番茄的番茄灰霉病菌的病斑生长影响，其中a：空白对照；b：dmso对照；c：胡椒碱浓度200mg/l；d：胡椒碱浓度100mg/l；e：胡椒碱浓度50mg/l；f：胡椒碱浓度25mg/l；g：胡椒碱浓度12.5mg/l。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
27.实施例1
28.1、番茄灰霉病菌(botrytis cinerea)，由青岛农业大学绿色农药研究所提供，于4℃条件下保藏。将保存的菌种转接到培养平板上活化，放入恒温培养箱中在25℃条件下培养至菌丝长满整个平板，用打孔器沿菌落外缘打取直径为5mm的菌饼，备用。
29.2、准确称取胡椒碱20mg，用dmso溶解，配置成20000mg/l的胡椒碱储备液。
30.3、采用生长速率法进行抑菌活性的测定。
31.将配置好的胡椒碱储备液添加到pda培养基(约50℃)中，配置成浓度分别为200、150、100、50、25、12.5mg/l的含药培养基，摇匀后倒平板。以添加相同剂量的dmso的培养基作为对照，在平皿中央接种d＝5mm经纯培养的番茄灰霉菌菌丝圆片，26℃恒温培养，4d后用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制生长率，每处理3次重复。
32.采用浓度对数－抑制率概率值法求取毒力回归方程及半数效应浓度(ec
50
)，将番茄灰霉病菌接种在pda培养基上，25℃恒温培养7d，待对照产生大量分生孢子后，用无菌水洗脱孢子，配置成孢子悬浮液，计算产孢抑制率。
[0033][0034][0035]
结果如图1和表1所示，随着胡椒碱的加入以及浓度的增加，番茄灰霉菌的菌落直径和孢子浓度均显著下降，并对番茄灰霉菌的抑制率明显提高。
[0036][0037]
4、番茄灰霉病菌培养7～8d后使其产孢，加无菌水配制成孢子悬浮液浓度为1
×
106，在凹玻片上加不同浓度的胡椒碱，27℃黑暗条件下培养12h后，计算抑制孢子萌发率。
[0038][0039]
结果如图2所示，随着胡椒碱的加入以及浓度的增加，番茄灰霉菌的孢子萌发率显著下降，表明胡椒碱能够有效抑制番茄灰霉菌孢子的萌发。
[0040]
5、配置浓度为25、50、100mg/l的pda培养基，在平皿中央接种番茄灰霉病菌，在菌落边缘斜插盖玻片，待菌丝长到盖玻片上，取出，进行扫描电镜观察菌丝形态进行比较。
[0041]
结果如图3所示，经不同浓度胡椒碱处理的番茄灰霉病菌菌丝形态与对照有明显差异。对照组菌丝粗细均匀，形态规则，处理组菌丝变细，节间拉长，菌丝干瘪、坍塌，由此说明胡椒碱对番茄灰霉病菌的菌体超微结构产生了明显影响。
[0042]
6、将菌丝冰浴研磨匀浆离心，取得上清液为粗酶液，将粗酶液(菌丝)按照参考文献(kar m.plant physiol.1976.57:315-319)进行操作，加入所需试剂，sod酶活性测定为560nm吸光度下以黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50％时定义为一个活力单位，cat酶活性测定为240nm吸光度下，每毫克蛋白每分钟减少0.01吸光度定义为一个活力单位，pod酶活性测定为470nm吸光度下，每毫克蛋白每分钟增加0.01吸光度定义为1个活力单位，sdh酶活性测定为600nm吸光度下，每毫克蛋白每分钟使反应体系吸光度降低0.01为一个活力单位，nad-mdh酶活性测定为在340nm吸光度下每毫克蛋白每分钟使反应体系吸光度降低0.01为一个活力单位。
[0043]
结果如图4-5所示，经处理番茄灰霉病菌的sod、pod、cat活性随着处理浓度的升高均呈现出下降的趋势，说明番茄灰霉病菌菌丝细胞中的防御酶活性被胡椒碱中的活性物质抑制，导致菌丝体活力下降，从而对菌丝生长起到了抑制作用。另外，经过胡椒碱处理后的番茄灰霉病菌的sdh和nad-mdh酶的活性随着处理浓度的升高呈现出下降的趋势，sdh和nad-mdh酶是三羧酸循环中的关键酶，三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。因为细胞通过呼吸代谢获取能量，所以三羧酸循环受阻将导致细胞死亡，表明番茄灰霉病菌
中的sdh和nad-mdh酶活性被胡椒碱抑制，导致菌丝体活力下降，从而对菌丝生长起到了抑制作用。
[0044]
7、用无菌打孔器在每个番茄上打孔，直径为5mm，深度5mm。取200μl浓度为12.5、25、50、100、150、200mg/l的胡椒碱添加到番茄打的空洞上，加200μl无菌水作为空白对照。2h后，在生长6-7天的番茄灰霉病菌菌落表面打取直径5mm的菌饼，接种到番茄空洞中，将番茄放入到恒温培养室内，每一组5个平行对照，重复3次，28℃，保持一定的湿度培养4天。测量病斑直径。
[0045]
结果如图6所示，将番茄灰霉病菌接种到番茄上，番茄产生了病斑，当滴加胡椒碱后，病斑变小，且随着胡椒碱的浓度病斑直径减小。如图所示，在孵育96h后，空白对照的发病率达100％，胡椒碱浓度为200mg/l，发病率仅为20％，且病斑直径非常小，仅为0.5cm。加药组病斑比较对照组明显减小，说明胡椒碱可以有效防止番茄灰霉病菌。
[0046]
综上，胡椒碱对番茄灰霉病菌生长发育具有较强的抑制作用，主要是通过抑制孢子形成，降低孢子的萌发率，且随着浓度的增加，抑制效果呈上升趋势。胡椒碱对菌体超微结构也产生了明显影响，导致菌落边缘的菌丝出现凹陷，菌丝扭曲变形，呈现出干瘪状，内容物流失。对菌体相关酶活性也有不同程度的抑制，经处理番茄灰霉病菌孢子的sod、pod、cat、sdh和nad-mdh酶活性随着处理浓度的升高均呈现出下降的趋势，说明番茄灰霉病菌菌丝细胞中的防御酶活性被胡椒碱中的活性物质抑制，导致菌丝体活力下降，从而对菌丝生长起到了抑制作用，并且将番茄灰霉病菌接种到番茄上，番茄产生了病斑，当滴加胡椒碱后，病斑变小，且随着胡椒碱的浓度病斑直径减小。因此胡椒碱具有良好的抑菌效果且具有靶向性强的优点，可进一步用于制备天然源杀菌剂，具有进一步研究与开发的价值。
[0047]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。