9-菲酚在稻瘟病防治中的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及9-菲酚在稻瘟病防治中的应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.)是重要的粮食作物之一，在粮食生产中占据非常重要的地位，全球近50％的人口以此为主粮，它的安全生产对于保障社会稳定和经济发展至关重要。与其他作物一样，水稻在种植生长发育期间，不可避免地会受到一系列病原菌的侵害，严重影响着水稻的产量及稻米的品质，其中由稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一，是世界水稻生产的重大难题，每年可使水稻减产10％～30％，该病害在所有水稻种植区和水稻不同生长期均可发生，具有分布广、危害大的特点，导致水稻严重减产，威胁我国乃至全球粮食生产安全。因此，对稻瘟病菌防治的研究具有重要的经济价值和社会效益。
3.稻瘟菌对水稻的侵染过程主要包括：(1)分生孢子随风雨传播，并粘附在水稻叶片表面；(2)分生孢子萌发，形成芽管；(3)芽管分化形成附着胞；(4)附着胞分化形成侵染钉；(5)侵染钉穿透寄主细胞，并在寄主细胞内形成侵染菌丝，在细胞间进行扩展。稻瘟菌主要靠分生孢子侵染水稻地上部分组织，当分生孢子接触寄主表皮后，萌发形成发芽管，发芽管又特异性分化产生附着胞，附着胞形成侵染钉穿透寄主表皮继而持续进入寄主细胞中，致使寄主植物在5-7d左右出现症状。其中，稻瘟菌成功侵染水稻的关键过程在于形成高度特化的侵染结构——附着胞。附着胞成熟后产生的膨压，能使侵染钉穿透水稻角质层，从而成功侵染水稻细胞。当稻瘟菌不能形成完整的附着胞时，其致病力显著减弱。
4.目前，防治稻瘟病的主要方法是选育抗性品种、药剂防治和田间管理，其中抗病品种多是在“基因对基因”学说基础上的垂直抗性品种，这些品种容易丧失抗病性。化学防治具有经济、高效、方便、迅速等优点，一直是稻瘟病综合治理体系中不可缺少的部分。稻瘟病的防治是全球研究的热点问题。化学防治在病虫害综合防治中占有重要地位，其具有收效迅速，方法简便，急救性强，且不受地域性和季节性限制的特点。
5.9-菲酚(9-phenanthrol，cas编号484-17-3)是一种稠环芳香烃类化合物，红色固体，在临床中常用作ca
2+
激活的非选择性阳离子通道(transient receptor cation channel subfamily m member4，trpm4)抑制剂，用于治疗心肌缺血等症状。目前，9-菲酚在农业生产中的应用未见到报道。


技术实现要素：

6.针对以上技术问题，本发明提供9-菲酚在稻瘟病防治中的应用。
7.本发明提供9-菲酚在制备防控稻瘟病菌药物中的用途。
8.进一步地，所述的9-菲酚在制备抑制稻瘟病菌菌丝生长、孢子萌发药物中的用途。
9.进一步地，所述的9-菲酚在制备干扰稻瘟病菌附着胞形成的药物中的用途。
10.优选地，所述的9-菲酚的浓度为5ug/m-30ug/m。
11.本发明还保护利用9-菲酚防控稻瘟病的方法，包括以下步骤：将9-菲酚溶解在二甲基亚砜中，配置成5000ug/ml的母液，用移液器吸取9-菲酚母液加入到已冷却至55℃的pda培养基中，调制9-菲酚的浓度为5ug/ml-30ug/ml；然后将孢子悬浮液均匀喷洒水稻叶片，使叶片上沾满液滴。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明研究发现，9-菲酚对稻瘟病菌生长有抑制作用，可干扰分生孢子形成附着胞，对孢子附着胞的形成具有显著延缓作用，对稻瘟病具有明显的抑制作用，因此，在稻瘟病防控及药物开发方面具有很好的应用价值。
附图说明
13.图1为不同浓度9-菲酚对稻瘟菌菌丝生长的影响；
14.图2为不同浓度9-菲酚对不同稻瘟菌菌株的抑制率图；
15.图3为不同浓度9-菲酚对稻瘟菌分生孢子萌发的影响；
16.图4为不同浓度9-菲酚对稻瘟菌附着胞形成的影响；
17.图5为不同浓度9-菲酚对稻瘟菌致病力的影响；
18.图6为不同浓度9-菲酚对病斑稻瘟菌生物量的影响。
具体实施方式
19.实施例1 9-菲酚对稻瘟病菌菌丝生长的影响
20.一种利用9-菲酚抑制稻瘟病菌菌丝生长的方法，包括以下步骤：
21.s1：将9-菲酚溶解在二甲基亚砜中，配置成母液(5000ug/ml)，将加入pda培养基中使9-菲酚的终浓度分别为1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml和15μg/ml，控制pda培养基的温度为55℃；同时设置未加入9-菲酚的pda培养基作为空白对照组。
22.上述pda培养基的制备方法:
23.(1)取称量纸在天平中称取蔗糖10g，琼脂粉15g；
24.(2)将马铃薯去皮并清洗干净，称量200g去皮马铃薯后并在干净的纱布上用小刀切成约1cm左右的立方块；
25.(3)量取1000ml蒸馏水，将蒸馏水和200g去皮马铃薯块一起加入锅中，待水沸腾后再煮20-30min，然后在1l的烧杯中用4层干净的纱布过滤马铃薯渣；
26.(4)向过滤后的液体中加入10g蔗糖，用玻璃棒搅拌均匀后将滤液倒入锅中，边搅拌边加入琼脂粉15g，注意快速搅拌，避免琼脂结块沾锅底；
27.(5)当液体煮至透明时停止加热倒入1l的烧杯中，加蒸馏水定容至1000ml，自然ph，分装在锥形瓶中，不能超过锥形瓶容积的三分之一，之后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，得pda培养基。
28.将9-菲酚加入pda培养基中的具体方法：用移液器吸取9-菲酚加入到已冷却至55℃的pda培养基中，使最终培养基中的9-菲酚浓度分别为1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml和15μg/ml，将培养基混匀后倒入无菌培养皿中，尽量避免倒板过程中出现气泡影响实验结果，得到不同9-菲酚浓度的pda培养基。
29.s2：培养供试菌稻瘟病菌；
30.上述培养供试菌稻瘟病菌的具体方法如下
31.2.1在灭好菌的超净工作台中,点燃酒精灯,将高压蒸汽灭菌过的pda培养基冷却到55℃左右；
32.2.2在直径90mm的培养皿中，每皿约倒22ml培养基，尽量保证倒入过程中没有气泡；
33.2.3等到培养基完全凝固后，从冰箱里取出供试稻瘟病菌的滤纸片；
34.2.4将镊子放在酒精灯外的烧，待镊子冷却后用镊子夹取保存有稻瘟病菌的滤纸片放于pda培养基上；
35.2.5最后使用封口膜将培养皿密封，并倒置放在28℃恒温培养箱中培养供试菌株。
36.s3：供试菌稻瘟病菌在培养7天后使用无菌打孔器在供试菌稻瘟病菌上切取菌块，菌块直径为6mm，放入含9-菲酚的pda培养基和空白对照pda培养基中；
37.s4：将放入菌块的含9-菲酚的pda培养基和空白对照pda培养基放入恒温培养箱中培养，恒温培养箱的温度为28℃，培养时间为7天。用游标卡尺分别测量菌落直径，计算出实验组和空白对照组的菌丝生长速率和抑制率。
38.计算公式如下
39.抑制率＝(对照菌株生长直径-0.7)-(处理菌株生长直径-0.7))/(处理菌株生长直径-0.7)(注：0.7代表所接菌块直径)
40.实验组准备不同浓度的9-菲酚pda培养基分别为1.25ug/ml，2.5ug/ml，5ug/ml，10ug/ml和15ug/ml，分别接种稻瘟病菌菌块，7天后统计菌落直径计算出9-菲酚抑制稻瘟病菌的抑制率，结果如图1所示：
41.结果：通过在含有9-菲酚的培养基中接种7株不同稻瘟菌，结果表明不同浓度的9-菲酚对稻瘟菌菌丝生长均有影响，且随着浓度的增加，抑制率显著增加(图1、图2)。
42.实施例2 9-菲酚对稻瘟病菌孢子形成和附着胞形成的影响
43.实施步骤：
44.s1将放入菌块的含9-菲酚的pda培养基和空白对照pda培养基放入恒温培养箱中培养7天后，使用无菌打孔器在稻瘟病菌上切取菌块，菌块直径为6mm，挑取三个菌块放置于pdb培养基中，
45.所述pdb培养基的制备方法:
46.(1)取称量纸在天平中称取蔗糖10g；
47.(2)将马铃薯去皮并清洗干净，称量200g去皮马铃薯后并在干净的纱布上用小刀切成约1cm左右的立方块；
48.(3)量取1000ml蒸馏水，将蒸馏水和200g去皮马铃薯块一起加入锅中，待水沸腾后再煮20-30min，然后在1l的烧杯中用4层干净的纱布过滤马铃薯渣；
49.(4)向过滤后的液体中加入10g蔗糖，用玻璃棒搅拌均匀后，倒入1l的烧杯中，加蒸馏水定容至1000ml，自然ph，分装在锥形瓶中，不能超过锥形瓶容积的三分之一，之后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，得pdb培养基。
50.s2：将菌块放入pdb培养基放置于120rpm，28℃摇床培养4-5天后，分别吸取400μl菌丝悬浮液于燕麦培养基中，使菌液分布均匀。将其放置于28℃培养箱中培养6d左右，使用无菌棉签刮菌丝，再放置于光照培养箱中明暗交替(12h光照，12h黑暗)培养5d左右，用0.1％吐温水清洗孢子，配置分生孢子悬浮液，并调节孢子浓度至105/ml；将9-菲酚母液分
别加入分生孢子悬浮液至终浓度为1μg/ml，10μg/ml和20μg/ml，将混有9-菲酚的分生孢子悬浮液滴到疏水拨片上，28℃黑暗保湿12h后，显微镜观察附着胞形成情况；
51.s3：制作水琼脂培养基，将玻璃纸放在水琼脂上；将用燕麦培养基培养的孢子用无菌水清洗，过滤，均匀涂抹在玻璃纸上并做好标记，在2h、4h、6h、8h分别观察孢子萌发及附着胞形成情况。每次观察50个孢子，共观察3次。
52.所述燕麦培养基的制备方法:
53.(1)取称量纸在天平中称取燕麦40g，琼脂粉15g；
54.(2)向称量好的燕麦中加入适量水浸泡10分钟左右，用破壁机均匀打碎；
55.(3)将打碎均匀的燕麦倒入1l的烧杯中；
56.(4)将15克琼脂粉加入到装有燕麦的1l烧杯中，加蒸馏水定容至1000ml，自然ph，分装在蓝盖瓶中，不能超过蓝盖瓶容积的三分之一，之后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min，得燕麦培养基。
57.结果：孢子萌发及附着胞形成情况结果如图3和图4：通过对分生孢子悬浮液添加不同浓度9-菲酚后，结果表明：10ug/ml 9-菲酚对稻瘟菌分生孢子萌发和附着胞形成具有抑制作用，20ug/ml时，分生孢子萌发和附着胞形成均受到明显抑制(如图3和图4)。
58.实施例3 9-菲酚对稻瘟菌致病性的影响
59.实验步骤如下：
60.将9-菲酚母液加入到稻瘟菌分生孢子悬浮液终，至终浓度为10ug/ml和30ug/ml，将孢子悬浮液均匀喷洒水稻叶片，使叶片上沾满液滴，28℃黑暗保湿培养24h，再移至温室，接种后7d进行稻瘟菌病害调查并通过荧光定量方法统计菌丝生物量，具体公式2ct
(os-ubq)-ct(mo-pot2)。
61.结果：使用添加含有9-菲酚的分生孢子悬浮液接种水稻，接种后7天观察水稻发病情况，结果表明添加10ug/ml的9-菲酚处理分生孢子悬浮液接种水稻后，水稻叶片上病斑显著减少，接种添加了30ug/ml的9-菲酚处理分生孢子悬浮液后，水稻叶片只能看到零星的小的病斑(图5)。通过统计病斑处菌丝生物量发现，不同浓度9-菲酚处理的孢子悬浮液形成的病斑的菌丝生物量显著降低(图6)。说明9-菲酚通过抑制分生孢子萌发和附着胞形成降低了水稻稻瘟病的发生。