一种构建非人灵长类冠状动脉粥样硬化模型的方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及构建非人灵长类动物实验模型，特别涉及通过预先筛选、饮食诱导构建食蟹猴冠状动脉粥样硬化模型的方法。


背景技术：

2.动脉粥样硬化是由于炎症、脂质沉积等原因造成的血管病变，是动脉粥样硬化性心脏病、脑血管疾病和外周血管疾病最常见的病因。由于人们生活方式的改变，动脉粥样硬化相关心血管疾病的发病率仍在上升。冠状动脉粥样硬化的发生发展机制更为复杂，炎症、高脂血症、肠道菌群、表观修饰等在其中均发挥着重要的作用。
3.用于医学和药学研究的理想冠状动脉粥样硬化模型应该能充分模拟人体解剖学和病理生理学的特点。动脉粥样硬化模型中应用最广泛的动物模型为富含胆固醇的饮食长时间喂养的载脂蛋白(apo)e或者低密度脂蛋白受体(ldl-r)缺失的基因敲除小鼠模型，其次也会使用机械或超声作用并结合高胆固醇饮食喂养构建的家兔模型。这些模型的局限性在于，都不能充分模拟人类冠状动脉粥样硬化疾病，在用于临床治疗药物的筛选中也存在很多的弊端。例如无论小鼠模型还是家兔模型，其心脏冠状动脉血管分离后不易观察研究；临床药物治疗的研究中发现，他汀类药物和抗pcsk9(原蛋白转化酶枯草杆菌素-kexin 9)抗体等药物治疗冠状动脉粥样硬化有一定的局限性，明确的机制仍然有待进一步的研究，在这样的背景下获得一种非人灵长类动物模型对研究人类冠状动脉粥样硬化相关疾病的机制以及临床治疗药物筛选具有重要意义。
4.目前亟待提出一种在较短实验周期内构建能够稳定、充分模拟人类冠状动脉粥样硬化病理状态的非人灵长动物模型构建方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种通过生理指标预先筛选及高脂饮食诱导构建非人灵长类冠状动脉粥样硬化模型的方法。该方法造模成功率高、周期短，病理结果全面且直观。
6.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.一种非人灵长类冠状动脉粥样硬化模型的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
8.通过基础生理指标的筛选确定待饮食诱导的非人灵长类动物个体，对筛选出的非人灵长类动物个体利用高脂饲料饲喂10～15个月，从而诱导得到非人灵长类冠状动脉粥样硬化模型(动物模型)。
9.优选的，所述非人灵长类动物为食蟹猴。
10.优选的，所述基础生理指标为体重、腹围和腰围。
11.优选的，所述非人灵长类动物(例如食蟹猴)个体的筛选标准为：体重7.4～7.9kg，腹围45.5～47.8cm，腰围37.1～38.8cm。
12.优选的，所述高脂饲料按重量计由以下成分组成：29％～32％的纤维、10％～15％
的蛋白质、15％～20％的猪油、10％～15％的果糖、3％～5％的蔗糖、0.5％～1％的胆固醇，以及10％～15％的蛋黄粉，各成分重量百分数之和为100％。
13.优选的，所述构建方法还包括以下步骤：在建模期间对反映非人灵长类动物(例如食蟹猴)个体血脂水平的一系列生化指标进行检测。
14.优选的，所述生化指标包括甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白(ldl-c)。
15.优选的，所述生化指标还包括高密度脂蛋白(hdl-c)，可替换低密度脂蛋白(ldl-c)的检测或与其同时检测。
16.优选的，诱导前及诱导过程中定期(例如诱导过程的每个月)对非人灵长类动物(例如食蟹猴)个体进行抽血采样，通过样本检测获得上述生化指标的值及其变化情况。
17.优选的，所述构建方法还包括以下步骤：诱导完成后通过提取非人灵长类动物(例如食蟹猴)个体冠状动脉进行病理分析，观察冠状动脉粥样硬化斑块形成情况。
18.优选的，所述冠状动脉的提取方法包括以下步骤：直接从处死后的非人灵长类动物(例如食蟹猴)个体心脏中，沿冠状动脉走向分离冠状动脉。
19.优选的，所述病理分析包括以下步骤：将分离的冠状动脉采用多聚甲醛进行固定，然后进行切片、染色。
20.本发明的有益效果体现在：
21.本发明首次公开了一种通过非人灵长类动物(例如食蟹猴)基础生理指标筛选以及高脂饮食诱导构建冠状动脉粥样硬化模型的方法，成功使非人灵长类动物冠状动脉内形成粥样硬化斑块，并且导致血清中tc、tg、ldl-c等的含量升高。本发明构建的冠状动脉粥样硬化模型，为研究人类冠状动脉粥样硬化相关疾病的病理机制以及临床治疗药物的筛选提供了相似度极高的动物模型。与其他常用的实验动物模型相比，本发明的建模周期短、成本低、造模成功率高，具有重要的理论和实际意义。
22.进一步的，本发明综合考虑非人灵长类动物(例如食蟹猴)对营养的需求及诱导效果，对现有文献报道中以胆固醇为主要作用成分的饲料配方进行了改进，所得高脂饲料完善了饲料成分构成，为研究人类冠状动脉粥样硬化相关疾病病理发展以及临床治疗药物的筛选提供稳定的饮食诱导饲料配方(经验证，所有经过筛选的食蟹猴经诱导均形成了冠状动脉粥样硬化斑块)。
23.进一步的，本发明采用非人灵长类动物(例如食蟹猴)构建的动物模型，其冠状动脉容易从离体心脏中提取，为研究冠状动脉粥样硬化病理过程中的基因表达的变化以及整体的病理变化提供更直观的模型。
附图说明
24.图1为食蟹猴高脂饲料喂养13个月后实验组(hfd)与普通饮食对照组(normal)的血脂变化；其中，*p《0.05，****p《0.0001，均具有统计学显著性差异。
25.图2为从食蟹猴心脏中分离左冠状动脉(left coronary artery)以及制备切片的示意图；其中
①
～
⑧
为回旋支(cyclotron branch)的分段序号。
26.图3为食蟹猴高脂饲料喂养13个月后实验组(hfd)与普通饮食对照组(normal)冠状动脉病理切片染色(显微镜照片)。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
28.本发明中建立了食蟹猴冠状动脉粥样硬化模型，并从模型动物心脏中分离出冠状动脉，开展病理学分析，为研究人类冠状动脉粥样硬化相关疾病提供了有效的非人灵长类动物模型。
29.(一)材料
30.1.实验动物
31.食蟹猴由广西防城港长春生物技术开发有限公司提供，食蟹猴饲养环境清洁，具有良好的通风系统，饲养温度22℃～25℃、相对湿度为48％～65％，食蟹猴自由进食进水，控制噪音标准，光暗交替12h，保证食蟹猴充分的睡眠条件。为维护实验动物福利，给食蟹猴不定期更新玩具(玩具保证干净清洁)，饮食中辅以动物喜欢的水果。
32.2.饲料
33.2.1基础饲料
34.配方主要成分为纤维和蛋白质，由公司(科澳协力)提供。
35.2.2高脂饲料
36.本发明使用的高脂饲料配方是对上述基础饲料配方调整优化(加入猪油、果糖、蔗糖、胆固醇、蛋黄粉)而得，经实验证实该高脂饲料能在经过筛选的食蟹猴体内稳定的诱导形成冠状动脉粥样硬化斑块，从而构建食蟹猴冠状动脉粥样硬化模型，所述高脂饲料配方成分分析结果如下：
37.29wt％纤维、15wt％蛋白质、20wt％猪油、15wt％果糖、5wt％蔗糖、1wt％胆固醇和15wt％蛋黄粉；
38.配制好的高脂饲料在低温环境下保存。
39.(二)食蟹猴冠状动脉粥样硬化模型构建实验
40.1.实验组
41.从猴群中按照体重(7.63
±
0.23kg)、腹围(46.64
±
1.07cm)及腰围(37.93
±
0.80cm)，挑选17只食蟹猴，排除生理指标(体重、腹围和腰围)过低及过高的食蟹猴(经实验发现，这些生理指标过高同样也导致造模成功率降低)，检测筛选出来的待高脂饮食诱导的食蟹猴的血脂水平(作为建模初始值)，结果如下：tc(2.38
±
0.08mmol/l)、tg(0.86
±
0.13mmol/l)、ldl-c(0.88
±
0.05mmol/l)、hdl-c(1.22
±
0.04mmol/l)；利用上述高脂饲料进行饲喂，饲喂周期为13个月(即诱导13个月建模过程即结束)。
42.每个月对食蟹猴进行抽血，并对血样进行检测，从而比较tc、tg、hdl-c、ldl-c等相关指标的变化。
43.血脂检测方法如下：食蟹猴在专业饲养人员的协助下进行静脉采血，将收集到的血液1500rpm离心5分钟，吸取上层血清。根据试剂盒说明书，分别对所得食蟹猴血清中tc、tg、ldl-c、hdl-c含量进行测定，利用酶标仪读取数值。
44.检测结果表明，实验组食蟹猴血清中tc、tg、ldl-c含量相对于建模初始值均升高，直至建模过程结束(参见图1)。
45.实验组食蟹猴在模型构建完成后，提取其冠状动脉，检测冠状动脉粥样硬化斑块
的形成情况。具体方法如下：
46.1)在专业实验人员的操作下对食蟹猴进行安乐死，分离心脏。取出的心脏浸泡在提前预冷的pbs中，使用眼科显微剪沿心脏主动脉根部确定冠状动脉位置，分离肌肉层，充分暴露冠状动脉，取出后分离冠状动脉周围多余组织。将分离干净的冠状动脉按图2中的形态进行拍照，然后浸泡于4％多聚甲醛溶液中进行固定(》24h)。
47.2)对食蟹猴冠状动脉进行病理分析，观察斑块形成情况
48.参见图2，将经多聚甲醛固定后的冠状动脉取出，切取回旋支并分段进行脱水、包埋以及切片(每段的切片间隔为300um)。
49.对冠状动脉切片进行苏木素-伊红染色，封片后拍照。利用winroof v6.5图像分析软件(mitani co.,tokyo,japan)分析冠状动脉粥样硬化的病变面积。
50.参见图3，结果表明实验组食蟹猴冠状动脉中可以明显形成动脉粥样硬化斑块，并且在实验组中每只食蟹猴的冠状动脉均发生了这种明显的病变。
51.2.对照组
52.从猴群中任意挑选5只食蟹猴，生理指标与实验组无统计学差异，饲喂基础饲料(普通饮食)13个月。
53.对照组食蟹猴同样在诱导前及诱导过程中进行抽血，检测tc、tg、hdl-c、ldl-c。参见图1，检测结果表明，对照组食蟹猴血清中tc、tg、ldl-c等指标的值均明显低于实验组。
54.待实验组食蟹猴模型构建完成后，按照实验组取材方法同时提取对照组食蟹猴冠状动脉，进行病理分析，观察斑块形成情况。参见图3，病理结果表明，对照组食蟹猴的冠状动脉内并未见明显的病变。