一种通过测定卵巢发育指标评估天敌对饲料生殖适应性的方法

本发明涉及一种通过卵巢发育指标评估天敌对饲料生殖适应性的方法(以叉角厉蝽为例)，属于生物防治天敌繁殖。

背景技术：

1、在天敌昆虫规模化饲养中，首要任务就是在尽可能短时间内，获得数量大、质量高的天敌昆虫，而制约着规模化繁育效率的重要因子之一便是饲料营养。一种优质饲料可以通过促进生长发育和繁殖，大大缩短天敌昆虫生产周期，提高生产效率，减少成本投入。

2、卵生昆虫的卵中往往含有后代发育所需几乎全部营养物质。因此，食物摄入对雌虫生殖有重要作用，如提供不同寄主植物，会显著影响绿盲蝽lygus lucorum卵巢发育，进而影响生殖力水平。已有研究表明，营养与昆虫卵巢发育，尤其是卵子发生过程密切相关。在卵子发生过程中，由脂肪体合成的卵黄蛋白会通过卵泡间隙与卵母细胞质膜表面的卵黄受体结合，通过内吞作用被卵母细胞吸收。在卵黄发生过程中，雌虫产下的卵可能会接近或超过它的体重，在这时，如果雌虫要合成足够多的卵黄蛋白来保证高水平生殖力，就需要摄入充足的营养物质。

3、叉角厉蝽属昆虫纲、半翅目、蝽科、厉蝽亚科，是一种已初步实现商品化的捕食性天敌昆虫，由于其出色的捕食能力，被应用于烟草、玉米、果树和蔬菜等植物上，防治各种鳞翅目、半翅目、鞘翅目害虫的幼虫。近年来，国内已逐步实现规模化饲养，但饲料的筛选仍是一个关键问题。国内学者对叉角厉蝽的人工和昆虫源饲料进行了研究：1985～1986年，广东省昆虫研究所从泰国引进叉角厉蝽原始种群，在室内用米蛾和大蜡螟饲养，后尝试用从柞蚕antheraeapernyi蛹提取得到的血淋巴饲养，发现可正常发育；之后tetsuya和sadao用冷冻夜蛾科幼虫饲养，虽然历期延长，成虫体重降低，但对繁殖力没有显著影响，同时可以一定程度上避免活猎物对叉角厉蝽蜕皮的干扰；gupta比较了叉角厉蝽取食冷冻蚕蛹、米蛾和大蜡螟的发育参数，结果表明，冷冻蚕蛹可作为叉角厉蝽大规模饲养的饲料；宫靖垚等报道了叉角厉蝽人工饲料的制作方法，主要成分为蛆粉、牛肝、蛋黄和柞蚕蛹血淋巴等，该饲料与黄粉虫对比，生物学参数差异不显著。以上研究均为叉角厉蝽的饲料筛选奠定了一定的基础。

4、综上所述，卵巢发育指标是反应饲料营养对天敌昆虫影响的重要指标。我们通过测定卵巢发育指标研究饲料对叉角厉蝽生殖力的影响也证明该方法是可行的，而目前深入到卵巢发育层面的天敌饲料筛选研究方法仍未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是在前人研究的基础上，提供一种通过卵巢发育指标评估天敌对饲料生殖适应性的方法，本方法通过系统解剖、卵巢分级、关键日龄发育指标测定等方式，对不同饲料饲养下的天敌昆虫卵巢发育动态进行分析，明确不同饲料对天敌昆虫生殖力的内在影响，对天敌昆虫的饲料筛选具有重要意义。

2、一种以叉角厉蝽为例通过卵巢发育指标评估天敌对饲料适应性的方法，包括以下步骤：

3、(1)实验种群的建立

4、不同天敌昆虫应根据其生长、发育和繁殖特性统一饲养方式，为后续实验提供充足的虫源保障。

5、叉角厉蝽：每个饲料饲养组分别选取5～10枚新产卵块饲养在温度27±1℃，湿度70±5％，光周期16l:8d的人工气候室或培养箱中。卵～2龄若虫阶段群体饲养于直径9厘米塑料培养皿(1枚卵块/皿)；3～5龄若虫转移到直径10厘米、高8厘米方形饲养盒(约10头/盒)；成虫羽化后转移到直径10厘米、高10厘米圆形产卵盒(3～4对/盒)。饲养盒中提供折叠a4纸条供其休息和产卵，同时可以相对增加饲养空间，避免个体间过多的干扰作用。由于卵和1龄若虫(后简称n1)不取食，只提供浸有5％蜂蜜水的脱脂棉片，发育到n2后开始提供足量适龄猎物或人工饲料。

6、(2)雌成虫生殖系统解剖

7、不同天敌昆虫的解剖方法可能存在一定差异，应遵循以下几个主要步骤：麻醉、剪除翅膀等遮挡腹部的组织器官、将背板或腹板分离暴露出腹部内容物、挑除消化系统和脂肪体等非目标器官、完整取出生殖系统、拍照记录并测定相关指标。

8、叉角厉蝽：取羽化24h以上的雌成虫，通过体视显微镜，在pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)中进行生殖系统解剖，将解剖好的卵巢及其他器官分别放入单凹载玻片，使用微观影像记录仪进行拍照记录。具体方法如下：首先将收集到的雌成虫饥饿12h，排空肠道残留物，在罐头瓶中用co2进行麻醉，待其失去知觉后取出，使用解剖剪分别将一对前翅、一对后翅、六条足和小盾片从基部剪断，将两侧背板与腹板之间的节间膜剪开，然后使用1号昆虫针从前胸背板偏后位置插入，背板向上固定于蜡盘中央，使用两根5号昆虫针分别在背板两侧固定，加入一定量pbs缓冲液；使用解剖镊和解剖针小心将背板掀开取下，使用解剖镊和解剖刀将脂肪体和位于生殖系统上方的消化器官取出；使用解剖刀小心将双侧卵巢前端的悬韧带切断，再把后端生殖腔连接的部分腹节整片取下，将整个生殖系统小心拖拽到单凹载玻片中，滴入pbs缓冲液进行拍照。如卵巢体积过大，可用透明塑料盖代替单凹载玻片。在解剖过程中，随时用卫生纸吸取和添加pbs缓冲液，提高解剖效率。

9、(3)卵巢发育关键时间节点的判断

10、为减少工作量和难度，只需选择部分关键日龄节点测定相关指标。根据不同天敌昆虫成虫的寿命长短后产卵时期确定，如快速发育期、稳定期、开始产卵、产卵盛期和衰退期，根据需要选择部分时期进行解剖分析。

11、叉角厉蝽：挑选取食不同饲料羽化后的雌成虫，在关键日龄：快速发育期(1天)、稳定期(3天)、开始产卵(7天)、产卵盛期(14天)和衰退期(21天)分别解剖卵巢。

12、(4)卵巢发育相关指标的测定

13、分别收集取食不同饲料羽化后关键日龄的雌成虫，在pbs缓冲液中按(2)描述的方法解剖出完整卵巢。将解剖出的卵巢小心放入单凹载玻片或透明塑料盖，滴入适量pbs缓冲液，使用微观影像记录仪分别记录处于不同发育阶段的卵子数量，测量卵巢管(卵巢管本部)长度和成熟卵长length和宽breadth，用于计算成熟卵体积。其中，成熟卵长宽是指卵巢管末端第一颗成熟卵长和宽均值。在收集各日龄卵巢后，根据卵巢管长度、卵母细胞的发育水平和卵黄蛋白的沉积状况，对叉角厉蝽卵巢进行分级。

14、(5)卵子发育阶段的判断

15、卵子发育阶段依据卵母细胞发育进度和卵黄蛋白沉积情况，划分为卵黄发生前期卵子、卵黄发生期卵子和成熟期卵子，主要判断标准如下：

16、卵黄发生前期：卵子呈乳白透明状，无明显卵黄蛋白沉积；

17、卵黄发生期：可以见到明显卵黄蛋白沉积，使用底光照射有明显沉积物；

18、成熟期：卵黄蛋白沉积过程基本完成，且已经形成质地坚硬的卵壳。

19、(6)卵体积的计算

20、不同天敌昆虫应根据卵子的特性选择不同的公式进行计算。

21、叉角厉蝽：我们将叉角厉蝽成熟卵子视为一椭球体，根据椭球体体积公式：v＝4πabc/3，得出叉角厉蝽卵体积ve近似计算公式：

22、

23、其中，l为卵长轴长，b为卵短轴长。

24、本发明与已有技术方法相比具有以下优点：

25、1.以卵巢发育指标的差异分析不同饲料对天敌昆虫生殖力的影响，比只通过发育历期长短、产卵量高低筛选饲料更全面、准确；

26、2.只需测定数个关键成虫日龄的卵巢发育指标，相比于全成虫阶段测定工作量更小、更便捷；

27、3.不需要规模化饲养，只需精心饲养少量天敌昆虫，每种饲料饲养获得30～50只成虫即可完成实验，减小了工作量和难度。