一种抗玉竹叶斑病微生物农药的制作方法

1.本发明涉及微生物生物技术领域，特别的涉及一种抗玉竹叶斑病的金色毛壳菌微生物农药制剂。


背景技术：

2.玉竹又名萎蕤、尾参是我国传统中药材之一，常用于肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口渴，内热消渴，作用缓和，不滋腻敛邪，因此玉竹在降血糖、抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化、延缓衰老以及抗疲劳药物中得到了广泛的应用。近年来，我国玉竹种植的规模越来越大，种植地域也日渐广泛，然而，玉竹在种植中出现的玉竹叶斑病给玉竹的生产带来了严重的影响。玉竹叶斑病病斑初期为褐色斑点，边缘黄色，逐渐扩展后病斑近圆形，内灰色，边缘黑褐色，在潮湿条件下病斑上出现黑色粒状物，严重时可导致整叶枯死。叶斑病的病原菌有多种，而镰刀菌也是引起叶斑病的重要病原菌之一。
3.金色毛壳菌（chaetomium aureum）具有很强的拮抗效果和生防潜力。早在1975年，即有科学家就对金色毛壳菌的固氮作用开始了研究工作。也有文献报道，从核桃叶片上分离得到金色毛壳菌对辣椒疫霉的菌丝生长具有很强的抑制作用，能防治辣椒疫病的发生；金色毛壳菌对水稻稻瘟病也有较好的防治作用。金色毛壳菌、渐狭蜡蚧菌和少根根霉菌可用于烟蚜的生物防治。
4.然而，目前玉竹叶斑病菌多是采用化学试剂进行防治，例如使用50%异菌脲、65%代森锌，70％甲基硫菌灵等。然而，长期的化学农药的使用容易导致环境污染和生态系统的干扰，而且极易产生抗药性。而微生物生物防治高效、无毒无害、无污染等诸多特点，能有效的解决化学农药的3r（resistance, residue, resurgence）问题，促进农业可持续发展。


技术实现要素：

5.如何有效、低毒的对玉竹叶斑病进行防治，成为困扰玉竹种植者的一个普遍难题，为此，本发明人通过长期的筛选和试验发现，镰刀菌感染也会引起玉竹叶斑病，而金色毛壳菌或其孢子具有拮抗镰刀菌的能力，能够在玉竹叶斑病中的防治中发挥较好的效果。为此，本发明提供如下技术方案：本发明从玉竹块茎上分离得到金色毛壳菌类菌株，经鉴定属于金色毛壳菌，所述金色毛壳菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2022年05月07日，保藏编号为cgmcc no.40190。
6.本发明的一个方面，本发明公开了金色毛壳菌或其孢子在制备抗玉竹叶斑病微生物农药中的应用，所述微生物农药中含有金色毛壳菌或其孢子，所述金色毛壳菌保藏编号为cgmcc no.40190。
7.本发明的一个方面，本发明公开了一种抗玉竹叶斑病微生物农药，所述微生物农药中包括金色毛壳菌或其孢子，所述金色毛壳菌保藏编号为cgmcc no.40190。优先的，所述微生物农药中的金色毛壳菌或其孢子以粉剂的形式存在；更优选，述微生物农药中的金色
毛壳菌或其孢子以颗粒剂的形式存在。当然，本发明的制剂还可以是颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂等，适用于使用的剂型。粉剂的制备方式可以冻干，真空冷冻干燥的方式制备以最大限度的保持微生物的活性。在制备微生物农药的过程中应对微生物进行分离、纯化鉴定，大规模发酵培养以获得大量的微生物。发酵的温度控制在25-28℃，发酵培养基的ph选择在4-12之间，优选6-9之间。
8.本发明的一个方面，本发明公开了一种抗玉竹叶斑病微生物农药，所述微生物农药包括金色毛壳菌或其孢子，所述微生物农药还包括药学上可以接受的助剂。所述助剂包括载体、表面活性剂、保护剂、营养助剂中的一种或多种。载体包括无机载体、有机载体中的一种多种，表面活性剂在微生物农药中起到乳化、湿润、增溶、消泡、起泡、稳定等作用。保护剂主要作用是保护微生物菌体在制剂和保存过程中不受到损伤或者减少损伤。营养助剂主要为微生物菌体提供营养物质，提高微生物的繁殖能力。
9.本发明的一个方面，本发明提供了金色毛壳菌或其孢子在制备抗玉竹叶斑病制剂中应用。
10.本发明的一个方面，本发明提供了金色毛壳菌或其孢子在抗玉竹叶斑病中的应用，所述金色毛壳菌保藏编号为cgmcc no.40190。
11.本发明的一个方面，本发明提供的微生物农药或制剂还可以与其他抗玉竹叶斑病的微生物或抗叶斑病化学药剂联用。
12.有益效果本发明通过试验发现和证实了金色毛壳菌能够拮抗镰刀菌，进而发挥抗玉竹叶斑病的作用，为玉竹叶斑菌的生物防治提供新的思路，能够为玉竹病菌的防治起到了良好的社会经济效应。
附图说明
13.图1为平板对峙法验证金色毛壳菌对镰刀菌的拮抗作用。
具体实施方式
14.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。
15.金色毛壳对比菌htc：源自山东农业大学高克祥课题组。
16.实施例1 金色毛壳菌对玉竹叶斑病病菌镰刀菌的拮抗作用按照常规方法玉竹块茎上分离得到金色毛壳菌类菌株，经过鉴定为金色毛壳菌，并进行保藏，所述金色毛壳菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2022年05月07日，保藏编号为cgmcc no.40190。
17.将金色毛壳菌培养基在pdb培养基（马铃薯蔗糖培养基）中培养，pdb 培养基配方组成马铃薯 200g，蔗糖 20g，蒸馏水1000 ml，ph7.0。从玉竹叶斑上进行病原细菌分离，参照《常见细菌鉴定手册》经形态鉴定分离的到的病菌为镰刀菌，将病菌镰刀菌在 pda培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）上培养，备用。pda培养基组成：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000 ml，ph7.0。
18.平板对峙法验证金色毛壳菌对玉竹叶斑病病菌镰刀菌的拮抗作用。即将各菌用直径为5mm的打孔器制成菌饼，镰刀菌（病原菌）接种在pda平板中间，四周放上金色毛壳菌（拮抗菌）。拮抗菌距离培养皿周围约为10mm，两种菌接种距离为30mm，每种处理重复3次。于28℃培养3天。同时，以只接种病原菌的平皿作为对照组，每个处理重复3 次。待对照组病原菌菌落长满培养皿时，用毫米测度尺测定菌落直径。根据实验组两菌落的生长速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象来判断生防菌对病原菌是否有拮抗作用，基于实验组和对照组的测量数据计算金色毛壳菌对于镰刀菌的生长抑制率。参见图1，金色毛壳菌对于镰刀菌的生长起到了明显的抑制作用。经过测量计算，金色毛壳菌对于镰刀菌的生长抑制率达到了62.8%，有较为明显的抑制作用。
19.实施例2 金色毛壳菌对抗玉竹叶斑病的作用将金色毛壳菌接种到pdb 培养基中，28℃振荡培养10天，将发酵液用纱布过滤，保存在三角瓶中，密封，4℃冰箱保存，备用。
20.选择3~4片叶的健康玉竹苗，在试验前两周置于温室培养。分别配制1.5
×
10
5 cfu/ml、1.5
×
10
6 cfu/ml、1.5
×
107cfu/ml、1.5
×
108cfu/ml的镰刀菌发酵液。对玉竹叶片进行消毒，然后用棉签在玉竹叶片上涂抹不同浓度的镰刀菌发酵液，每个组别5株，以涂抹无菌水为对照。然后套袋保湿，置于人工气候箱中培养，观察镰刀菌的致病性。经观察，在1.5
×
107cfu/ml即可以达到致病浓度。
21.同样选择3~4片叶的健康玉竹苗，在试验前两周置于温室培养。配制1.5
×
107cfu/ml镰刀菌菌悬液，用接种针接种到玉竹苗叶片上，套袋保湿48h。然后，以约1.8
×
108cfu/ml、约1.8
×
107cfu/ml、约1.8
×
106cfu/ml、约1.8
×
105cfu/ml金色毛壳菌发酵液、无菌水、50%异菌脲500倍稀释液、多利维生-寡雄腐霉（捷克生物制剂国际股份有限公司）、金色毛壳对比菌htc约1.8
×
107cfu/ml，分别喷雾至玉竹苗上，每组15株、套袋保湿，置于人工气候箱中培养10天，观察叶斑形成，并用十字交叉法，测量病斑大小，计算拮抗效果，计算公式如下：
组别金色毛壳菌1.8
×
108cfu/ml金色毛壳菌1.8
×
107cfu/ml金色毛壳菌1.8
×
106cfu/ml金色毛壳菌1.8
×
105cfu/ml50%异菌脲500倍稀释多利维生-寡雄腐霉金色毛壳对比菌htc无菌水抑制率66.1%65.3%55.8%41.4%73.2%67.2%45.8%/
表1 金色毛壳菌发酵液对玉竹叶斑病的抑制效果由表1可见，金色毛壳菌对于镰刀菌引起的玉竹叶斑病具有比较良好的拮抗抑制作用，在1.8
×
107cfu/ml的浓度下，金色毛壳菌的抑制效果与使用50%异菌脲500倍稀释液效果接近，更高的药物浓度对于抑菌效果提升不大，考虑使用的经济性，107cfu/ml的使用浓度是一个较为理想的浓度。金色毛壳菌可以作为镰刀菌引起的玉竹叶斑病的生物防治农药使用。
22.以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。