一种人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法

1.本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法。


背景技术：

2.冬虫夏草是冬虫夏草菌ophiocordyceps sinensis(berk)侵染蝙蝠蛾科hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体，具有重要的药用和经济价值，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。由于其生境特殊(仅在高寒地区自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限，有关部门已将冬虫夏草列为国家二级保护物种。
3.近年来，由于国内外对冬虫夏草的需求迅猛增长，资源面临枯竭。通过人工培育冬虫夏草既可以满足国民需求和市场需要，又能保护生物资源和生态环境。经过30多年的研究，冬虫夏草人工培养技术取得很大进展，人工培养获得的冬虫夏草子实体与野生冬虫夏草代谢成分没有显著差异，暗示两者在药效功能上的一致(tang et al.,stage-and rearing-dependent metabolomics profiling of ophiocordyceps sinensis and its pipeline products.insects 2021,12:666)。因此，随着人工培养冬虫夏草子实体技术的成熟和人们对冬虫夏草药效功能的深入认识，人工培养冬虫夏草将成为野生冬虫夏草的理想替代品，能很好地满足国民需求量的同时缓解冬虫夏草资源枯竭的状况。目前人工培养冬虫夏草子实体主要是使用大米小麦培养基(陶海平，曹莉，韩日畴.糖类和植物生长调节剂对冬虫夏草子实体人工培养的影响.环境昆虫学报，2020，42(2):274-281.)，子实体培养时间长且成本较高，如果遇到接种菌株退化的情况，不会形成子实体或子实体的产量将显著降低，制约了冬虫夏草人工培育产业化和冬虫夏草产品的多样化。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种缩短了冬虫夏草子实体培养时间，显著提高了冬虫夏草子实体产量的人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法。
5.本发明的人工培养冬虫夏草子实体的培养基，每升培养基含150～300g土豆、10～30g胰蛋白胨、20～40g麦芽糖、0.5～1.5g硫酸镁、1.5～3g磷酸二氢钾、20-30mg维生素b1、3～10g谷氨酸钠和5～10g活体昆虫研磨液，溶剂为水。
6.优选，当为固体培养基时，每升培养基含15-20g琼脂粉。
7.优选，所述的人工培养冬虫夏草子实体的培养基，每升培养基含200g土豆、10g胰蛋白胨、20～40g麦芽糖、0.5g硫酸镁、1.5g磷酸二氢钾、20mg维生素b1、3～10g谷氨酸钠和5～10g活体昆虫研磨液，溶剂为水。
8.优选，所述的活体昆虫研磨液是大蜡螟研磨液。
9.本发明的第二个目的是提供一种人工培养冬虫夏草子实体的培养方法，包括以下步骤：
10.a、接种孢子液制备：接种冬虫夏草子实体小块至上述人工培养冬虫夏草子实体的
培养基发酵培养，收集液体发酵获得的孢子液作为子实体培养接种用母种；
11.b、子实体诱导培养：接种孢子液到人工培养冬虫夏草子实体的固体培养基上，培养至菌落形成，然后低温刺激诱导子实体原基分化，子实体原基生长至子实体成熟。
12.优选，所述的步骤a中的发酵培养是110rpm，15
±
3℃黑暗培养。
13.优选，所述的步骤b中已接种孢子液的固体培养基在温度15
±
3℃的培养室黑暗条件下培养至菌落形成，然后转移至4
±
2℃培养箱黑暗培养，刺激子实体原基形成，待子实体原基形成至1cm长后转移至温度15
±
3℃的培养室于黑暗条件继续培养至子实体成熟。
14.本发明提供的人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法，缩短了冬虫夏草子实体培养时间，显著提高了冬虫夏草子实体产量，不仅可以用于快速筛选冬虫夏草菌株是否退化不能形成子实体原基从而避免大规模培养冬虫夏草造成的资源浪费和经济风险，还可以用于规模化培养冬虫夏草子实体，因为本发明中培养基配方相对大米小麦培养基价格更低且操作方便，从而降低人工培养成本。
附图说明：
15.图1是本发明液体发酵培养冬虫夏草菌培养液。
16.图2是本发明液体发酵培养获得孢子液中液生分生孢子和芽生孢子形态，黑色箭头指示芽生孢子，白色箭头指示液生分生孢子。
17.图3是本发明人工培养获得的冬虫夏草子实体。
具体实施方式：
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.按照培养基配方(表1)制备固体和液体培养基，其中200g去皮土豆是200g土豆过滤液，具体制备方法是：200g土豆丝用水煮熟，然后过滤，取过滤液，即为200g煮熟土豆过滤液。大蜡螟是将活体大蜡螟研磨获得。按照表1的配方将各成分混合在水，然后用水定容至1l，固体培养基再加入18g琼脂粉。将液体培养基分装到250ml三角瓶，每瓶装入120ml液体培养基。培养基经121℃高压灭菌25min，液体培养基置于13
±
2℃培养室预冷备用。固体培养基则待冷却到60℃倒板，每个培养皿倒入25ml培养基，待培养基吹干水份后装袋，置于13
±
2℃培养室预冷备用。
20.培养和制备接种孢子液，于超净工作台上用无菌剪刀将实验室无菌培养的冬虫夏草子实体剪成长约0.5cm的子实体小块，再用无菌镊子夹取2～3块子实体接种至上述液体培养基，将接种培养瓶置于110rpm摇床、13
±
2℃培养15d。将培养液(图1)过3层擦镜纸，滤液经8000rpm，4℃离心15min得到孢子液，于显微镜下，血球计数板计数孢子浓度为1
×
109个/ml，孢子液中液生分生孢子和芽生孢子占比为100:1，液生分生孢子和芽生孢子形态见图2。
21.在上述固体培养基平板中央接种10ul孢子液，用封口膜封口平板并装入无菌袋中，置于温度为15
±
3℃人工气候箱黑暗条件下培养40天至菌落形成，然后转移至4
±
2℃冰箱黑暗培养，刺激子实体原基形成，待子实体原基形成至1cm长转移至温度为15
±
3℃的人工气候箱继续黑暗条件下培养5个月至子实体成熟(图3)。将收获的子实体置于烘箱，80℃烘干4h左右至恒重，称重每个培养皿中子实体干重，结果如表2所示。
22.对比例1：
23.按照对比文件(陶海平，曹莉，韩日畴.糖类和植物生长调节剂对冬虫夏草子实体人工培养的影响.环境昆虫学报,2020,42(2):274-281.)中冬虫夏草子实体的最优培养基(100ml的培养瓶中加入大米8g、小麦8g、蚕蛹粉0.4g，营养液22ml；营养液配方为每1l营养液中葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸铵1g，维生素b120 mg)和接种培养方法培养冬虫夏草子实体(每瓶培养基中接种12ml培养30d的冬虫夏草菌菌液，每毫升菌液中含分生孢子3
×
109个、芽生孢子4.5
×
106个，于9～13℃下培养60d至菌丝覆盖培养基表面，再于4℃诱导原基分化并培养至子实体成熟)，在黑暗条件下培养9个月，得到冬虫夏草子实体干重均值为0.80
±
0.03g/皿，显著低于本发明实施例1(表2)。
24.对比例2：
25.按照对比文件(陶海平，曹莉，韩日畴.糖类和植物生长调节剂对冬虫夏草子实体人工培养的影响.环境昆虫学报，2020，42(2):274-281.)中冬虫夏草子实体的最优培养基(100ml的培养瓶中加入大米8g、小麦8g、蚕蛹粉0.4g，营养液22ml；营养液配方为每1l营养液中葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸铵1g，维生素b120 mg)和本发明接种培养方法培养冬虫夏草子实体，即接种孢子液置于温度为15
±
3℃人工气候箱黑暗条件下培养至菌丝布满培养基，然后转移至4
±
2℃冰箱黑暗培养，刺激子实体原基形成，待子实体原基形成至1cm长转移至温度为15
±
3℃的人工气候箱后继续黑暗培养5个月至子实体成熟，得到子实体干重均值为1.04
±
0.04g/皿，显著低于本发明实施例1，但按照本发明培养方法得到的子实体干重显著高于对比例1(表2)。
26.表1不同实施例中培养基组分(每个配方设3个生物学重复，每个重复15皿)
27.培养基组分实施例1实施例2实施例3对比例3对比例4对比例5对比例6去皮土豆200g200g200g200g200g200g200g葡萄糖
ꢀꢀꢀꢀꢀ
20g20g麦芽糖40g40g20g20g20g
ꢀꢀ
胰蛋白胨10g10g10g10g10g20g20g磷酸二氢钾1.5g1.5g1.5g1.5g1.5g1.5g1.5g硫酸镁0.5g0.5g0.5g0.5g0.5g0.5g0.5g大蜡螟10g10g5g5g
ꢀꢀ
5g维生素b120mg20mg20mg20mg20mg20mg20mg谷氨酸钠3g10g3g
ꢀꢀꢀꢀ
水1l1l1l1l1l1l1l
28.表2不同实施例和对比例获得冬虫夏草子实体的干重(g/皿)
[0029] 实施例1实施例2对比例1对比例2实施例3对比例3对比例4对比例5对比例6干重1.89
±
0.10a1.82
±
0.08a0.80
±
0.03b1.04
±
0.04b1.61
±
0.06a0.47
±
0.06c0.28
±
0.03c0.78
±
0.07b0.92
±
0.07b
[0030]
从表1和表可以看出，实施例1得到子实体干重均值为1.89
±
0.10g/皿，显著高于对比例中子实体干重(表2)。
[0031]
实施例2中培养基配方中谷氨酸钠含量高于实施例1，其余组分和培养方法同实施例1。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为1.82
±
0.08g/皿，与实施例1中得到的子实体干重无显著差异，均显著高于对比例中子实
体干重(表2)。
[0032]
实施例3中培养基配方中麦芽糖和大蜡螟研磨液含量均为实施例1中的50％，其余组分和培养方法同实施例1。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为1.61
±
0.06g/皿，与实施例1中得到的子实体干重无显著差异，均显著高于对比例中子实体干重(表2)。
[0033]
对比例3中培养基配方中麦芽糖和大蜡螟研磨液含量是实施例1中的50％，没有添加谷氨酸钠，其余组分和培养方法同实施例1。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为0.47
±
0.06g/皿，显著低于实施例1和对比例1(表2)。
[0034]
对比例4中培养基配方中麦芽糖含量是实施例1中的50％，没有添加大蜡螟研磨液和谷氨酸钠，其余组分和培养方法同实施例1。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为0.28
±
0.03g/皿，显著低于实施例1和对比例1(表2)。
[0035]
对比例5中培养基配方中培养基中糖源为葡萄糖，其余组分和培养方法同对比例4。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为0.78
±
0.07g/皿，显著低于实施例1中得到的子实体干重，与对比例1无显著差异，显著高于实施例5中子实体干重(表2)。
[0036]
对比例6中培养基配方是在对比例5培养基配方基础上添加大蜡螟研磨液。接种孢子液黑暗培养至子实体原基形成后继续黑暗培养5个月，得到子实体干重均值为0.92
±
0.07g/皿，显著低于实施例1中得到的子实体干重，与对比例1无显著差异，显著高于实施例4和5中子实体干重(表2)。