一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种蝴蝶兰再生完整植株的方法。


背景技术：

2.蝴蝶兰(phalaenopsis aphrodite rchb.f.)是兰科(orchidaceae)蝴蝶兰属(phalaenopsis)多年生草本植物，原产马来西亚热带地区，其花型美丽似蝴蝶，故称之为
‘
蝴蝶兰’或
‘
拟蛾兰’。蝴蝶兰花型丰富，花色多样，深受人们喜爱，是世界上最具观赏性及经济性兰科花卉之一。蝴蝶兰属单茎附生兰，植株极少发育出侧枝，故无法进行分株繁殖。且其种子内几乎不含胚乳，通常情况下无法为其萌发提供营养。蝴蝶兰传统杂交育种需遵循植物生长自然规律，育种周期较长。随着生物技术的基因工程技术愈渐成熟，利用外源基因对蝴蝶兰需要进行控制的性状进行改良，能够显著提高育种效率。目前利用农杆菌转化法是对蝴蝶兰性状进行改良的主要手段，而类原球茎作为农杆菌转化法的主要受体材料，良好的生长状态及数量为农杆菌转化奠定了材料基础。同时，一套高效且稳定的蝴蝶兰再生体系为创制蝴蝶兰转基因新品种提供了技术保障和材料保障。因此，有必要以蝴蝶兰花梗腋芽为外植体材料建立再生体系，对其进行进一步的研究和实验。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法。本发明以蝴蝶兰花梗腋芽进行初代培养获得的叶片为外植体，实现蝴蝶兰再生为完整植株。本发明方法培育时间短，成活率高，获得的类原球茎增重倍数高，便于长期保存，且类原球茎是遗传转化的重要受体材料，一定数量状态良好的类原球茎能为蝴蝶兰遗传转化打下坚实基础，同时类原球茎分化生根形成完整植株的时间短，可进行周年生产。
4.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，包括以下步骤：
5.1)蝴蝶兰无菌苗获得：将蝴蝶兰的带腋芽花梗段，经一系列消毒灭菌操作后，再切成2-3cm的带腋芽花梗段，接种于芽诱导初代培养基上，进行初代培养，得到蝴蝶兰的无菌苗；获得的无菌苗，在增殖培养基上进行丛生芽的增殖获得更多无菌苗；
6.2)类原球茎诱导：选择生长30-45d蝴蝶兰无菌苗的叶片，将其切割为0.5
×
0.5cm大小，接种于类原球茎诱导培养基，在黑暗条件下培养7-10d后，转入正常光照条件下，继续培养，在叶片伤口部位诱导出类原球茎；
7.3)类原球茎防褐化及其增殖培养：诱导出的蝴蝶兰类原球茎，接种于类原球茎防褐化及增殖培养基，在正常光照条件下，进行类原球茎的增殖培养，从而获得大量健壮的类原球茎；
8.4)类原球茎分化培养成苗：将得到的类原球茎，接种于类原球茎分化培养基，在正常光照条件下，进行培养，使其分化形成无根小苗；
9.5)生根成苗培养：将分化得到的无根小苗，接种至生根培养基中，在正常光照条件下，进行生根培养，使其再生获得完整植株。
10.进一步地，步骤3)中，类原球茎增殖培养阶段，类原球茎增殖培养基中的6-ba浓度为5mg/l。
11.进一步地，步骤3)中，步骤2)得到的类原球茎接种到添加不同防褐化物质的增殖培养基中，在活性炭1g/l+玉米粉10g/l条件下，增殖过程中类原球茎褐化率最低，且类原球茎能正常增殖并保持分化能力。
12.进一步地，步骤4)中，类原球茎分化成苗培养基中的基本培养基为花宝1号1g/l+花宝2号1g/l，植物生长调节剂为6-ba 2mg/l+iba 0.5mg/l。
13.进一步地，当步骤4)中得到的蝴蝶兰无根系发生时，则进入步骤5)生根培养：将分化出叶片的植株接种于生根培养基中，在正常光照条件下，进行生根培养，从而形成完整植株。
14.进一步地，所述正常光照条件：光照强度为2100-2300lx，光照时间为14h/d，温度为25
±
2℃。
15.进一步地，所述初代培养基：以1/2ms为基本培养基，附加6-ba 5mg/l，kt 2mg/l，naa 1.5mg/l，植物凝胶3g/l，蛋白胨1.5g/l，蔗糖20g/l，cm 20％，加入蒸馏水至1l，ph调至5.5-5.8。
16.进一步地，所述无菌苗增殖培养基为：以花宝1号1g/l+花宝2号1g/l为基本培养基，附加6-ba 3mg/l，tdz 0.5mg/l，植物凝胶3g/l，玉米粉10g/l，蔗糖20g/l，cm 15％，加入蒸馏水至1l，ph 5.5-5.8。
17.进一步地，所述类原球茎诱导培养基成分如下：以1/2ms为基本培养基，附加6-ba 4mg/l，tdz 0.7mg/l，蔗糖30g/l，植物凝胶3g/l，蛋白胨1-1.5g/l，cm 15％，加入蒸馏水至1l，ph 5.5-5.8。
18.进一步地，所述类原球茎防褐化及增殖培养基成分如下：以1/2ms为基本培养基，附加6-ba 5mg/l，ad 3mg/l，ac 1g/l，蔗糖15g/l，植物凝胶3g/l，玉米粉10g/l，cm 15％，蛋白胨1.5g/l，加入蒸馏水至1l，ph 5.5-5.8。
19.进一步地，所述类原球茎分化培养基成分如下：以花宝1号1g/l+花宝2号1g/l为基本培养基，附加6-ba 2mg/l，iba 0.5mg/l，蔗糖15g/l，cm 15％-20％，植物凝胶3g/l，玉米粉10g/l，加入蒸馏水至1l，ph 5.5-5.8。
20.进一步地，所述生根培养基成分如下：以1/2ms为基本培养基，附加6-ba 5mg/l，iba 0.1-0.2mg/l，蔗糖15g/l，cm 15％，ac 0.5g/l，植物凝胶3g/l，加入蒸馏水至1l，ph 5.5-5.8。
21.本发明的有益效果如下：
22.1、本发明所用的外植体采集方便，可以周年进行蝴蝶兰的组织和细胞培养；
23.2、本发明所得到的类原球茎可以持续增殖，不断为蝴蝶兰的遗传转化提供受体材料；
24.3、本发明得到的类原球茎可以长期继代保存并仍具有进一步分化成植株的能力；
25.4、本发明得到的类原球茎，经分化生根培养能快速形成完整植株。
附图说明
26.图1为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’组培苗示意图。
27.图2为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎的诱导示意图。
28.图3为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎的增殖示意图。
29.图4为本发明中防褐化物质对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎生长的影响示意图；其中，a为0g/l活性炭+0g/l玉米粉；b为1g/l活性炭+10g/l玉米粉。
30.图5为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎的萌发示意图。
31.图6为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎萌发生成的苗示意图。
32.图7为本发明中蝴蝶兰
‘
0908’根系叶片生长良好的苗示意图。
33.图8为本发明中培养箱条件下生长的蝴蝶兰
‘
0908’的再生植株示意图。
具体实施方式
34.成熟蝴蝶兰叶片呈肉质，叶偏厚，多次实验表明，直接使用叶片作为外植体消毒进行培养时，类原球茎诱导效率极低，故本发明使用蝴蝶兰花梗腋芽作为外植体进行培养，初代培养得到无菌苗后，以增殖得到的蝴蝶兰无菌苗幼嫩叶片作为诱导类原球茎的外植体材料。
35.本发明一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，包括预处理、类原球茎诱导培养、类原球茎增殖培养、类原球茎分化培养、生根培养、炼苗移栽步骤。具体地，以蝴蝶兰花梗腋芽作为外植体材料，建立了一套完整高效的蝴蝶兰再生体系，同时获得了类原球茎高效增殖的培养基成分，在以往蝴蝶兰类原球茎增殖途径研究中，增殖效率和褐化为主要关注的问题，本发明在增殖培养基中添加活性炭的基础上增加了玉米淀粉10g/l，ad 3mg/l，能够使类原球茎快速增殖且防褐化效果较佳。
36.本发明一种实施例中，试验材料选择、培养基设计与接种培养如下：
37.1、试验材料的来源及处理：
38.本发明中的试验材料蝴蝶兰
‘
0908’(图1)，采自浙江省杭州市浙江农林大学平山试验基地。该品种引种于韩国忠北大学。选取蝴蝶兰
‘
0908’盛花期花梗，先使用洗衣粉浸泡20min后于自来水下冲洗25-30min，再用1％次氯酸钠浸泡10min，然后在超净工作台里用70％乙醇消毒1min，最后用1％hgcl2消毒8-10min，用无菌水洗6次，将蝴蝶兰带腋芽花梗段切成2-3cm大小带芽节段，接种于初代培养基中进行初代培养，培养30-40d后得到无菌苗，然后将无菌苗接种于丛生芽增殖培养基上增殖，获得一定数量的无性系组培苗。
39.2、培养基设计：
40.表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。
41.表1蝴蝶兰的离体培养基设计
[0042][0043]
注：1/2ms基本培养基等基础培养基及所用其他药品均从商业公司处购买。
[0044]
培养基中各种成分的代号如下：活性炭(ac)、腺嘌呤硫酸盐(ad)、6-苄基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)、植物凝胶(phytagel)、tdz(噻苯隆)、cm(椰汁)均可以从商业上购买。
[0045]
3、培养条件：
[0046]
培养室培养温度25
±
2℃，正常光照强度2100-2300lx，光照周期为14h；黑暗条件培养温度25
±
2℃。
[0047]
4、接种与培养：
[0048]
在超净工作台上，以步骤1得到的蝴蝶兰
‘
0908’无菌苗为材料，选取生长30-45d左右的叶片，用已灭菌的接种刀将叶片切割成0.5
×
0.5cm大小，将其接种于类原球茎诱导培养基内(培养基见表1)，使其叶背面朝向培养基，暗培养7-10d后转入正常光照条件，23-40d后伤口处有类原球茎形成(见图2)。
[0049]
将类原球茎接种到类原球茎增殖培养基(见表1)上，在光照下培养，光照强度设置为2100-2300lx，光照时间为14h。这些类原球茎可在类原球茎增殖培养基上快速增殖(见图3)，在增殖过程中添加不同防褐化物质，对类原球茎生长的影响具有较大差异(图4)，图4b明显优于图4a。
[0050]
将类原球茎接种到类原球茎分化成苗培养基上(见表1)，在光照下培养，光照强度设置为2100-2300lx，光照时间为14h，类原球茎开始分化出芽(图5)，继续在该培养基上培养，萌发的类原球茎形成具有两极性的小苗(图6)，当小苗长出2-3片叶、2-3条根时，选择状态良好的蝴蝶兰组培苗可放至自然条件下进行炼苗(图7)。
[0051]
将根系发育良好的蝴蝶兰再生植株移到自然条件下炼苗一周，取出状态良好的植株，洗净根部培养基，并将根部于多菌灵中浸泡2-3s，后移栽到装有高压灭菌的水草的塑料杯中种植，在小苗上方倒扣一个透明塑料杯以保证空气湿度，待成活后将其移置温室，使其健康生长(图8)。
[0052]
本发明实施例中，不同基本培养基对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎诱导的影响，如下：
[0053]
将蝴蝶兰叶片分别接入不同基本培养基，进行暗培养处理7-10d后转入光下培养，持续观察叶片生长状态，发现1/2ms培养基处理组，23.2d左右叶片基部和伤口处开始出现浅绿色膨大现象并形成类原球茎，且随着时间的推移，后续类原球茎陆续增多，类原球茎的状态较佳，呈明显嫩绿色，颗粒感明显，后续生长良好。在花宝1号+花宝2号培养基上26.6d左右叶片伤口部位出现膨大现象，诱导出的类原球茎呈绿色，状态较佳，但是其生长速度较1/2ms培养基处理组更为缓慢。ms培养基处理组诱导率较1/2ms处理组低，类原球茎形成的时间较长。而叶片在花宝1号、花宝2号、v&w培养基处理组中进行培养，类原球茎形成的天数无显著差异，诱导率也都较其他3种培养基处理组低，类原球茎形成时间较长，且类原球茎的颜色呈黄白色，状态较差，培养一段时间后部分类原球茎出现褐化及死亡现象。综上，1/2ms培养基为诱导蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎最合适的基本培养基。
[0054]
表2不同基本培养基对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎诱导的影响
[0055][0056][0057]
本发明实施例中，不同植物生长调节剂浓度对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎增殖的影响，如下：
[0058]
将诱导出的生长状态相似的蝴蝶兰类原球茎置于不同植物生长调节剂浓度处理组培养45d后，结果表明当6-ba浓度在5mg/l时，类原球茎增殖效果最佳，类原球茎颗粒饱满呈深绿色，且发现降低6-ba的浓度时，其增重倍数不高，但是随着tdz浓度的增加，其增重倍数逐渐升高。研究同时发现，在tdz浓度相同的情况下，6-ba浓度越高，增重倍数越高，在6-ba和tdz浓度均较低的情况下，类原球茎的状态较差，常伴随褐化及芽分化现象的发生。结合以上分析，蝴蝶兰类原球茎增殖的最佳植物生长调节剂为5mg/l 6-ba。
[0059]
表3：不同植物生长调节剂浓度对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎增殖的影响
[0060]
不同植物生长调节剂种类及浓度(mg/l)类原球茎增重倍数类原球茎生长状态6-ba1+tdz02.20
±
0.32f有褐化现象，状态较差6-ba3+tdz03.62
±
0.47cde有少许出芽，状态一般
6-ba5+tdz06.29
±
0.35a颗粒圆润饱满，呈深绿色6-ba1+tdz0.12.89
±
0.28ef黄化，状态较差6-ba3+tdz0.13.57
±
0.33cde少许白化，颗粒不饱满6-ba5+tdz0.15.08
±
0.28b颗粒饱满圆润，色泽偏绿6-ba1+tdz0.23.07
±
0.36def少许白化，状态较差6-ba3+tdz0.24.01
±
0.34cd色泽翠绿，少许玻璃化6-ba5+tdz0.24.43
±
0.19bc色泽翠绿，状态良好
[0061]
本发明实施例中，不同防褐化物质对类原球茎生长的影响，如下：
[0062]
在蝴蝶兰组培过程中，防止褐化现象发生是类原球茎生长过程中亟需解决的问题之一，目前防褐化物质主要有活性炭，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、柠檬酸等，在培养基中添加玉米淀粉来防止褐化现象的发生还未见报道，此发明在类原球茎增殖过程中添加不同浓度的玉米淀粉来探究其在蝴蝶兰组培过程中防褐化的作用。在蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎增殖培养阶段，设计了8组实验比较其对蝴蝶兰类原球茎生长中的影响。结果表明不添加任何防褐化物质的处理，褐化程度最高，褐化率达44.44％，类原球茎生长状态受褐化影响，单独添加10g/l玉米粉褐化率与单独添加活性炭无显著差异，当玉米粉浓度为15g/l时，褐化率会升高但较对照组的褐化率低。添加1g/l活性炭以及10g/l玉米粉的处理组和褐化率最低，与其他处理组存在显著性差异；且类原球茎能正常增殖并保持分化能力。
[0063]
表4：不同防褐化物质对类原球茎生长的影响
[0064]
不同防褐化物质褐化率(％)活性炭1g/l+玉米粉0g/l20.00
±
3.85cde活性炭1g/l+玉米粉5g/l22.22
±
2.22cde活性炭1g/l+玉米粉10g/l13.33
±
3.85e活性炭1g/l+玉米粉15g/l28.89
±
2.22bc活性炭0g/l+玉米粉0g/l44.44
±
4.44a活性炭0g/l+玉米粉5g/l24.44
±
2.22bcd活性炭0g/l+玉米粉10g/l17.78
±
3.85de活性炭0g/l+玉米粉15g/l33.33
±
2.22b
[0065]
本发明实施例中，不同培养基对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎分化的影响，如下：
[0066]
蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎分化阶段，设计了8种培养基比较其对蝴蝶兰类原球茎萌发的影响，结果如表5所示：基础培养基为花宝1号1g/l+花宝2号1g/l时，分化率基本都高于以1/2ms为基础培养基的处理组，且当6-ba为2mg/l、iba为0.5mg/l时，分化率最高，达82.22％，与其他组存在显著差异。蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎在分化培养基上培养1个月能分化出芽，继续培养30-45d长出叶片后，部分会生出根系，将未生根的小苗转入生根培养基进行生根后，再进行炼苗，移栽下地。
[0067]
表5：不同培养基对蝴蝶兰
‘
0908’类原球茎的萌发和植株再生的影响
[0068][0069][0070]
注：数据显示为平均值
±
标准误，不同字母表示在p《0.05水平上差异显著。
[0071]
类原球茎增重倍数＝45d后类原球茎鲜重量/接种时类原球茎鲜重量
[0072]
类原球茎分化率(％)＝分化的类原球茎数/接种的类原球茎总数
×
100％。
[0073]
本发明获得的类原球茎可作为农杆菌介导的蝴蝶兰遗传转化的受体材料，为蝴蝶兰转基因新品种创制奠定基础。
[0074]
本发明并不限于上述实施方式，采用与本发明上述实施方式相同或近似的方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均在本发明专利的保护范围之内。