细胞储存液及其应用的制作方法

1.本发明生物技术领域，具体地，本发明涉及细胞储存液及其应用。


背景技术：

2.细胞通常在冻存后使用液氮或干冰运输，或者细胞在用细胞培养液灌满培养瓶后进行常温运输。这些运输方式均存在一些缺点，比如液氮和干冰下冷冻运输虽然可保持较高的生命活性，但液氮和干冰的运输成本高，而且在包括中国在内的一些国家液氮与干冰归于九类危险品，运输受限。细胞培养液灌满方式细胞存活时间短，不适合长时间运输。
3.现有文献the analysis of viability for mammalian cells treated at different temperatures and its application in cell shipment(plos one；2017；12(4):e0176120)公开了小鼠胚胎干细胞在含有15％knockout
tm
血清替代物的knockout
tm dmem/f12培养基中培养，0.1mm非必需氨基酸、2mm l-谷氨酰胺和0.05mm2-巯基乙醇、2ng/ml人白血病抑制因子、0.8μm抑制剂pd0325901和3μm抑制剂chir 99021。在低温下，第四天干细胞的活力降低至40-50％。干细胞保存的时间短。
4.现有专利文献公开号cn107306936a公开了一种常温条件下保存运输干细胞的方法及其所使用的基质。保存运输干细胞的方法包括：干细胞团块形成步骤；干细胞团块培养步骤；干细胞团块制品封装运输步骤；干细胞团块基质去除步骤。可见，该方法需要形成干细胞团块和去除干细胞团块基质的过程，过程比较复杂。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种细胞储存液，增加细胞在常温下的保存或运输时间。
6.第一方面，本公开提供了一种细胞储存液，所述细胞储存液包括：基础培养基、胎牛血清、mek抑制剂和rock抑制剂。
7.在一些实施方式中，所述细胞储存液包括：
8.基础培养基
ꢀꢀ
70-95％v/v；
9.胎牛血清
ꢀꢀꢀꢀ
2-25％v/v；
10.mek抑制剂
ꢀꢀꢀ
500-5000nm/l；
11.rock抑制剂
ꢀꢀ
500-5000nm/l。
12.在一些实施方式中，所述mek抑制剂选自atp竞争性mek抑制剂和非atp竞争性mek抑制剂。在一些实施方式中，所述mek抑制剂为非atp竞争性mek抑制剂。
13.在一些实施方式中，所述非atp竞争性mek抑制剂选自pd0325901、pd98059、u0126和arry-142886，及其任意组合。
14.在一些实施方式中，所述非atp竞争性mek抑制剂为pd0325901。在一些实施方式中，所述pd0325901在所述细胞储存液中的浓度为500-5000nm/l，优选为1000-3000nm/l。
15.在一些实施方式中，所述rock抑制剂选自y-27632和h-1152，及其任意组合。
16.在一些实施方式中，所述rock抑制剂为y-27632。在一些实施方式中，所述y-27632
在所述细胞储存液中的浓度为500-5000nm/l，优选为500-2000nm/l。
17.在一些实施方式中，所述基础培养基选自dmem、dmem/f12、mem、α-mem和opti-mem
tm
i减血清培养基，及其任意组合。
18.在一些实施方式中，所述基础培养基为opti-mem
tm
i减血清培养基。
19.在一些实施方式中，所述细胞储存液还包括：n-2补充剂和/或b-27补充剂，优选为n-2补充剂和b-27补充剂。
20.在一些实施方式中，所述n-2补充剂在所述细胞储存液中的浓度为0.5-5％v/v；所述b-27补充剂在所述细胞储存液中的浓度为1-10％v/v。
21.在一些实施方式中，每100ml的所述细胞储存液包括：
[0022][0023][0024]
第二方面，本发明提供一种保存或运输细胞的方法，所述方法包括：将所述细胞与本发明第一方面提供的细胞储存液混合于离心管中，之后密封所述离心管。
[0025]
在一些实施方式中，所述细胞为多能干细胞。在一些实施方式中，所述细胞为胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述胚胎干细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。
[0026]
在一些实施方式中，所述哺乳动物的胚胎干细胞为灵长类的胚胎干细胞，例如人的胚胎干细胞。
[0027]
在一些实施方式中，所述保存或运输细胞的温度为16-25℃。
[0028]
第二方面，本发明提供本发明第一方面提供的细胞储存液在保存或运输细胞中的应用。
[0029]
本发明提供的细胞储存液能够使细胞在常温下保存或运输7天以上，便于保存和运输，以及复性。尤其是对低温敏感的细胞，例如胚胎干细胞，经过该细胞储存液7天保存或运输后仍然有约15％的细胞存活，并能够快速恢复细胞活性。
附图说明
[0030]
图1显示了小鼠胚胎干细胞的电镜照片。图中的箭头所指为小鼠的胚胎干细胞。
[0031]
图2显示了实施例1的小鼠胚胎干细胞的电镜照片。
[0032]
图3显示了第3天小鼠胚胎干细胞的存活结果。图中*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
[0033]
图4显示了第7天小鼠胚胎干细胞的存活结果。图中*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001代表极显著。
具体实施方式
[0034]
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0035]
定义
[0036]
除非另外定义，否则在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
[0037]
本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。
[0038]
本文所使用，术语“基础培养基”是指是指仅能够维持细胞生存的培养基，其可以为包含氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液。营养素包括可被细胞代谢的碳源(例如糖，如葡萄糖)，以及细胞存活必需的其它化合物。许多基础培养基是哺乳动物细胞培养领域所已知的，例如dmem培养基、dmem/f12培养基和mem培养基等。
[0039]
本文所使用，术语“mek”是指丝裂原/细胞外信号调节激酶(mek)家族，是磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(mapk)的激酶。mek也称为map2k和mapkk。mek的同工型包括但不限于mek1和mek2。
[0040]
本文所使用，术语“mek抑制剂”是指是指降低或减少mek依赖性细胞信号传导/功能，并且降低或减少与mek相关的干细胞增殖/生长的化合物或药物。
[0041]
本文所使用，术语“pd0325901”(mirdametinib)是指一种选择性的，非atp竞争性mek抑制剂。“pd0325901”的结构式为：
[0042]
本文所使用的术语“pd98059”的结构式为：
[0043][0044]
本文所使用，术语“u0126”是map激酶mek1和mek2的选择性抑制剂。它通过抑制mek1/2的激酶活性发挥作用，从而阻止分别由erk2和erk1基因编码的map激酶p42和p44的激活。u0126的结构式为：
[0045][0046]
本文所使用，术语“arry-142886”替代名称的包括azd6244、司美替尼和6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-n-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺。arry-142886的结构式
为：
[0047][0048]
本文所使用，术语“rock”是指rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶，其具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，并调节胞质分裂、平滑肌收缩、肌动蛋白应力纤维和粘着斑的形成以及c-fos血清反应元件的激活。
[0049]
如本文所用，术语“rock抑制剂”是指能够抑制rock活性的任何分子，如通过抑制rock磷酸化水平确定的(通过蛋白质印迹分析检测)。
[0050]
如本文所用，术语“y-27632”或“法舒地尔”或“fasudil”是一种rock rho激酶的小分子抑制剂。y-27632的结构式为：
[0051][0052]
如本文所用，术语“h-1152”是一种可透过膜的选择性rock抑制剂。
[0053]
如本文所用的术语“n-2补充剂”(也称为n2补充剂)是指化学定义的、无血清的营养补充剂。n-2补充剂含有胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺和亚硒酸盐。n2补充剂可从thermofisher等各种商业供应商处获得。
[0054]
如本文所用，术语“b-27补充剂”(也称为b27补充剂)是指促进体外培养的神经元长期存活的无血清营养补充剂。b27补充剂可从thermofisher等各种商业供应商处获得。
[0055]
如本文所用，术语“干细胞”是指具有分化潜能和保持分化潜能的增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。干细胞依据分化潜能包括多种亚群，诸如多能干细胞(pluripotent stem cell)，专能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞等。
[0056]
如本文所用，术语“多能干细胞”是指能够在体外培养并具有分化成属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系的能力的干细胞。psc可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。psc的实例包括胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)、胚胎生殖细胞(eg细胞)等。
[0057]
如本文所用，术语“常温”或“室温”通常是指25℃。
[0058]
在实现本发明的过程中，发明人发现使用干冰或液氮保存细胞，不便于细胞运输，并且有些细胞对低温敏感，例如5℃以下保存其存活率低。因此，发明人发明了细胞储存液。该细胞储存液通过添加细胞生存必须的基础培养基和牛胎血清，并添加mek抑制剂和rock抑制剂，抑制细胞增殖和死亡，能够在常温下维持细胞的生存能力，便于常温保存或运输。
[0059]
将细胞置于该细胞储存液中，在常温下保存或运输7天，细胞仍然具有较高的生存能力。
[0060]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)中进行了描述。
[0061]
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0062]
实施例
[0063]
实施例1利用细胞储存液(esrt)常温保存小鼠胚胎干细胞
[0064]
配制细胞储存液。细胞储存液的配方：opti-mem
tm
i减血清培养基(gibco,31985088)+n-2补充剂(100
×
)(gibco,a1370701)+b-27补充剂(50
×
)(gibco,17504044)+胎牛血清+pd0325901(selleck,s1036)+y-27632(selleck,s1049)。
[0065]
每100ml的细胞储存液包括：
[0066][0067]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入sl培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μl细胞储存液重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0068]
对比例1
[0069]
本对比例所用的细胞储存培养基与实施例1所用的esrt相比，区别仅在于缺少pd0325901。
[0070]
配制细胞储存培养基。细胞储存培养基的配方：opti-mem
tm
i减血清培养基(gibco,31985088)+n-2补充剂(100
×
)(gibco,a1370701)+b-27补充剂(50
×
)(gibco,17504044)+胎牛血清+y-27632(selleck,s1049)。
[0071]
每100ml的细胞储存培养基包括：
[0072]
[0073][0074]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入sl培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μl细胞储存培养基重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0075]
对比例2
[0076]
本对比例所用的储存培养基与实施例1所用的esrt相比，区别仅在于缺少y27632。
[0077]
配制细胞储存培养基。细胞储存培养基的配方：opti-mem
tm
i减血清培养基(gibco,31985088)+n-2补充剂(100
×
)(gibco,a1370701)+b-27补充剂(50
×
)(gibco,17504044)+胎牛血清+pd0325901(selleck,s1036)。
[0078]
每100ml的细胞储存培养基包括：
[0079][0080]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入sl培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μl细胞储存培养基重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0081]
对比例3
[0082]
本对比例所用的储存培养基与实施例1所用的esrt相比，区别仅在于缺少胎牛血清、pd0325901和y27632。
[0083]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入n2b27培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μln2b27培养基重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0084]
对比例4利用sl培养基常温保存小鼠胚胎干细胞
[0085]
配制sl培养基。sl培养基的配方：knockout
tm dmem+胎牛胎血清(gibco)+谷氨酰胺(gibco,100
×
)+非必需氨基酸(gibco,100
×
)+β-巯基乙醇+白血病抑制因子(lif)(millipore)。
[0086]
每100ml的sl培养基包括：
[0087][0088]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入sl培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μl sl培养基重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0089]
对比例5利用pbs常温保存小鼠胚胎干细胞
[0090]
pbs品牌hyclone，货号sh30028.02。
[0091]
将对数生长期的小鼠胚胎干细胞用0.05％胰酶消化3min后，加入sl培养基终止消化，转速250g离心5min后pbs重悬后计数，取100万小鼠胚胎干细胞离心后用200μlpbs重悬放进1.5ml离心管中，用封口膜封口即可。而后其在常温中保存达7天。
[0092]
测试例对实施例1和对比例1-5的小鼠胚胎干细胞进行检测
[0093]
将实施例1和对比例1-5中分别在室温保存3天和7天的小鼠胚胎干细胞进行台盼蓝染色以及细胞计数，重复3次，结果表1、图3和图4所示。
[0094]
表1小鼠胚胎干细胞的保存结果
[0095][0096]
注：d3和d7的细胞计数为细胞计数的平均值。
[0097]
由表1可知，在第3天，由esrt保存的小鼠胚胎干细胞的存活数量与对比例1、3-5具有极显著差异，与对比例2具有显著差异。在第7天，由esrt保存的小鼠细胞的存活数量与对比例1、3-5仍具有极显著差异，与对比例2有统计学差异性。
[0098]
在小鼠胚胎干细胞常温运输储存液esrt储存条件下(实施例1)，d3细胞存活率达到约25％，d7细胞存活率接近15％，远高于对比例1-5的结果。
[0099]
实施例1、对比例3和4中的小鼠胚胎干细胞分别在室温保存7天后，用1ml小鼠胚胎干细胞培养基缓慢加入离心管中使小鼠胚胎干细胞适应新培养基，250g离心5min后用小鼠胚胎干细胞培养基重悬即可加入培养皿(12孔板一个孔，gelatin(明胶)提前一天铺板)中培养，每天更换新鲜培养基。3天后实施例1、对比例3和4的小鼠胚胎干细胞存活的情况如图
1所示，其中实施例1的小鼠胚胎干细胞的电镜照片如图2所示。可见，实施例1的小鼠胚胎干细胞的存活结果优于对比例3和4。
[0100]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0101]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0102]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。