一种含有重楼提取物的组合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及中药材综合利用方法技术领域，具体涉及一种含有重楼提取物的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.重楼是百合科(liliaceae)重楼属(paris)植物的总称，是一类极具有药用价值的植物，作为中国常用的传统中药材，重楼一直以根茎入药，具有清热解毒，消肿止痛和凉肝定惊的功效。重楼的生长周期长，一般从种子萌发到可收获利用至少需要6-7年，全国的重楼产量并不能满足市场需求。重楼的地上部分一直被认为是非入药部位，因此地上部分大量被丢弃。但是，重楼的地上部分每年都可再生，重楼茎叶生长速度快，每年的生长量相当于同年根生长量的7-8倍，至今未被开发利用，造成巨大的资源浪费。为了充分利用该丢弃的植物资源，已有不少学者对重楼的地上部位开展了物质基础研究，认为重楼地上部分可以作为重楼药用资源开发的一个方向。重楼地上部分的应用，除了制药之外，还有多种潜在的用途待开发，亟需对重楼地上部分进行进一步地探索和研究，以开发出其新的应用领域，为重楼资源综合利用创造基础。


技术实现要素：

3.本发明意在提供一种含有重楼提取物的组合物的制备方法，以解决现有技术中的重楼地上部分未被充分利用的技术问题。
4.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种含有重楼提取物的组合物的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
6.s1：使用醇类溶剂对药材粉料进行热回流提取，获得提取液；所述药材粉料由重楼地上部分经干燥和粉碎后获得；
7.s2：将提取液浓缩后分散于水中，获得浸膏分散液；
8.s3：使用乙酸乙酯萃取所述浸膏分散液，获得水相a；
9.s4：使用水饱和正丁醇萃取水相a，获得正丁醇相；将正丁醇相浓缩后，获得正丁醇相浸膏。
10.本方案还提供了一种含有重楼提取物的组合物的制备方法所制备的真菌抑制组合物，所述真菌抑制组合物包括正丁醇相浸膏和多菌灵。
11.本方案还提供了一种真菌抑制组合物在防治澳洲坚果果树的真菌引起的病害中的应用。
12.本方案的原理及优点是：
13.在本技术方案中，对通常丢弃的重楼地上部分及进行了综合利用，首先使用醇类溶剂对重楼地上部分的功效成分进行提取，然后使用乙酸乙酯和正丁醇分别对提取物及进行萃取，在正丁醇相中，将目的功效成分富集。采用本技术放案，具有提取工艺简单易行，且正丁醇相的提取物能够有效抑制包括小孢拟盘多毛孢在内的真菌生长的作用。
14.澳洲坚果(macadamia spp.)为山龙眼科(proteaceae)澳洲坚果属(macadamia f.muell.)常绿乔木树种，是澳大利亚本土植物中唯一被驯化成为世界性栽培的经济作物。我国上世纪70年代末开始引种试种，至2008年澳洲坚果产业才迅速发展起来，现种植面积位居世界第一，占全球种植面积的一半以上。发明人长期从事包括澳洲坚果在内的经济树种的种植研究工作，如何对澳洲坚果的病虫害进行有效防止，是亟待解决的问题。在真菌病害方面，拟盘多毛孢(小孢拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢)可为害澳洲坚果多个部位，引起叶枯、枝条回枯、叶片黄褐斑、落叶、流胶等病害。目前，主要采用化学药物对真菌病害进行防治，但是大量的化学药物的应用，会对生态环境带来负担。发明人在尝试对重楼地上部分进行资源综合利用的时候，发现重楼提取物对真菌具有一定抑制作用，特别是对小孢拟盘多毛孢这种澳洲坚果果树的致病菌具有有效的抑制效果。上述现象的发现，可以将重楼地上部分应用于澳洲坚果果树的病虫害防治中，实现资源的综合利用。
15.发明人进而将本方案的提取物和多菌灵联合使用。在低浓度条件下，多菌灵难以实现对真菌生长的有效抑制。重楼提取物(正丁醇相浸膏)与多菌灵联合使用，可以对小孢拟盘多毛孢产生理想的抑制作用。
16.进一步，在s1中，所述重楼地上部分包括茎和叶片。重楼的茎和叶每年都可再生，重楼茎叶生长速度快，每年的生长量相当于同年根生长量的7-8倍，至今未被开发利用，造成巨大的资源浪费。本技术方案将茎和叶片等废弃部位重新利用，并用于经济树种澳洲坚果的生物防治中，实现了变废为宝以及资源的综合利用。
17.进一步，在s1中，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇和水中的任意一种；药材粉末与醇类溶剂的用量比为500g：1000-1500ml。采用上述溶剂可以实现对重楼中的功效成分的充分提取。
18.进一步，在s1中，热回流提取的次数为3次，每次2-3小时。多次热回流提取，保证重楼中的功效成分充分被浸出。
19.进一步，在s2中，所述浸膏分散液中提取液浸膏的浓度为25g/ml。在上述浓度下，功效成分在后续的萃取过程中，能够在水相和有机相之间充分分配，实现目的成分的充分富集以及去除不具有真菌抑制功效的成分。
20.进一步，在s3中，乙酸乙酯和浸膏分散液的体积比为1-2：1；萃取次数为三次，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时。上述的参数设置，保证了从重楼中提取的功效成分在乙酸乙酯相和水相之间分配。
21.进一步，在s3中，水饱和正丁醇和水相a的体积比为1-2：1；萃取次数为三次，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时。上述的参数设置，保证了从重楼中提取的功效成分在正丁醇相和水相之间分配，最终获得的正丁醇相中含有大量的具有抗真菌效果的物质。
22.进一步，正丁醇相浸膏的工作浓度为0.001-0.1g/ml,多菌灵的工作浓度为3μg/ml。在上述工作浓度下，正丁醇相浸膏和多菌灵形成的组合物可以充分发挥针对小孢拟盘多毛孢等真菌的抑制作用。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
24.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
25.实施例1
26.取重楼地上部分(茎和叶片，具体选用的重楼品种为云南重楼paris polyphylla smith var.yunnanensis(franch.)hand.-mazz.，为《中国药典》中收录品种)，将上述重楼地上部分置于60℃烘箱烘干至恒重，粉碎后过40目筛，获得药材粉料，以备后续提取使用。
27.称取药材粉末500g，将其粉碎加入1000ml体积分数为60％的乙醇，浸泡8小时后，热回流提取3小时，然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.28g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液(需过滤除去少量未溶解部分)。
28.使用等体积的乙酸乙酯萃取浸膏分散液，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，保留乙酸乙酯层。萃取三次，将乙酸乙酯层合并，获得乙酸乙酯相，经过乙酸乙酯萃取过后的水层保留至后续萃取步骤，称为水相a。将乙酸乙酯相经常规旋蒸浓缩至膏状，获得乙酸乙酯相浸膏(密度为1.29g/ml)。
29.使用等体积的水饱和正丁醇萃取水相a，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，保留正丁醇层。萃取三次，将正丁醇层合并，获得正丁醇相，经过正丁醇萃取过后的水层保留，称为水相b。将正丁醇相经常规旋蒸浓缩至膏状，获得正丁醇相浸膏(密度为1.25g/ml)。水相b经常规旋蒸浓缩至膏状，获得水相浸膏(密度为1.31g/ml)。
30.文献“云南澳洲坚果春季病害病原调查及主要病原防治药剂筛选，蒋桂芝等，热带农业科技2018,41(4)”报道了：在对云南澳洲坚果春季病害的调查中采集到9种症状的病害，其中叶枯、枝枯为主要病害。经病原菌分离和致病性测试，鉴定病原菌有9种，拟盘多毛孢为优势种群，其次为拟茎点霉、毛色二孢、炭疽菌等。拟盘多毛孢(小孢拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢)可为害澳洲坚果多个部位，引起叶枯、枝条回枯、叶片黄褐斑、落叶、流胶等病害。本实验以拟盘多毛孢作防治对象，进行重楼提取物组合物的效果测试。其中，具体选取拟盘多毛孢中的小孢拟盘多毛孢(p.microspora)作为研究对象。小孢拟盘多毛孢菌落白色，圆形，菌丝无色，具隔膜和分支，生长后期产生分生孢子盘，为常见经济树种致病菌，可通过商业化手段获得科研用菌种。具体的实验步骤如下：
31.按照如下配方配制现有技术常规的pda固体培养基：马铃薯200g、蔗糖18g、琼脂18g、水1000ml。将本技术方案获得的重楼提取物分散于水中(重楼提取物为提取液浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏和水相浸膏中的一种)，重楼提取物在分散液中的浓度为0.5g/ml，获得重楼提取物分散液。然后将重楼提取物分散液12000rpm离心20min，取上清，上清再经过常规过滤除菌(0.22μm)，获得待测液，4℃保存待用。对pda培养基进行常规的湿热灭菌处理(0.1mpa、121℃湿热灭菌20分钟)，待灭菌后的pda培养基降温至60℃左右时，加入待测液以及多菌灵溶液(cas：10605-21-7)混匀倒平板，每个平板倒入10ml培养基。重楼提取物在pda培养基中的终浓度为0.1g/ml、0.05g/ml、0.01g/ml和0.001g/ml，多菌灵在pda培养基中的终浓度为3μg/ml(以多菌灵c9h9n3o2实际用量计，使用多菌灵可湿性粉剂)。并同时设置阴性对照(不加重楼提取物以及多菌灵)，以及重楼提取物单用的对照组(不加多菌
灵，重楼提取物在pda培养基中的终浓度为0.05g/ml)。
32.待平板冷却过夜后，取预培养好的小孢拟盘多毛孢菌落上直径为0.5cm的菌饼，接种到上述平板中央，每皿放1块菌饼，每组实验设3个重复，置25℃恒温培养箱中培养7天后采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。菌落直径(cm)＝平均菌落直径-0.5cm(初始菌饼)；抑制率(％)＝(阴性对照组菌落直径-处理组菌落直径)/阴性对照组菌落直径
×
100％。实验结果参见表1-3。
33.表1：实施例1的真菌抑制实验结果(阴性对照、提取液浸膏以及乙酸乙酯相浸膏)
[0034][0035]
表2：实施例1的真菌抑制实验结果(正丁醇相浸膏以及水相浸膏)
[0036][0037]
表3：实施例1的真菌抑制实验结果(重楼提取物单用对照组)
[0038][0039]
重楼提取物(正丁醇相浸膏)显示出一定的对小孢拟盘多毛孢的抑制效果，这是现有技术中尚未报道的。不同的重楼提取物显示出了不同的真菌抑制性能，从表1、表2和表3的数据可以看出，重楼提取物(正丁醇相浸膏)的抑菌效果显著优于重楼的60％乙醇提取物(提取液浸膏)、乙酸乙酯萃取物(乙酸乙酯相浸膏)，以及经过乙酸乙酯和正丁醇萃取后的物质(水相浸膏)。证明具有真菌抑制功效的成分主要集中在正丁醇萃取相中。
[0040]
现有技术报道，多菌灵在较大浓度条件下可以实现对真菌生长的有效抑制。发明人尝试了更低的多菌灵浓度，发现在低浓度条件下，多菌灵难以实现对真菌生长的有效抑制。其中，发明人通过预实验发现，多菌灵在3μg/ml的浓度条件下，几乎对小孢拟盘多毛孢不产生抑制作用，可见，多菌灵需要在较大浓度的条件下才能有效实现对真菌的抑制，进而防治澳洲坚果果树病变。在本技术方案中，将重楼提取物(正丁醇相浸膏)与多菌灵联合使用，可以对小孢拟盘多毛孢产生理想的抑制作用。但是，重楼提取物(正丁醇相浸膏)不与多菌灵联合，则抑菌效果大大被削弱。
[0041]
实施例2
[0042]
取重楼地上部分(茎和叶片，具体选用的重楼品种为云南重楼paris polyphylla smith var.yunnanensis(franch.)hand.-mazz.，为《中国药典》中收录品种)，将上述重楼地上部分置于60℃烘箱烘干至恒重，粉碎后过40目筛，获得药材粉料，以备后续提取使用。
[0043]
称取药材粉末500g，将其粉碎加入1500ml体积分数为60％的乙醇，浸泡10小时后，热回流提取2小时，然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.30g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液。
[0044]
使用两倍体积的乙酸乙酯萃取浸膏分散液(浸膏分散液：乙酸乙酯＝1：2)，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，萃取三次，经过乙酸乙酯萃取过后的水层保留至后续萃取步骤，称为水相a。
[0045]
使用两倍体积的水饱和正丁醇萃取水相a(水相a：水饱和正丁醇＝1：2)，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，保留正丁醇层。萃取三次，将正丁醇层合并，获得正丁醇相。将正丁醇相经常规旋蒸浓缩至膏状，获得正丁醇相浸膏(密度为1.26g/ml)。使用正丁醇相浸膏作为重楼提取物进行如实施例1记载的真菌抑制实验，实验结果参见表4。
[0046]
实施例2制备的正丁醇相浸膏同多菌灵联合使用，可以实现对于小孢拟盘多毛孢的有效抑制。
[0047]
表4：实施例2的真菌抑制实验结果
[0048][0049]
对比例1
[0050]
本对比例基本同实施例1，不同点在于萃取过程，具体如下：
[0051]
使用等体积的石油醚萃取浸膏分散液，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，萃取三次。保留经过石油醚萃取过后的水层，获得水相a’。使用等体积的乙酸乙酯萃取水相a’，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，萃取三次。经过乙酸乙酯萃取过后的水层保留至后续萃取步骤，称为水相b’。使用等体积的水饱和正丁醇萃取水相b’，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，萃取三次。将正丁醇层合并，获得正丁醇相，将正丁醇相经常规旋蒸浓缩至膏状，获得正丁醇相浸膏(密度为1.28g/ml)。使用正丁醇相浸膏作为重楼提取物进行如实施例1记载的真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0052]
对比例2
[0053]
本对比例基本同实施例1，不同点在于萃取过程，具体如下：
[0054]
使用等体积的水饱和正丁醇萃取浸膏分散液，每次萃取的混合时间为10分钟，静置时间为2小时，萃取三次。将正丁醇层合并，获得正丁醇相，将正丁醇相经常规旋蒸浓缩至膏状，获得正丁醇相浸膏(密度为1.31g/ml)。使用正丁醇相浸膏作为重楼提取物进行如实施例1记载的真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0055]
对比例3
[0056]
本对比例基本同实施例1，不同点在于提取过程，具体如下：
[0057]
称取药材粉末500g，将其粉碎加入1000ml的甲醇中，浸泡8小时后，热回流提取3h，
然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.27g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液。
[0058]
萃取过程同实施例1，获得正丁醇相浸膏，并对正丁醇相浸膏进行真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0059]
对比例4
[0060]
本对比例基本同实施例1，不同点在于提取过程，具体如下：
[0061]
称取药材粉末500g，将其粉碎加入1000ml的体积分数为40％的乙醇溶液中，浸泡8小时后，热回流提取3h，然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.27g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液。
[0062]
萃取过程同实施例1，获得正丁醇相浸膏，并对正丁醇相浸膏进行真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0063]
对比例5
[0064]
本对比例基本同实施例1，不同点在于提取过程，具体如下：
[0065]
称取药材粉末500g，将其粉碎加入1000ml的纯水中，浸泡8小时后，热回流提取3h，然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.27g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液。
[0066]
萃取过程同实施例1，获得正丁醇相浸膏，并对正丁醇相浸膏进行真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0067]
对比例6
[0068]
本对比例基本同实施例1，不同点在于提取过程，具体如下：
[0069]
称取药材粉末500g，将其粉碎加入1000ml的无水乙醇中，浸泡8小时后，热回流提取3h，然后过滤、抽滤，收集滤液和药渣，热回流提取三次，将三次获得的滤液合并，获得提取液。然后将得到的提取液经常规旋蒸浓缩至膏状，获得提取液浸膏(密度为1.27g/ml)，将浸膏溶于纯水(浓度为25g/ml)，获得浸膏分散液。
[0070]
萃取过程同实施例1，获得正丁醇相浸膏，并对正丁醇相浸膏进行真菌抑制实验，实验结果参见表5。
[0071]
表5：对比例的真菌抑制实验结果
[0072][0073]
由表5的实验数据可知，对比例1和对比例2的真菌抑制活性较实施例1变差。对比例1和对比例2的萃取工艺较实施例和实施例2有所改变。对比例1在乙酸乙酯萃取之前加入了石油醚萃取的步骤，将非极性较强的物质在乙酸乙酯萃取之前从浸膏分散液中除去，对后续萃取过程的物质分配造成了一定影响，最终分配到正丁醇相的具有真菌抑制作用的成
分含量减少，导致了正丁醇相浸膏的真菌抑制效果变差。对比例2直接使用正丁醇萃取浸膏分散液，没有进行乙酸乙酯的萃取，大量的非具有真菌抑制活性的成分进入正丁醇相，导致抑制率降低。除此之外，提取溶剂也对获得的正丁醇浸膏的真菌抑制活性产生显著影响。对比例3使用甲醇为提取溶剂，对比例4使用40％乙醇为提取溶剂，对比例5使用水为提取溶剂，对比例6使用无水乙醇为提取溶剂，获得的正丁醇相浸膏的真菌抑制活性较实施例1均有显著下降。使用不同溶剂获得的提取液中物质组成存在一定的差别，并且这些差别还影响到了后续萃取过程中的物质分配，最终导致正丁醇难以有效富集具有真菌抑制活性的成分。
[0074]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。