一种基于单倍体育种技术创制甜玉米DH系的方法

一种基于单倍体育种技术创制甜玉米dh系的方法
技术领域
1.本发明涉及玉米育种技术领域，更具体地说，它涉及一种基于单倍体育种技术创制甜玉米dh系的方法。


背景技术：

2.玉米自交系选育是优良杂交种选育的基础和关键。利用常规育种技术(杂交选育法、回交选育法、轮回选择法等)培育品质性状、农艺性状、抗病性、丰产性优异的甜玉米自交系至少需要6～8代,且耗费大量的人力、物力和财力。作为现代玉米育种的革命技术，单倍体育种可以快速、高效地固定玉米基因型，只需2～3代即可获得稳定优良的自交系，从而缩短了育种周期，提高了选择效率，加快了育种进程。
3.单倍体的产生有自然发生和人工诱导两种，但自然发生单倍体的频率极低，一般为十万分之一。目前，通常采用人工诱导的方法获得单倍体，主要方法有花药培养、物理或化学药剂诱导和孤雌生殖诱导等。但由于玉米花药培养效率低、基因型障碍大、染色体加倍困难，所以难以在玉米育种上得到较好应用。利用射线照射玉米花粉，再授粉诱导产生单倍体或利用秋水仙素(col)、二甲基亚砜(dmso)等化学药剂的单剂或组合剂处理雌穗诱发孤雌生殖都可以产生单倍体，但诱导率仅为0.096％～0.22％。
4.1956年，goe发现了玉米单倍体诱导系stock6，利用stock6杂交获得玉米单倍体，诱导率为2％～3％。随后的几十年，世界各国的育种家对其进行了杂交改良，选育出了一批诱导率高、农艺性状良好的诱导系，如德国霍恩海姆大学选育的uh600平均诱导率为10.2％，中国农业大学刘志增团队从stock6
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bho和uh400基础群体中选育出了平均诱导率为10.0％的农大高诱1号-农大高诱5号诱导系，华中农业大学选育出了平均诱导率为12.3％的hzi-1诱导系等。
5.目前，利用单倍体育种技术创制甜玉米dh系还鲜有公开报道，为了满足甜玉米育种的迫切需要，开展甜玉米dh系创制，以期加快甜玉米育种进程。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基于单倍体育种技术创制甜玉米dh系的方法，以“广良甜27号”为基础材料，在武汉地区秋季以“hzi-1诱导系”进行单倍体诱导，采用遗传标记法鉴别单倍体种子，用秋水仙素和二甲基亚砜进行加倍处理。
7.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于单倍体育种技术创制甜玉米dh系的方法，包括如下步骤：
8.s1：选取材料；选择进行创制甜玉米dh系的母本玉米系与父本玉米系进行杂交；
9.s2：单倍体诱导；种植母本玉米系与父本玉米系各若干株并进行诱导杂交，收获诱导后的杂交的果穗；对果穗进行烘干、脱粒后逐粒采用遗传标记法鉴别单倍体子粒；
10.s3：单倍体加倍；对经步骤s2鉴别出的单倍体子粒进行单倍体加倍；其单倍体加倍的方法为：
11.a.催芽；全部拟单倍体子粒采用常规方法进行浸种催芽并去除杂苗，获得芽苗；
12.b.加倍；单倍体子粒幼芽长到2cm左右时，用刀片削掉幼芽顶端露出一个小口，然后在秋水仙溶液中浸泡8～12h，再用清水冲洗0.5h，剔除药害损失的芽苗；
13.c.幼苗培养；将芽苗播种到育苗盘中并在光照培养室中培养，苗期去除杂株；
14.d.移栽；幼苗3～4叶时移栽到大田，田间管理措施同一般大田管理；
15.e.授粉；散粉、吐丝期，选取雌雄发育协调的植株进行单株套袋授粉；
16.f.采收；果穗外苞叶发黄、籽粒开始凹陷时开始采收，淘汰穗腐病、粒腐病严重的果穗，去除苞叶，利用烘箱及时烘干果穗；
17.g.考种；果穗烘干后及时进行单穗考种、编号和脱粒，调查穗形、穗长、穗粗、穗行、籽粒颜色，淘汰硬籽粒、霉烂籽粒。
18.本发明进一步设置为：所述步骤s1中，选取“广良甜27号”为母本、“hzi-1诱导系”为父本进行诱导杂交。
19.本发明进一步设置为：所述步骤s2中，采用遗传标记法鉴别单倍体子粒，紫色或无色粒顶、紫色胚芽尖的子粒为非单倍体子粒；紫色粒顶、无色胚芽尖的子粒为单倍体子粒。
20.本发明进一步设置为：所述步骤s2中，采用遗传标记法鉴别单倍体子粒，并计算单倍体诱导率，单倍体诱导率＝(单倍体子粒数/子粒总数)
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100％。
21.本发明进一步设置为：所述步骤s3中加倍过程中，秋水仙溶液的浓度为0.06％秋水仙素和2％dmso的混合液。
22.综上所述，本发明具有以下有益效果：证明了利用诱导系诱导甜玉米产生单倍体是可行的。用0.06％秋水仙素+2％二甲基亚砜进行浸芽处理，加倍有效率(植株散粉率)为32％，有效果穗率为71.88％。获得了类型丰富的甜玉米dh系。
附图说明
23.图1是本发明实施例中诱导杂交果穗结果示意图；
24.图2是本发明实施例中单倍体籽粒识别示意图；
25.图3是本发明实施例中单穗籽粒挑选情况示意图；
26.图4是本发明实施例中双单倍体果穗情况示意图。
具体实施方式
27.以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明。
28.实施例：一种基于单倍体育种技术创制甜玉米dh系的方法，如图1-4所示，s1：选取材料；选择进行创制甜玉米dh系的母本玉米系与父本玉米系进行杂交；
29.s2：单倍体诱导；种植母本玉米系与父本玉米系各若干株并进行诱导杂交，收获诱导后的杂交的果穗；对果穗进行烘干、脱粒后逐粒采用遗传标记法鉴别单倍体子粒；
30.s3：单倍体加倍；对经步骤s2鉴别出的单倍体子粒进行单倍体加倍；其单倍体加倍的方法为：
31.a.催芽；全部拟单倍体子粒采用常规方法进行浸种催芽并去除杂苗，获得芽苗；
32.b.加倍；单倍体子粒幼芽长到2cm左右时，用刀片削掉幼芽顶端露出一个小口，然后在秋水仙溶液中浸泡8～12h，再用清水冲洗0.5h，剔除药害损失的芽苗；
33.c.幼苗培养；将芽苗播种到育苗盘中并在光照培养室中培养，苗期去除杂株；
34.d.移栽；幼苗3～4叶时移栽到大田，田间管理措施同一般大田管理；
35.e.授粉；散粉、吐丝期，选取雌雄发育协调的植株进行单株套袋授粉；
36.f.采收；果穗外苞叶发黄、籽粒开始凹陷时开始采收，淘汰穗腐病、粒腐病严重的果穗，去除苞叶，利用烘箱及时烘干果穗；
37.g.考种；果穗烘干后及时进行单穗考种、编号和脱粒，调查穗形、穗长、穗粗、穗行、籽粒颜色，淘汰硬籽粒、霉烂籽粒。
38.本发明进一步设置为：步骤s1中，选取“广良甜27号”为母本、“hzi-1诱导系”为父本进行诱导杂交。
39.本发明进一步设置为：步骤s2中，采用遗传标记法鉴别单倍体子粒，紫色或无色粒顶、紫色胚芽尖的子粒为非单倍体子粒；紫色粒顶、无色胚芽尖的子粒为单倍体子粒。
40.本发明进一步设置为：步骤s2中，采用遗传标记法鉴别单倍体子粒，并计算单倍体诱导率，单倍体诱导率＝(单倍体子粒数/子粒总数)
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100％。
41.本发明进一步设置为：所述步骤s3中加倍过程中，秋水仙溶液的浓度为0.06％秋水仙素和2％dmso的混合液。
42.选取材料
43.选用“广良甜27号”和“hzi-1诱导系”为基础材料。诱导系带有籽粒navajo标记。
44.单倍体诱导
45.7月，在华中农业大学植物科学技术学院玉米试验基地种植“广良甜27号”群体400株和诱导系。9月中旬，以“广良甜27号”为母本、“hzi-1诱导系”为父本进行诱导杂交。收获诱导杂交果穗200穗，见图1诱导杂交果穗(左侧箭头指示处为正常诱导杂交果穗，杂交后标记色素显色明显；右侧箭头指示处为异常诱导杂交果穗，部分果穗自交)。不同的果穗结实性有差异。
46.果穗烘干、脱粒后逐粒采用遗传标记法鉴别单倍体子粒，见图2和图3，图2单倍体籽粒识别(蓝色圈标注处为拟单倍体籽粒)；紫色或无色粒顶、紫色胚芽尖的子粒为非单倍体子粒；紫色粒顶、无色胚芽尖的子粒为单倍体子粒。
47.单倍体诱导率＝(单倍体子粒数/子粒总数)
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100％。
48.进行单倍体加倍
49.a.催芽；全部拟单倍体种子采用常规方法进行浸种催芽并去除杂苗，获得3900株芽苗；
50.b.加倍；单倍体籽粒幼芽长到2cm左右时，用刀片削掉幼芽顶端露出一个小口，然后在秋水仙溶液(0.06％秋水仙素+2％dmso)中浸泡8～12h，再用清水冲洗0.5h，剔除药害损失的芽苗，剩余3510株；
51.c.幼苗培养；将芽苗播种到育苗盘中并在光照培养室中培养。苗期去除杂株，剩余幼苗3160株；
52.d.移栽；幼苗3～4叶时移栽到大田，每667
㎡
定植3600株。田间管理措施同一般大田管理；
53.e.授粉；散粉、吐丝期，选取雌雄发育协调的植株进行单株套袋授粉；
54.f.采收；果穗外苞叶发黄、籽粒开始凹陷时开始采收，淘汰穗腐病、粒腐病严重的
果穗，去除苞叶，利用烘箱及时烘干果穗；
55.g.考种；果穗烘干后及时进行单穗考种、编号和脱粒，调查穗形、穗长、穗粗、穗行、籽粒颜色，淘汰硬籽粒、霉烂籽粒，见图4。
56.种植了母本400株，仅收获200个杂交果穗，说明“广良甜27号”易被诱导出单倍体。
57.不同的果穗，单倍体诱导的效率有差异。经过人工脱粒、挑选，获得43280粒种子，其中拟单倍体种子5300粒，平均诱导率为12.24％。不同的果穗中，诱导率最高的为16.55％，最低的为8.74％。
58.由于种子发育不良，有4250粒种子发芽，发芽率仅有约80.2％。由于人为误差，在拟单倍体种子中不可避免混有非单倍体种子(约8.2％)，经过去杂，获得3900株芽苗进行秋水仙素处理，其中有约10％的芽苗产生了药害，获得3510株芽苗进行光照培养。培养阶段，进一步去杂、剔除约10％的紫色叶鞘幼苗，有3160株幼苗移栽到大田。由于在苗期遇到低温冻害和地老虎危害，再加上拔节期遇到极端降雨大风天气造成严重倒伏，最后剩下正常植株1440株，损失了约54.4％。
59.在抽雄、散粉期进行田间调查，有460株的雄穗可以正常散粉，加倍有效率约为32％，其中60株雌雄不协调，剩余的400株经人工授粉，40％能够正常结实，最终收获160个果穗。烘干、考种阶段，淘汰了25个因穗腐病或穗发芽的果穗以及20个种子数少于10粒的果穗，最终收获115个dh系(见表1)，有效果穗率为71.88％。
60.表1 dh系果穗性状
61.62.63.[0064][0065]
利用诱导系诱导甜玉米产生单倍体是可行的。在秋季用“广良甜27号”做母本，用以“hzi-1诱导系”进行诱导杂交。不同的单株果穗，单倍体诱导的效率有差异。本次平均诱导率为12.24％，其中诱导率最高的为16.55％，最低的为8.74％，二者相差7.19％。主要原因是与7d授粉期内的温度、湿度以及授粉时的花丝长度、花粉活力有关。采用遗传标记法鉴别单倍体种子会产生人为误差，导致单倍体种子中会混有自交二倍体或杂交二倍体种子，误差为8.2％。由于玉米单倍体的自然加倍频率在5％～10％，难以满足育种的要求，所以采取了人工加倍的方法。采用的加倍化学试剂主要是秋水仙素和除草剂类，本技术中用0.06％秋水仙素+2％二甲基亚砜进行浸芽处理，加倍有效率(植株散粉率)为32％，有效果穗率为71.88％，获得了类型丰富的115份dh系。
[0066]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。