棉花耐盐负调控基因GhFB15及应用

棉花耐盐负调控基因ghfb15及应用
技术领域
1.本发明涉及棉花耐盐基因研究技术领域，更具体地说是涉及ghfb15基因在植株耐盐中的应用、表达载体及引物。


背景技术：

2.盐害是沿海滩涂地区作物常见的非生物胁迫。为了加速盐碱地开发利用，就迫切需要能够适应高盐分生长的植物，并产生较好的经济效益，而棉花正是能够满足这种需要的特种经济作物。棉花耐盐性较强，是盐碱地的先锋作物。因缺乏高抗的陆地棉资源，棉花耐盐常规育种进展缓慢，不能满足生产的需求。
3.棉属种间的耐盐性差异比较大，刘国强等对棉花4个栽培种4078份品种资源的0.3％nacl耐盐性苗期鉴定表明，栽培品种的耐盐性异很大。其中非洲棉和海岛棉的耐盐性比陆地棉和亚洲棉突出很多。叶武威等利用0.4％盐量胁迫法对47份陆地棉资源进行了耐盐鉴定，结果显示相对耐盐成活苗率最高的可达76.15％，属抗盐级别，而最低的只有22.07％属于不耐级别。棉花品种间耐盐性差异可能与各自的起源、遗传背景有直接关系，因此，挖掘与棉花盐胁迫相关的功能基因对开展棉花抗逆分子育种具有重要意义。
4.因此，如何提供一种耐盐基因，并将该基因应用于棉花耐盐中是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明发现了一个棉花耐盐负调控基因ghfb15，通过对该基因结构分析、亚细胞定位、转基因及沉默该基因表达分析，得出了该负调控基因有潜力应用于基因编辑培育耐盐新品种，并且对棉花耐盐定向遗传改良有重要意义。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种生物材料，所述生物材料为降低ghfb15基因表达的核苷酸分子，所述核苷酸分子敲除ghfb15基因或降低ghfb15基因表达后，提高了棉花植株的耐盐性。
8.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种蛋白，所述蛋白包括如下1)-4)所示任意一种：
9.1)ghfb15蛋白，氨基酸序列如seq id no.1所示；
10.2)与seq id no.1所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；
11.3)与seq id no.1所示的蛋白质具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。
12.作为与上述技术方案优选的技术方案，本发明还请求保护编码上述1)-3)所述蛋白的编码基因。
13.作为上述技术方案优选的技术方案：所述编码基因为如下中至少一种：
14.1)seq id no.2所示的核苷酸序列；
15.2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求2所述蛋白质的dna分子；
16.3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码权利要求2所述蛋白质的核苷酸序列；
17.4)由seq id no.2所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；
18.5)由seq id no.2所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。
19.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护敲除上述1)-5)编码基因或降低所述基因表达在选育耐盐棉花品种中的应用。
20.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述1)-5)编码基因在制备非耐盐棉花实验材料中的应用。
21.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种克隆、鉴定ghfb15基因的引物，其特征在于，所示引物如seq id no.3～seq id no.4所示。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明筛选到一个棉花耐盐负调控基因，通过蛋白亚细胞定位分析、基因结构和蛋白结构分析，可知，该基因编码的蛋白主要在细胞核中，调控细胞核基因的表达，同时，该ghfb15蛋白由173个氨基酸组成，预测其分子量为19.77kda，等电点为8.31。ghfb15基因cds序列在232-339位含有一个f-box-like super family结构域。利用tmhmm及tmpred对ghfb15蛋白质进行跨膜结构分析，结果均未发现跨膜结构，表明ghfb15可能不是一个跨膜蛋白。通过signal ip5预测，该蛋白没有信号肽结构，说明ghfb15不是分泌蛋白。sopma分析结果表明ghfb15蛋白的二级结构无规则卷曲(random coil)氨基酸残基有95个，占54.91％，组成该蛋白的主体结构；α螺旋(alphahelix)包含47个氨基酸残基，占27.17％；延伸链(extended strand)包含28个氨基酸残基，占16.18％。进一步利用esypred3d web server对ghfb15三维结构预测，结果显示ghfb15三级结构组成与二级结构预测结构基本一致。
23.进一步，本发明通过将ghfb15基因转化至拟南芥中，并给予盐胁迫，观察拟南芥根长和生长状态，进一步验证该基因的存在，降低了植株耐盐胁迫的功能；同时，本发明利用plantcare(https://www.plantcare.co.uk/)网站，对ghfb15基因上游2000bp启动子序列中的顺式作用元件进行分析，其包含1个逆境胁迫诱导的tc-rich repeats，wrky结合的顺式作用元件wbox、茉莉酸、赤霉素等激素诱导的顺式作用元件以及多个光诱导的顺式作用元件，结果发现系列胁迫响应相关元件hse和tc－richrepeat。因此推测ghfb15基因的表达很可能受到逆境胁迫调控；在此基础上，本发明对4叶期棉花根部组织进行200mmol/l浓度nacl、ga、et、meja和aba处理，进一步得出ghfb15基因在棉花应答非生物物胁迫中起重要作用，尤其响应盐胁迫更为敏感，与棉花盐胁迫密切相关。
24.综上所述，本发明发现了负调控盐胁迫基因ghfb15有潜力应用于基因编辑培育耐盐新品种，并且对棉花耐盐定向遗传改良有重要意义
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。
26.图1附图为ghfb15蛋白的二级和三级结构预测图；
27.图2附图为ghfb15蛋白的亚细胞定位情况图；
28.图3附图为ghfb15基因荧光定量结果图；
29.图4附图为ghfb15基因在盐及激素诱导下的响应情况图；
30.图5附图为ghfb15基因转化至拟南芥中，对拟南芥生长状态影响图；
31.图6附图为沉默ghfb15基因对棉花生长状态影响图。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例中用到的试验材料
34.棉花种子播种至沙土中，待两片子叶完全展开后移栽至营养液中进行水培，培养条件28℃/光照培养16h，28℃暗培养8h，水培30d左右，棉苗4叶期进行组织(根、茎、叶)取样及分别进行盐(nacl，200mmol/l)、茉莉酸甲酯(meja，200μmol/l)、赤霉素(ga，200μmol/l)和乙烯利(eyh,200μmol/l)处理，并于0h、12h、24h和48h分别取幼苗根部，液氮速冻后保存至-80℃冰箱，用于rna的提取。另一部分棉花使用营养土种于营养钵中，培养条件同上，培养至子叶完全展开进行后续vigs试验。
35.ghfb15基因cdna克隆
36.根据本研究室前期筛选的棉花盐胁迫相关基因，设计特异性引物ghfb15-1f：atggaattagtaagccatacatcttcac，如seq id no.3所示；和ghfb15-1r：ttacaaaaacaattgtattgatatatctgcaagt，如seq id no.4所示以棉花叶片cdna为模板进行扩增。50μl反应体系，pcr程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃保温10min。pcr产物进行切胶回收，纯化后连接t3载体。连接产物转化到大肠杆菌top10进行蓝白斑筛选，将pcr鉴定的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证序列的准确性。
37.melvshtsslklkhdcmnekrgenlglgfvrythglrrkrigisneiddgtkasslkrqcskrtmiddddncyeksaleslpqdiiikiicgvdhedlnrlpivsksireaamvakqlhfaystptkvkafktsidfdeqsesndleleaqqwrshrsinkkkladisiqlfl*，如seq id no.1所示。
38.实施例1 ghfb15基因生物信息学分析
39.利用gsds(http://gsds.gao-lab.org/)制作ghfb15外显子和内含子结构示意图。利用ex pasy在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)棉花ghfb15蛋白序列进行分子量、理论等电点、疏水性等理化性质。psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk)和swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/interactive/ssmzbz/models/)分别预测蛋白质的二级和三级结构。结果见图1；ghfb15由173个氨基酸组成，预测其分子量为19.77kda，等电点为8.31。ghfb15cds序列在232-339位含有一个f-box-like super family结构域(图1a)。利用tmhmm及tmpred对ghfb15蛋白质进行跨膜结构分析，结果均未发现跨膜结构，表明
ghfb15可能不是一个跨膜蛋白。通过signal ip5预测，该蛋白没有信号肽结构，说明ghfb15不是分泌蛋白。sopma分析结果(图1b)表明ghfb15蛋白的二级结构无规则卷曲氨基酸残基有95个，占54.91％，组成该蛋白的主体结构；α螺旋(alpha helix)包含47个氨基酸残基，占27.17％；延伸链包含28个氨基酸残基，占16.18％。进一步利用esypred3d web server对ghfb15三维结构预测(图1c)，结果显示ghfb15三级结构组成与二级结构预测结构基本一致。通过在线软件prot comp(http://linux1.softberry.com)进行亚细胞定位预测结果显示ghfb15蛋白主要分布在细胞核中。
40.对ghfb15的蛋白在phytozome数据库中进行blast搜索，选取ghfb15蛋白序列相似度高的构建系统发育树，ghfb15与可可(thecc1eg029991t1)同源性相近，与玉米(zmphj40.05g090700.2.p)等同源性较小(图1d)。
41.利用plantcare(https://www.plantcare.co.uk/)网站，对ghfb15基因上游2000bp启动子序列中顺式元件进行分析，其包含1个逆境胁迫诱导的tc-rich repeats，wrky结合的顺式作用元件wbox、茉莉酸、脱落酸等激素诱导的顺式作用元件以及多个光诱导的顺式作用元件。结果发现系列胁迫响应相关元件hse和tc－richrepeats(表1)。因此推测ghfb15基因的表达很可能受到逆境胁迫调控。
42.表1 ghfb15基因上游调控区胁迫相关的启动子元件
[0043][0044]
实施例2细胞融合表达载体构建
[0045]
以引物ghfb15-f和ghfb15-r克隆去终止子且带有xbai和bamhi两个酶切位点的ghfb15基因。pcr反应条件为同上，回收得到的目的片段与细胞融合表达载体pcambia1305-egfp连接，连接产物转入top10感受态细胞进行筛选鉴定，获得细胞融合表达载pcambia1305-ghfb15-egfp。
[0046]
实施例3烟草表皮细胞的瞬时转化
[0047]
将构建pcambia1305-ghfb15-egfp载体转化农杆菌gv3101，将侵染48小时的叶片裁剪进行压片，在激光扫描显微镜下观察，分析棉花ghfb15蛋白的亚细胞定位情况(图2)。显微镜下烟草细胞的细胞核中均有荧光，说明ghfb15蛋白定位于植物细胞核中，与亚细胞定位预测结果一致。表明其可能通过调控细胞核基因的转录和翻译来发挥特定功能。
[0048]
实施例4棉花ghfb15基因的时空表达分析
[0049]
为了探明ghfb15基因在不同时期棉花组织中的表达差异，利用荧光定量pcr，通过sybr green染料法进行qpcr。利用2
－δδct
法计算ghfb15在不同处理下的相对表达量，进行表达模式分析。每个样品设3次生物学重复，每个pcr反应技术重复3次。
[0050]
定量引物序列：histone-f：agaagctgctatggttgcaaagc，如seq id no.5所示；
[0051]
histone-r：tgacctgtgtgaccgccatt，如seq id no.6所示；
[0052]
dlghfb15-f:agggctagggttcgtgagat，如seq id no.7所示；
[0053]
dlghfb15-r：actgcactgccttttcaacg，如seq id no.8所示.
[0054]
对苗期(4叶期)棉花根、茎、叶进行了表达量分析，荧光定量结果(图3)显示，ghfb15基因在棉花根、叶、茎中均表达，而且表达差异较大。以根部的表达量为对照，可以看出ghfb15基因在根中的表达量最高，约是茎部表达量的2倍，而ghfb15基因叶片中的表达量相对较低。说明ghfb15基因在棉花根中优势表达。根是植物吸收水分的器官，根部越发达更有利于逆境生存。
[0055]
实施例6
[0056]
为了进一步分析ghfb15基因在盐及激素诱导下的响应情况，采用实时荧光定量pcr检测了盐胁迫和激素(ga、eth、aba和meja)诱导下ghfb15基因的表达情况。对4叶期棉花根部组织进行200mmol/l浓度nacl、ga、et、meja和aba处理，对ghfb15基因表达量进行分析，结果显示ghfb15基因在棉花根部组织受nacl、ga、et、meja和aba诱导上调表达，其中，nacl诱导从0～72h呈先升高后下降的趋势，在24h时表达量达到最高，比对照高12倍以上；ga诱导后表达升高，但0.5-3h内变化不大，6h后表达量均显著高于对照4倍以上，meja诱导后表达量逐渐增加，在6h时降低后又升高。eth诱导后表达量先升高，1h降低，后又逐步升高24h达到最高(图4)。aba诱导处理后先上升在3小时显著下降在12小时达到高峰之后表达下降。由此推测ghfb15基因在棉花应答非生物物胁迫中起重要作用，尤其响应盐胁迫更为敏感，与棉花盐胁迫密切相关。
[0057]
实施例7拟南芥遗传转化
[0058]
采用蘸花法转化拟南芥，经抗生素和pcr筛选，获得稳定株系后，点播于浓度为150毫摩的nacl培养基上，观察并测定其根长，同时点播转ghfb15拟南芥、野生型于营养钵中，待叶片展开后进行200毫摩的盐溶液浇灌，25天后观察拟南芥生长状态，见图5。可知图a，c，d，e转基因拟南芥根长显著低于野生型，在150mm nacl培养基中拟南芥植株叶片出现白化，可推测，ghfb15基因降低植株的耐盐性，可能对植株的耐盐性具有负调控作用。
[0059]
实施例8棉花ghfb15基因沉默植株试验盐处理及生理指标的测定
[0060]
构建trv2-ghfb15载体，并利用vigs技术沉默ghfb15，过程为：
[0061]
使用sgn vigs tool设计基因的沉默片段：
[0062]
atggaattagtaagccatacatcttcactgaagttgaaacatgattgtatgaatgaaaaacgaggagaaaatttagggctagggttcgtgagatatacccatggattaaggaggaaaaggattgggatatcgaatgaaattgacgatgggaccaaagcttcatcgttgaaaaggcagtgcagtaagagaacgatgatcgatgatgatgataattgctatgaaaaatctgctctcgaatcacttccacaagatattattattaagattatttgtggtgtggatcatgaagatttgaaccggcttcctattgtttctaaatcaatcagagaagctgctatggttgcaaagcaattgcattttgcatatagtacaccaacaaaggtgaaagcttttaaaacatcaatagatttcgatgaacaaagtgaatcaaacgacttggaacttgaagctcaacaatggcggtcacacaggtcaatcaacaagaaaaaacttgcagatatatcaatacaattgtttttgtaa，如
seq id no.2所示。
[0063]
横线部分为沉默片段，构建到trv2载体上。
[0064]
通过定量结果显示vigs-ghfb15植株的ghfb15表达量显著降低。对trv2和vigs-ghfb15植株进行棉苗并进行200毫摩尔nacl浇灌处理，并取处理0、6、12、24h叶片测定pod、mda、pr等含量，见图6。可知，盐处理16天后对照组较沉默ghfb15转基因株系vigs-ghfb15叶色明显黄化，主根长度明显变短测定植株盐处理不同时间生理指标结果显示，对照组及沉默目的基因组mda/pr/pod含量动态变化趋势相近。mda含量1天后明显低于对照组，mda积累增多加剧对照组膜的损伤；试验前期沉默ghfb15植株pr含量高于对照后期基本一致，脯氨酸含量不足会增加细胞对渗透压的敏感度，并诱导ros的大量积累；pod活性低于对照组，叶片明显黄化，说明对照组植物组织相对老化。这些结果均说明vigs-ghfb15植株耐盐性高于对照。
[0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。