一种以玉米基栽培富虫草素的蛹虫草栽培方法与流程

1.本发明涉及真菌培养技术领域，具体涉及一种以玉米基栽培富虫草素的蛹虫草栽培方法。


背景技术：

2.蛹虫草是一种昆虫病原真菌，属于子囊菌纲。数百年来，它被广泛用作民间滋补食品和补药，其各种药理活性引起了广泛关注。蛹虫草产生多种活性成分，如腺苷、多糖和甘露醇。腺苷具有多种药理作用；它可作为慢性心力衰竭的心脏保护剂和治疗剂，还可抑制中枢神经系统中神经递质的释放。多糖被认为具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗转移、免疫调节、降血糖、类固醇生成和降血脂作用。甘露醇(虫草酸)具有利尿剂、抗自由基和镇咳活性等。蛹虫草中生物合成的虫草素是一种独特的核苷类似物，具有广泛的生物活性，包括免疫刺激、抗癌、抗病毒和抗感染活性。在自然界中，由于特定宿主的要求和严格的生长环境，野生蛹虫草非常稀少。因此，通过人工栽培蛹虫草获得虫草素是目前一个重要课题。
3.随着蛹虫草人工栽培技术的不断发展，用小麦、大米、蚕蛹等代用料为基质栽培蛹虫草也成功获得了子实体,并已经产业化大批量生产，并形成了一套代料基质培育蛹虫草的完整技术体系。但小麦、大米或蚕蛹作为栽培基质存在成本高的缺点，一定程度上制约虫草产业的进一步扩大生产。玉米的价格一般在3元/公斤，除了含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪、胡萝卜素外，还含有核黄素、维生素等营养物质，其中维生素含量非常高，是稻米、小麦的5～10倍。但是，目前将玉米作为栽培蛹虫草培养基主要基质的专利文献未见报道，其他文献研究中玉米仅仅作为碳源对照使用，且栽培效果差，得到的虫草素的含量普遍偏低。


技术实现要素：

4.针对目前虫草栽培培养基质成本高的缺陷，本发明以玉米为主要基质，并配套特定栽培工艺技术，提高了虫草栽培质量和虫草素含量，并能实现规模化、大批量蛹虫草栽培。
5.本发明的技术解决方案：
6.一种以玉米基栽培富虫草素的蛹虫草栽培方法，包括以下步骤：
7.步骤1、蛹虫草菌种活化
8.在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)斜面上培养原种，并挑取菌丝接种到pda斜面，并在18-23℃培养4-7d，然后再次接到含pda培养基的培养皿中，相同条件下培养。
9.步骤2、蛹虫草三角瓶液体菌种培养
10.待步骤1中菌丝长满培养基平面，用灭菌手术刀切出10-20mm2覆盖有菌丝的琼脂块，置于装80ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，在转速为160r/min旋转振动器上、15-23℃培养4-8d。培养液中均匀分布大量直径约2mm菌丝球，呈现深棕色，香味浓郁，表明已经培养好液体菌种。
11.步骤3、玉米基高虫草素含量蛹虫草栽培
12.(1)培养基配制及灭菌接种：向方形栽培盆(边长33cm，深度11cm)中装入玉米500-600g，再倒入700-1080ml营养液i，用0.05mm厚的聚丙烯塑料薄膜扎紧盆口，置于灭菌房中，当灭菌房温度升至80-90℃时，增大排气阀开口，排出冷空气，排气10min后，减小排气阀开口，温度升至100℃，维持8-10h；灭菌后，将灭菌车推至无菌降温室，冷却至室温；无菌环境下将用无菌水稀释10倍的步骤2培养的液体菌种40-50ml均匀接入栽培盆；接种后，在聚丙烯塑料薄膜中间切割1-6cm2通气孔，并覆盖无菌过滤膜，利于后期向栽培盆中补加水分、营养液及通气，并有效防止污染。
13.(2)菌丝培养：将上述接种后的栽培盆转移至发菌室中，黑暗培养至菌丝覆盖培养基表面。发菌过程采取变温培养，接种后第1-3d，培养温度16-18℃，环境湿度50％－60％；第3-6d，培养温度18-22℃，环境湿度65％-70％；第4d，向栽培盆中加入30-50ml营养液ii，栽培室每天通风机通风3次，菌丝培养总共时间5-7d。
14.(3)搔菌：上述菌丝长满培养基后，利用不锈钢搔菌耙在培养基表面行距分布均匀地刮出小沟。
15.(4)诱导菌丝转色：搔菌后，每天以散光照射栽培盆菌丝表面，每天光照时间18-24h，光照强度150-200lux，空气相对湿度70％-80％，温度16-20℃，诱导时间2-4d，通过光诱导促使菌丝转色。经过诱导后，栽培盆有黄色水珠聚集，培养基表面呈现橘黄色。
16.(5)诱导原基形成与分化：改变昼夜温差环境，刺激原基形成。将诱导条件设置为：白天温度19-23℃，夜晚温度14-18℃，空气相对湿度70％-80％，每天白光光照16-18h，光照强度200-300lux，诱导培养7-10d。经原基诱导，栽培盆表面有橘黄色圆丘状凸起。
17.(6)子实体生长：采取分阶段精细化控制技术优化子实体生长。上述原基分化后第1-10d，控制温度16-20℃，空气相对湿度70％-75％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度250-300lux，每天14-16h白光光照，8-10h黑暗，每8h栽培室通风1h；原基分化后第11-40d，每5d向培养盆中喷洒30-60ml营养液ii，控制温度18-22℃，空气相对湿度75％-80％，光照强度300-450lux，每天16-18h白光光照，8-6h黑暗，栽培室每11h通风1h；原基分化后第40-45d直至采收，控制温度22-25℃，空气相对湿度80％-90％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度450-600lux，每天14-16h白光光照，10-8h黑暗，栽培室每6h通风1h。
18.所述步骤1中，蛹虫草菌种为高产虫草素的蛹虫草菌株(cordyceps militaris)hycm12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号：cgmcc no.13179，保藏时间：2016年11月11日,上述保藏信息在专利号为2016112455100的发明专利中公开过。
19.所述步骤1中，pda培养基为：葡萄糖20g，土豆水煮浸出液200g，kh2po
4 0.1-0.2g，mgso4
·
7h2o 0.02-0.05g，补充去离子水至1000ml。
20.所述步骤2中液体种子培养基为：200ml 20％马铃薯浸提液、10-20g蔗糖、5-8g牛肉浸膏、4-8g玉米浆粉、3-5g蚕蛹粉、0.2-0.4g柠檬酸三铵、0.01-0.02g复合维生素b，0.2-0.5g kh2po4、0.2-0.5g(nh4)2s04、0.2-0.5g nan03、0.1-0.5g mgs04、0.01-0.05gfes04·
7h20、补充水至1000ml,ph值5.0-6.5，121℃灭菌20min。
21.优选的，所述步骤2中液体种子培养基为：200ml 20％马铃薯浸提液、15g蔗糖、6g牛肉浸膏、5g玉米浆粉、4g蚕蛹粉、0.3g柠檬酸三铵、0.01g复合维生素b，0.4g kh2po4、0.3g(nh4)2s04、0.2g nan03、0.1g mgs04、0.01g fes04·
7h20、补充水至1000ml,ph值6.0。
22.所述步骤3的培养基配制及灭菌接种过程中营养液i配方为：10-20g蔗糖、10-20g黄豆粉、0.4g mgso4、2-5g蚕蛹粉、0.2-0.5g kh2po4，0.2-0.5g znso4、0.3-0.5g mgso4、0.01-0.03gfeso4、0.01-0.03g mnso4、1000ml麸皮水解液。
23.优选的，所述步骤3的培养基配制及灭菌接种过程中营养液i配方为：15g蔗糖、10g黄豆粉、0.4g mgso4、5g蚕蛹粉、0.3g kh2po4，0.2g znso4、0.4g mgso4、0.02g feso4、0.02gmnso4、1000ml麸皮水解液。
24.所述麸皮水解液的制备过程为：将麸皮、水与盐酸按质量比5:25:1混合并装入水解锅，在0.1mpa蒸汽压力下水解1h，4层纱布过滤，并将滤液ph调到6.0-7.0，得到麸皮水解液。
25.所述步骤3菌丝培养过程中营养液ii配方：15-30g蔗糖、1-5g奶粉、6-10g蛋白胨、1-5g牛肉浸膏、10-20mg vb1、2-5g石膏、500ml麸皮水解液、500ml胡萝卜豆芽汁。
26.优选的，所述步骤3菌丝培养过程中营养液ii配方为：25g蔗糖、4g奶粉、7g蛋白胨、3g牛肉浸膏、20mg vb1、4g石膏、500ml麸皮水解液、500ml胡萝卜豆芽汁。
27.所述胡萝卜豆芽汁为新鲜胡萝卜和豆芽按照1:1配比，分别切碎后置于水煮锅中，加6倍体积去离子水，煮30min，四层纱布过滤取汁。
28.本发明的有益效果：
29.(1)本发明提供的蛹虫草栽培培养基，主要以玉米为主要基质，较现有栽培基质，显著降低了栽培成本，增加了经济效益，为蛹虫草的栽培开拓了新的可选择原料。
30.(2)经过高温灭菌后的玉米颗粒间保留了较大的空隙，有助于供应充足氧气，使菌丝快速生长。
31.(3)本发明的培植方法培植得到的蛹虫草子实体出草均匀，外形粗壮，鲜子实体生物转化率高达170％，干子实体虫草素含量高于17.5mg/g，保证了蛹虫草的高产量和高品质。
32.(4)发菌培养阶段，通过分阶段添加不同营养液和分阶段控制培养参数工艺，不仅有效减少了污染，也可以提高发菌速度和发菌质量。
33.(5)蛹虫草子实体生长阶段，基于蛹虫草生长规律和虫草素合成代谢调控机制，独创性的使用了栽培技术参数分阶段精细化控制工艺以及营养素追加工艺，栽培获得的蛹虫草子实体呈深黄色或橙色,外观品相好，虫草素、虫草多糖及类胡萝卜素等活性物质含量高。
附图说明
34.图1为蛹虫草菌种培养活化；
35.其中:a斜面培养活化，b培养皿培养活化。
36.图2为玉米基蛹虫草栽培菌丝生长情况；
37.图3为经搔菌后的原基分化栽培盆；
38.图4为玉米基蛹虫草栽培成熟子实体；
39.图5为不同基质和栽培工艺蛹虫草含量；
40.图6为不同基质和栽培工艺基质转化率；
41.图7为纯化虫草素hplc图谱；
42.其中：a虫草素标准样hplc图谱，b纯化样虫草素hplc图谱。
43.图8为蛹虫草子实体纯化虫草素傅里叶红外光谱扫描图谱。
具体实施方式
44.以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
45.实施例1(以玉米为基质栽培高虫草素含量蛹虫草)
46.步骤1蛹虫草菌种活化
47.本发明所用菌种为高产虫草素的蛹虫草菌株(cordyceps militaris)hycm12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号：cgmcc no.13179(保藏时间：2016年11月11日),上述保藏信息在专利号为2016112455100的发明专利中公开过。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)斜面上培养原种，并挑取菌丝接种到pda斜面，并在18-23℃培养4-7d，斜面培养情况如图1a所示，然后再次接到pda培养基中，相同条件下培养，培养情况如图1b所示。pda培养基：20g葡萄糖，200g土豆水煮浸出液，0.5g kh2po4，0.05g mgso4·
7h2o，补充去离子水至1000ml。
48.步骤2蛹虫草三角瓶液体菌种培养
49.待菌丝长满培养基平面，用灭菌手术刀切出约10mm2覆盖有菌丝的琼脂块，置于液体种子培养基中。250ml三角瓶装80ml液体种子培养基，在旋转振动器上160r/min、15-23℃培养4-8d。培养液中均匀分布大量直径约2mm菌丝球，呈现深棕色，香味浓郁，表明已经培养好液体菌种。
50.液体种子培养基：200ml 20％马铃薯浸提液、15g蔗糖、6g牛肉浸膏、5g玉米浆粉、4g蚕蛹粉、0.3g柠檬酸三铵、0.01g复合维生素b，0.4g kh2po4、0.3g(nh4)2s04、0.2gnan03、0.1g mgs04、0.01g fes04·
7h20、补充水至1000ml,ph值6.0，121℃灭菌20min。
51.步骤3、玉米基高虫草素含量蛹虫草栽培
52.(1)培养基配制及灭菌接种：向边长33cm，深度11cm的方形栽培盆中装入玉米500-600g，再倒入700-1080ml营养液i，用0.05mm厚的聚丙烯塑料薄膜扎紧盆口，置于灭菌房中，当灭菌房温度升至80-90℃时，增大排气阀开口，排出冷空气，排气10min后，减小排气阀开口，温度升至100℃，维持8-10h，灭菌后，将灭菌车推至无菌降温室，冷却至室温。无菌环境下将用无菌水稀释10倍的液体菌种40-50ml均匀接入栽培盆。接种后，在聚丙烯塑料薄膜中间切割1-6cm2通气孔，并覆盖无菌过滤膜，利于后期向培养盆中补加水分、营养液及通气，并有效防止污染。
53.营养液i配方：15g蔗糖、10g黄豆粉、0.4g mgso4、5g蚕蛹粉、0.3g kh2po4，0.2g znso4、0.4g mgso4、0.02g feso4、0.02g mnso4、1000ml麸皮水解液。
54.麸皮水解液的制备：将麸皮、水与盐酸按质量比5:25:1混合并装入水解锅，在0.1mpa蒸汽压力下水解1h，4层纱布过滤，并将滤液ph调到6.0-7.0，得到麸皮水解液。
55.(2)菌丝培养：接种后的栽培盆转移至发菌室中，黑暗培养至菌丝覆盖培养基表面。发菌过程采取变温培养，接种后第1-3d，温度16-18℃，环境湿度50％－60％；第3-6d温度18-22℃，环境湿度65％-70％，第4d，向栽培盆中加入30-50ml营养液ii。栽培室每天通风机通风3次。菌丝培养总共时间约5-7d，菌丝生长情况如图2所示。
56.营养液ii配方：25g蔗糖、4g奶粉、7g蛋白胨、3g牛肉浸膏、20mg vb1、4g石膏、500ml
麸皮水解液、500ml胡萝卜豆芽汁。
57.胡萝卜豆芽汁：新鲜胡萝卜和豆芽按照1:1配比，分别切碎后置于水煮锅中，加6倍体积去离子水，煮30min，四层纱布过滤取汁。
58.(3)搔菌：菌丝长满培养基后，利用不锈钢搔菌耙在培养基表面行距分布均匀地刮出小沟。经搔菌后的栽培盆如图3所示。
59.(4)诱导菌丝转色：搔菌后，每天以散光照射培养盆菌丝表面，每天光照时间18-24h，光照强度150-200lux，空气相对湿度70％-80％，温度16-20℃，诱导时间2-4d。通过光诱导促使菌丝转色。经过诱导后，栽培盆有黄色水珠聚集，培养基表面呈现橘黄色。
60.(5)诱导原基形成与分化：改变昼夜温差环境，刺激原基形成。将诱导条件设置为：白天温度19-23℃，夜晚温度14-18℃，空气相对湿度70％-80％，每天白光光照16-18h，光照强度200-300lux，诱导培养7-10d。经原基诱导，栽培盆表面有橘黄色圆丘状凸起，如图4所示。
61.(6)子实体生长：采取分阶段精细化控制技术优化子实体生长。原基分化后第1-10d，控制温度16-20℃，空气相对湿度70％-75％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度250-300lux，每天14-16h白光光照，8-10h黑暗，每8h栽培室通风1h；原基分化后第11-40d，每5d向培养盆中喷洒30-60ml营养液ii，控制温度18-22℃，空气相对湿度75％-80％，光照强度300-450lux，每天16-18h白光光照，8-6h黑暗，栽培室每11h通风1h；原基分化后第40-45d直至采收，控制温度22-25℃，空气相对湿度80％-90％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度450-600lux，每天14-16h白光光照，10-8h黑暗，栽培室每6h通风1h。采用本技术，菌丝长势很旺盛、出草最快、生长周期最短、蛹虫草产量高、品相好，如图5所示。经hplc测定，经烘干后的蛹虫草子实体中虫草素含量为17.5mg/g，新鲜蛹虫草子实体生物转化率为170％。
62.实施例2(以玉米为基质栽培蛹虫草)
63.本实例在菌体培养及子实体生长阶段采用恒定控制参数，并不再不加营养液。主要目的是同实施例1中的分阶段精细化栽培工艺及补料工艺相对照。
64.步骤1蛹虫草菌种活化
65.同实施例1中的步骤1。
66.步骤2蛹虫草三角瓶液体菌种
67.同实施例1中的步骤2。
68.步骤3、玉米基蛹虫草栽培
69.(1)培养基配制及灭菌接种：
70.同实施例1中的步骤3(1)。
71.(2)菌丝培养：接种后的栽培盆转移至发菌室中，黑暗培养至菌丝覆盖培养基表面。发菌过程采取恒温培养，温度18-20℃，环境湿度50％－60％。菌丝培养过程不再补加营养液ii。
72.(3)搔菌：
73.同实施例1中的步骤3(3)。
74.(4)诱导菌丝转色：
75.同实施例1中的步骤3(4)。
76.(5)诱导原基形成与分化：
77.同实施例1中的步骤3(5)。
78.(6)子实体生长：子实体生长阶段控制温度20-22℃，空气相对湿度70％-75％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度250-300lux，每天14-16h白光光照，8-10h黑暗，每8h栽培室通风1h。生长期结束后，子实体生长纤细，子实体密度低，产量低，色泽较浅。鲜蛹虫草子实体生物转化率约120％。经hplc测定，经烘干后的蛹虫草子实体中虫草素含量为11mg/g。
79.实施例3(以小麦为基质栽培蛹虫草)
80.本实例以小麦为主要基料，并在菌体培养及子实体生长阶段采用恒定控制参数，并不再追加营养液。主要目的是同实施例1中的分阶段精细化栽培工艺、补料工艺以及玉米基料相对照。
81.步骤1蛹虫草菌种活化
82.同实施例1中的步骤1。
83.步骤2蛹虫草三角瓶液体菌种
84.同实施例1中的步骤2。
85.步骤3、小麦基蛹虫草栽培
86.(1)培养基配制及灭菌接种：
87.同实施例1中的步骤3(1)。
88.(2)菌丝培养：接种后的栽培盆转移至发菌室中，黑暗培养至菌丝覆盖培养基表面。发菌过程采取恒温培养，温度18-20℃，环境湿度50％－60％。菌丝培养过程不再补加营养液ii
89.(3)搔菌：
90.同实施例1中的步骤3(3)。
91.(4)诱导菌丝转色：
92.同实施例1中的步骤3(4)。
93.(5)诱导原基形成与分化：
94.同实施例1中的步骤3(5)。
95.(6)子实体生长：子实体生长阶段控制温度20-22℃，空气相对湿度70％-75％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度250-300lux，每天14-16h白光光照，8-10h黑暗，每8h栽培室通风1h。生长期结束后，子实体生长纤细，子实体密度低，产量低，色泽较浅。鲜蛹虫草子实体生物转化率约131％。经hplc测定，经烘干后的蛹虫草子实体中虫草素含量为8.5mg/g。
96.实施例4(以大米为基质栽培蛹虫草)
97.本实例以大米为主要基料，并在菌体培养及子实体生长阶段采用恒定控制参数，并不再追加营养液。主要目的是同实施例1中的分阶段精细化栽培工艺、补料工艺以及玉米基料相对照。
98.步骤1蛹虫草菌种活化
99.同实施例1中的步骤1。
100.步骤2蛹虫草三角瓶液体菌种
101.同实施例1中的步骤2。
102.步骤3、大米基蛹虫草栽培
103.(1)培养基配制及灭菌接种：
104.同实施例1中的步骤3(1)。
105.(2)菌丝培养：接种后的栽培盆转移至发菌室中，黑暗培养至菌丝覆盖培养基表面。发菌过程采取恒温培养，温度18-20℃，环境湿度50％－60％。菌丝培养过程不再补加营养液ii
106.(3)搔菌：
107.同实施例1中的步骤3(3)。
108.(4)诱导菌丝转色：
109.同实施例1中的步骤3(4)。
110.(5)诱导原基形成与分化：
111.同实施例1中的步骤3(5)。
112.(6)子实体生长：子实体生长阶段控制温度20-22℃，空气相对湿度70％-75％，二氧化碳体积分数小于0.1％，光照强度250-300lux，每天14-16h白光光照，8-10h黑暗，每8h栽培室通风1h。生长期结束后，子实体生长纤细，子实体密度低，产量低，色泽较浅。鲜蛹虫草子实体生物转化率约140％。经hplc测定，经烘干后的蛹虫草子实体中虫草素含量为7.2mg/g。
113.对比不同栽培基质和栽培工艺科研看出，以玉米为主要栽培基质，并通过分阶段精细化栽培工艺控制，虫草素含量最高，达到17.5mg/g，对比结果如图5所示；以玉米为主要栽培基质，并通过分阶段精细化栽培工艺控制，其转化率也最高，为170％，对比结果如图6所示。
114.实施例5(虫草素的分离纯化及鉴定)
115.1、蛹虫草子实体虫草素的提取
116.以经过50℃烘干过得蛹虫草为测试样品，通过高速粉碎机将蛹虫草子实体粉碎，过50目筛，按照1:10的料液比加入去离子水，温度50-60℃，超声波功率100-200w，提取时间20-40min。12000r/min,离心10min，收集上清，滤渣再次如上加入去离子水超声波浸提。两次上清液合并。
117.子实体中虫草素含量的测定：蛹虫草子实体中虫草素的含量的检测需采用高效液相色谱法，具体如下：流动相：乙腈和去离子水(5/95，v/v)；流动相流动速率，1.0ml/min；柱温25℃，虫草素的检测和量化均为紫外波长260nm。
118.标准品溶液的配置：称取虫草素标准品10mg，溶解于去离子水中，容量瓶定容至100ml。分装至1.5ml离心管中，4℃冰箱保存备用。
119.2、蛹虫草虫草素的纯化
120.分别大孔树脂用无水乙醇浸泡过夜，弃去悬浮物，用大量蒸馏水洗至无醇，备用。称取200g事先预处理好的大孔树脂于烧杯中，加入虫草粗体液2000ml，充分混勻，加磁力搅拌器处理过夜，吸附虫草素后的树脂用蒸馏水清洗3次后，加入70％浓度的乙醇溶液解吸附2h。，收集上清液用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，获得虫草素的浸膏液。将虫草素溶于去离子水中，上样于大孔树脂层析柱，去离子水洗涤3个柱体积后，以30-80％的乙醇溶液梯度洗
脱，hplc检测各个收集管。乙醇浓度72.5％的收集管hplc检测情况如图7所示，检测样品同标准样层析图谱看出，出峰时间相同，推测纯化到了虫草素。
121.3、傅里叶红外光谱(ft-ir)鉴定虫草素
122.红外光谱法常用于物质结构分析、定性鉴别及定量分析，其原理是物质分子内部化学键或官能团发生震动吸收，频率不同会导致在红外光谱上的位置不同，从而推测物质的组成基团和分子结构。整个红外谱图可以分为两个区，4000
–
1350cm-1
区是由伸缩振动所产生的吸收带，光谱比较简单但具有强烈的特征性，1350
–
650cm-1
处指纹区，光谱复杂吸收峰较弱。本发明纯化的虫草素如图8所示，根据文献报道虫草素的红外光谱特征分析，3416.25cm-1
为虫草素的-nh2伸缩振动峰，3319.26cm-1
为虫草素-oh伸缩振动峰，2921.48cm-1
为-ch、-ch2的出峰伸缩振动峰，1676.21cm-1
左右处为官能团五元环出的峰，1495.26cm-1
为苯环和氮杂环的骨架振动峰,1339.95cm-1
为-oh伯醇指纹峰，1114.75cm-1
为-o-脂肪醚键特征指纹峰。本发明提取的虫草素具备标准品虫草素的典型吸收峰谱特征，均符合虫草素分子结构，进一步证明了纯化得到了虫草素。