一种棉花短周期培育方法

1.本发明涉及棉花培育技术领域，具体的，涉及一种棉花短周期培育方法。


背景技术：

2.棉花是世界上最重要的天然纤维作物，在人类的衣食活动中具有无可替代的地位，随着纺纱技术的不断改进和人们生活水平的提高，对棉花纤维品质尤其是纤维强度提出了更高的要求。棉花是我国的第一大经济作物，在国民经济中占有很重要的地位，棉纤维是一种重要的纺织原料，棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油料和蛋白质资源。随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，对棉花的需求日益增加。
3.植物组织培养技术是在无菌条件下，将外植体培养在培养基中，提供培养条件，使其成为完成植株的过程。因此，这项技术可为植物遗传转化提供丰富的受体材料。组织培养广泛应用于快繁、人工种子、新物种培养等领域，作为植物基础基因工程研究的基本途径和重要手段，在植物基因工程改良领域发挥着不可替代的作用。
4.棉花组织培养植株再生主要是以诱导胚状体出现为主，棉花的胚状体发生是从无菌苗的胚根、子叶、下胚轴或原生质体经过诱导愈伤组织、愈伤组织分化、体细胞胚胎发育而生成再生植株的过程。胚体愈伤的生理状态相对比较一致，所以能为研究提供稳定的材料来源。但是，在愈伤组织的培育中不可避免的会出现畸形苗，由于畸形苗个体发育不良，很难生长为健壮幼苗，因此通常会在观察到有畸形苗产生的时候，就会将畸形苗挑拣出来扔掉。由于畸形苗的产生，导致了愈伤组织存在成苗率低的问题，并且在论文《棉花体细胞胚胎发生机制研究及p53基因的遗传转化》中通过培养畸形苗获得了再生苗，但未写明具体的技术方案和培养条件及时间。


技术实现要素：

5.本发明提出一种棉花短周期培育方法，解决了相关技术中愈伤组织成苗率低问题。
6.本发明的技术方案如下：一种棉花短周期培育方法，包括以下步骤：
7.步骤a、取样：将棉花培育过程中产生的畸形苗挑选出来作为样品，如图2-a所示；
8.步骤b、诱导胚性愈伤组织：将畸形苗放入到胚成熟培养基进行诱导培养生长，培养1-2个月直至40-60％的畸形苗长出胚性愈伤组织，如图2-b所示，室内温度控制在25-28℃，室内湿度控制在45-60％，室内光照时间为12-14h；
9.步骤c、培育胚状体：将挑选出的胚性愈伤组织放入棉花幼胚培养基上培养1-2个月，然后转入胚成熟培养基进行培养生长，直至80％左右的胚性愈伤组织都发育成胚状体，如图2-c所示；
10.步骤d、培育正常植株：在步骤c上对胚状体继续培养2-3个月，直至25-35％的胚状体长成正常植株，如图2-d所示；
11.步骤e、将步骤d中带有绿芽的畸形苗挑选出来与常规培育的畸形苗混合并重复步
骤a、步骤b、步骤c和步骤d。
12.作为进一步的技术方案，所述棉花幼胚培养基包括以下重量份组分：825份硝酸铵、950份硝酸钾、95份硫酸镁、85份磷酸二氢钾、165份氯化钙、6.2份硼酸、16.9份一水合硫酸锰、8.6份七水合硫酸锌、0.025份六水合氯化钴、0.025份五水合硫酸铜、0.83份碘化钾、0.25份二水合钼酸钠、13.9份七水合硫酸亚铁、37.26份na2edta、10份硫胺素、1份盐酸吡哆醇、1份烟酸、1份甘氨酸、50份肌醇、20份脯氨酸、500份谷氨酰胺、20000份蔗糖、2500份phytagel、0.1份iba、0.1份kt、0.1份6-ba。
13.作为进一步的技术方案，所述胚成熟培养基包括以下重量份组分：3800份硝酸钾、190份硫酸镁、170份磷酸二氢钾、330份氯化钙、6.2份硼酸、16.9份一水合硫酸锰、8.6份七水合硫酸锌、0.025份六水合氯化钴、0.025份五水合硫酸铜、0.83份碘化钾、0.25份二水合钼酸钠、13.9份七水合硫酸亚铁、37.26份na2edta、10份硫胺素、1份盐酸吡哆醇、1份烟酸、1份甘氨酸、50份肌醇、500份谷氨酰胺、500份天冬酰胺、30000份葡萄糖、2600份phytagel、0.3～0.5份iba、0.1～0.15份kt。
14.本发明的有益效果为：
15.1、将棉花培育过程中产生的畸形苗应用于本发明提供的培育方法中，由于能将一部分畸形苗培育成正常苗，因此，降低了实验室在棉花幼苗方面的成本；
16.2、畸形苗经过本发明中的方法发育成愈伤组织，然后再经过培育发育成正常植株，大大缩短了棉花整个培育周期，避开了棉花从种子发育到愈伤组织的阶段，进而缩短了本发明的培育方法中提到的正常植株的生长周期，能为实验室在短期内提供大量的正常植株；
17.3、本发明提供的培育方法可以将自身方法中产生的畸形苗进行重复利用，也进一步降低了常规培育方法中的畸形苗用量，能对畸形苗进行一轮筛选，确保每个畸形苗都可以得到充足的发育成正常植株。
18.本发明还由此方法为借鉴，在通过农杆菌侵染下胚轴进行遗传转化获得转基因过表达再生植株的过程中，利用此方法可成倍增加转基因再生植株的数量。由此方法为借鉴，在通过农杆菌侵染下胚轴进行遗传转化获得基因编辑或rnai再生植株的过程中，利用此方法可成倍增加基因编辑或rnai植株的数量。对于棉花转化周期长的特点，获得过表达和基因编辑再生植株数量的增加尤为重要。
附图说明
19.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
20.图1为本发明提供的棉花常规培育方法中各个阶段的结构示意图；
21.图2为本发明提供一种棉花短周期培训方法中各个阶段的结构示意图；
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
23.实施例1
24.本实施例提出了一种棉花短周期培育方法，包括以下步骤：
25.步骤a、取样：将棉花培育过程中产生的畸形苗挑选出来作为样品，如图2-a所示；
26.步骤b、诱导胚性愈伤组织：将畸形苗放入到胚成熟培养基进行诱导培养生长，培养1-2个月直至40-60％的畸形苗长出胚性愈伤组织，如图2-b所示，室内温度控制在25-28℃，室内湿度控制在45-60％，室内光照时间为12-14h；
27.步骤c、培育胚状体：将挑选出的胚性愈伤组织放入棉花幼胚培养基上培养1-2个月，然后转入胚成熟培养基进行培养生长，直至80％左右的胚性愈伤组织都发育成胚状体，如图2-c所示；
28.步骤d、培育正常植株：在步骤c上对胚状体继续培养2-3个月，直至25-35％的胚状体长成正常植株，如图2-d所示；
29.步骤e、将步骤d中带有绿芽的畸形苗挑选出来与常规培育的畸形苗混合并重复步骤a、步骤b、步骤c和步骤d。
30.对比例1
31.本对比例提出了一种棉花短周期培育方法，包括以下步骤：
32.步骤a、取样：将棉花培育过程中产生的畸形苗挑选出来作为样品；
33.步骤b、诱导胚性愈伤组织：将畸形苗放入到胚成熟培养基进行诱导培养生长，培养1-2个月直至40-60％的畸形苗长出胚性愈伤组织，室内温度控制在25-28℃，室内湿度控制在45-60％，室内光照时间为3-4h；
34.步骤c、培育胚状体：将挑选出的胚性愈伤组织放入棉花幼胚培养基上培养1-2个月，然后转入胚成熟培养基进行培养生长，直至80％左右的胚性愈伤组织都发育成胚状体；
35.步骤d、培育正常植株：在步骤c上对胚状体继续培养2-3个月，直至25-35％的胚状体长成正常植株；
36.步骤e、将步骤d中带有绿芽的畸形苗挑选出来与常规培育的畸形苗混合并重复步骤a、步骤b、步骤c和步骤d。
37.对比例2
38.本对比例提出了一种棉花短周期培育方法，包括以下步骤：
39.步骤a、取样：将棉花培育过程中产生的畸形苗挑选出来作为样品；
40.步骤b、诱导胚性愈伤组织：将畸形苗放入到胚成熟培养基进行诱导培养生长，培养1-2个月直至40-60％的畸形苗长出胚性愈伤组织，室内温度控制在25-28℃，室内湿度控制在70-80％，室内光照时间为12-14h；
41.步骤c、培育胚状体：将挑选出的胚性愈伤组织放入棉花幼胚培养基上培养1-2个月，然后转入胚成熟培养基进行培养生长，直至80％左右的胚性愈伤组织都发育成胚状体；
42.步骤d、培育正常植株：在步骤c上对胚状体继续培养2-3个月，直至25-35％的胚状体长成正常植株；
43.步骤e、将步骤d中带有绿芽的畸形苗挑选出来与常规培育的畸形苗混合并重复步骤a、步骤b、步骤c和步骤d。
44.对比例3
45.本对比例提出了一种棉花短周期培育方法，包括以下步骤：
46.步骤a、取样：将棉花培育过程中产生的畸形苗挑选出来作为样品；
47.步骤b、诱导胚性愈伤组织：将畸形苗放入到胚成熟培养基进行诱导培养生长，培养1-2个月直至40-60％的畸形苗长出胚性愈伤组织，室内温度控制在20-22℃，室内湿度控制在45-60％，室内光照时间为12-14h；
48.步骤c、培育胚状体：将挑选出的胚性愈伤组织放入棉花幼胚培养基上培养1-2个月，然后转入胚成熟培养基进行培养生长，直至80％左右的胚性愈伤组织都发育成胚状体；
49.步骤d、培育正常植株：在步骤c上对胚状体继续培养2-3个月，直至25-35％的胚状体长成正常植株；
50.步骤e、将步骤d中带有绿芽的畸形苗挑选出来与常规培育的畸形苗混合并重复步骤a、步骤b、步骤c和步骤d。
51.在实施例1、对比例1、对比例2和对比例3中随机选择10株步骤d中的正常植株，并依次标号为1-1、1-2直至4-10，然后测量植株的茎长和真叶的叶面积并记录，最终形成表一和表二：
52.表一：
53.序号茎长(cm)序号茎长(cm)序号茎长(cm)序号茎长(cm)1-17.52-14.33-14.94-14.21-28.22-24.23-24.74-24.11-38.12-33.93-35.14-33.31-47.92-44.13-44.74-43.41-58.32-53.73-55.24-53.51-68.22-63.83-65.14-63.91-77.62-73.93-75.34-74.31-87.92-84.03-85.14-83.41-97.72-94.13-94.84-94.01-107.82-103.83-104.64-104.1
54.从表一可以看出，实施例1培养出的正常植株的茎长要大于对比例1、对比例2和对比例3的茎长，这就表明实施例1提供的方法能提高畸形苗发育成正常植株的成功率。
55.表二：
[0056][0057]
从表二可以看出，实施例1培养出的正常植株的的真叶叶面积要大于对比例1、对比例2和对比例3的真叶叶面积，这也就表明实施例1提供的方法能使畸形苗发育成的正常植株更具有活力，也相对更容易生存下来，更符合对棉花的短周期的培育构思。
[0058]
图2是畸形苗使用本发明提供的方法从畸形苗发育成正常植株的过程。其中，(a)表示褐色的畸形苗在胚成熟培养基中的状态，(b)表示畸形苗长出黄绿色、颗粒状的胚性愈伤组织的状态，(c)表示胚性愈伤组织发育成类似胚胎的胚状体的状态，(d)表示胚状体发育成正常植株的状态。
[0059]
图1是棉花在常规培育方法中的各个阶段。其中，棉花的常规培育方法为：种植无菌苗(a)生长5-6天，将下胚轴切段置于愈伤诱导培养基一上(b)，1个月后转到愈伤诱导培养基二上，4-5个月20％左右的下胚轴长出胚性愈伤组织(c)，将胚性愈伤组织置于胚成熟培养基上，2-3个月80％左右的胚性愈伤组织长出胚状体(d)，2-3个月30％左右的胚状体能够长成正常植株(e)。
[0060]
进一步，所述愈伤诱导培养基一包括以下重量份组分：1650份硝酸铵、1900份硝酸钾、190份硫酸镁、170份磷酸二氢钾、330份氯化钙、6.2份硼酸、16.9份一水合硫酸锰、8.6份七水合硫酸锌、0.025份六水合氯化钴、0.025份五水合硫酸铜、0.83份碘化钾、0.25份二水合钼酸钠、13.9份七水合硫酸亚铁、37.26份na2edta、10份硫胺素、1份盐酸吡哆醇、1份烟酸、1份甘氨酸、50份肌醇、500份谷氨酰胺、500份天冬酰胺、30000份葡萄糖、2600份phytagel、0.1份2,4-d、0.1份kt。
[0061]
进一步，所述愈伤诱导培养基二包括以下重量份组分：1650份硝酸铵、1900份硝酸钾、190份硫酸镁、170份磷酸二氢钾、330份氯化钙、6.2份硼酸、16.9份一水合硫酸锰、8.6份七水合硫酸锌、0.025份六水合氯化钴、0.025份五水合硫酸铜、0.83份碘化钾、0.25份二水合钼酸钠、13.9份七水合硫酸亚铁、37.26份na2edta、10份硫胺素、1份盐酸吡哆醇、1份烟酸、1份甘氨酸、50份肌醇、500份谷氨酰胺、500份天冬酰胺、30000份葡萄糖、2600份phytagel、0.5份iba、0.1份kt。
[0062]
进一步，所述胚成熟培养基包括以下重量份组分：3800份硝酸钾、190份硫酸镁、
170份磷酸二氢钾、330份氯化钙、6.2份硼酸、16.9份一水合硫酸锰、8.6份七水合硫酸锌、0.025份六水合氯化钴、0.025份五水合硫酸铜、0.83份碘化钾、0.25份二水合钼酸钠、13.9份七水合硫酸亚铁、37.26份na2edta、10份硫胺素、1份盐酸吡哆醇、1份烟酸、1份甘氨酸、50份肌醇、500份谷氨酰胺、500份天冬酰胺、30000份葡萄糖、2600份phytagel、0.1～0.5份iba、0.1～0.15份kt。
[0063]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。