一种高效生产全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法与流程

本发明属于全雄黄姑鱼三倍体诱导，具体涉及一种高效生产全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法。

背景技术：

1、人工诱导鱼类染色体三倍体化和性别控制可以改变相应的生物学性状，如生长速率、雌雄性别、性腺发育等，是鱼类遗传改良的重要技术手段。尤其是在一些具有性二态生长的鱼类中，染色体三倍体化和性别控制技术的联合使用能够进一步加速生长等性能的提升，提高养殖效益。目前，这两项技术在莫桑比克尼罗非鱼和虹鳟等鱼类中已经得到了应用。通过对生长性能进行分析，研究表明对具有性二态的鱼类进行三倍体化和性别控制能够显著提高它们养殖效益。因此，在鱼类养殖中，为了获得较高的养殖效益，可以对各类具有性二态生长等特征的鱼类展开三倍体化和性别控制的研究和应用。此外，三倍体鱼类性腺表现为不育特征，是生殖细胞移植操作中的理想受体，因此，人为诱导鱼类三倍体在生殖细胞移植中也具有重要的应用价值。同时，目前移植受体主要以仔鱼和幼鱼为主，但是在这个时期无法从外部形态分辨雌雄，且在移植后，所产生供体后代的性别是由受体的性别决定，因此，为了准确获得预期性别的子代也需要进一步对三倍体受体进行性别控制。

2、黄姑鱼具有典型的性二态性生长特征，雌鱼生长速率显著高于雄鱼。因此，黄姑鱼的三倍体化和性别控制不仅在黄姑鱼的养殖生产中具有潜在的经济效益，而且在石首鱼类的生殖细胞移植、基因编辑育种等研究中也具有重要的应用价值。本方法建立了全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法，为黄姑鱼等石首科鱼类的性别控制育种和多倍体育种开辟了新途径，同时，该方法也可以推广到其它鱼类中，促进海水鱼类的三倍体育种和性别控制研究与应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种诱导三倍体成功率高的、效果好的高效生产全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种高效生产全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法，包括：对性成熟的伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼进行营养调控和光温调控，取精取卵；人工授精获得受精卵，并浸于海水中处理后进行孵化培育，最后再进行全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育；受精卵浸入3-12℃的海水中处理5-20min，然后在13-16℃海水过渡3-10min，最后放入20-25℃海水中孵化培育；诱导培育中使用含有芳香化酶抑制剂来曲唑的配合饲料。

4、优选地，处理受精卵的海水中含有嘌呤衍生物。

5、更优选地，嘌呤衍生物为甲氧基嘌呤酯或甲氧基嘌呤异羟肟酸；甲氧基嘌呤酯由6-甲氧基嘌呤与2-溴乙酸乙酯反应制备；甲氧基嘌呤异羟肟酸由甲氧基嘌呤酯与盐酸羟胺反应制备。

6、进一步优选地，甲氧基嘌呤酯的制备中，将6-甲氧基嘌呤加入dmf中，加入碳酸钾，加入2-溴乙酸乙酯，在20-40℃下反应8-24h，反应完成后调节ph至中性，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，硫酸镁干燥，旋干，硅胶柱层析纯化，得到甲氧基嘌呤酯。

7、本发明在诱导制备得到黄姑鱼三倍体时，在3-12℃的温度下，再加入微量的嘌呤衍生物之后，可以提高黄姑鱼三倍体的诱导成功率，并且具有异羟肟酸基团的嘌呤衍生物的诱导成功率更高，而在嘌呤衍生物的嘌呤上具有羟基时，同样可以提高黄姑鱼三倍体的诱导成功率，而在嘌呤衍生物的嘌呤上具有羟基的同时还具有异羟肟酸基团时，所得黄姑鱼三倍体的成功率更高。

8、更进一步优选地，甲氧基嘌呤酯的制备中，6-甲氧基嘌呤的使用量为dmf的8-12wt%。

9、更进一步优选地，甲氧基嘌呤酯的制备中，碳酸钾的使用量为dmf的10-15wt%。

10、更进一步优选地，甲氧基嘌呤酯的制备中，2-溴乙酸乙酯的使用量为6-甲氧基嘌呤的100-150wt%。

11、更进一步优选地，甲氧基嘌呤酯的制备中，柱层析洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚以质量比1：5-20的比例混合。

12、进一步优选地，甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备中，将盐酸羟胺加入无水甲醇中，然后加入甲醇钠，在20-40℃下反应20-60min，反应完成后冷却，过滤除去固体，将甲氧基嘌呤酯加入滤液中，在50-60℃下反应4-12h，反应完成后调节ph至5-6，浓缩搅拌，硅胶柱层析纯化，得到甲氧基嘌呤异羟肟酸。

13、更进一步优选地，甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备中，盐酸羟胺的使用量为无水甲醇的0.5-2wt%。

14、更进一步优选地，甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备中，甲醇钠的使用量为盐酸羟胺的80-120wt%。

15、更进一步优选地，甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备中，甲氧基嘌呤酯的使用量为盐酸羟胺的150-300wt%。

16、更进一步优选地，甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备中，柱层析洗脱剂为甲醇和乙酸乙酯以质量比1：1-3的比例混合。

17、更优选地，嘌呤衍生物为羟基嘌呤酯或羟基嘌呤异羟肟酸；羟基嘌呤酯由6-羟基嘌呤与2-溴乙酸乙酯反应制备；羟基嘌呤异羟肟酸由羟基嘌呤酯与盐酸羟胺反应制备。

18、进一步优选地，本发明还可制备得到一种羟基嘌呤酯，羟基嘌呤酯的制备与甲氧基嘌呤酯的制备相比，不同之处在于，将6-甲氧基嘌呤替换为6-羟基嘌呤。

19、本发明还可制备得到一种羟基嘌呤异羟肟酸，羟基嘌呤异羟肟酸的制备与甲氧基嘌呤异羟肟酸的制备相比，不同之处在于，将甲氧基嘌呤酯替换为羟基嘌呤酯。

20、更优选地，处理受精卵的海水中的嘌呤衍生物的含量为0.02-0.2wt%。

21、优选地，营养调控中以沙蚕和鱿鱼为饵料进行培育，饵料中加入3-5wt%的维生素c和1-2wt%维生素e。

22、优选地，光温调控中的光照强度为60-650lux，光照时间12-16小时/天，水温为18-22℃。

23、优选地，配合饲料中芳香化酶抑制剂来曲唑的量为5-20mg/kg。

24、优选地，伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼的培育中，挑选已经性成熟的2龄伪雄鱼和正常雌鱼放置在水泥池中，对正常雌鱼进行营养调控和光温调控。

25、更优选地，伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼的培育中，营养调控是指以沙蚕和鱿鱼为饵料进行培育，饵料中加入3-5wt%的维生素c和1-2wt%维生素e，每日投喂2-3次。

26、更优选地，伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼的培育中，光温调控是采用60-70w白炽灯控制亲鱼池的表面光照，光照强度为60-650lux，光照时间12-16小时/天，水温为18-22℃。

27、更优选地，伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼的培育中，待到性成熟时向雌鱼的体腔注射促黄体释放激素-a2进行人工催产。采用腹部挤压法分别收集雌鱼的卵子和伪雄鱼的精子，收集的精子和卵子分别放入干燥的烧杯中备用。

28、优选地，人工授精及孵化培育中，采用干法授精，将采集的伪雄鱼精液滴入卵中，轻轻摇动混匀，然后加入少量海水进行受精；在授精2-4min后，将受精卵浸入3-12℃的海水中处理5-20min，取出处理后的受精卵在13-16℃海水过渡3-10min，然后放入20-25℃海水中准备进行孵化。在孵化后20-30天，将鱼苗转移到养殖用桶中，并适应培育3-7天。

29、优选地，人工授精及孵化培育中，海水中可以加入嘌呤衍生物，甲氧基嘌呤酯的含量为0.02-0.2wt%。嘌呤衍生物包括甲氧基嘌呤酯或甲氧基嘌呤异羟肟酸或羟基嘌呤酯或羟基嘌呤异羟肟酸。

30、优选地，全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育中，孵化培育后的全雌黄姑鱼幼鱼采用配合饲料进行投喂30-90天，每日投喂2-3次，配合饲料投喂结合后，采用普通饲料进行培育直至成鱼。

31、更优选地，全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育中，配合饲料与普通饲料相比，不同之处在于配合饲料中加入芳香化酶抑制剂来曲唑，芳香化酶抑制剂来曲唑的量为5-20mg/kg。

32、更优选地，全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育中，芳香化酶抑制剂来曲唑溶于少量95%乙醇中，然后再与普通饲料混合，即可得到配合饲料。

33、更优选地，全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育中，每天按时换水，每次换水量不低于200%。

34、优选地，人工授精及孵化培育中，海水中可以加入哌嗪硫酸盐，哌嗪硫酸盐的含量为0.02-0.1wt%。在对黄姑鱼三倍体的诱导探究中，发现将微量哌嗪硫酸盐与嘌呤衍生物共同使用时，具有更好的效果，提高黄姑鱼三倍体的诱导成功率。

35、本发明公开了一种嘌呤衍生物，嘌呤衍生物包括甲氧基嘌呤酯或甲氧基嘌呤异羟肟酸或羟基嘌呤酯或羟基嘌呤异羟肟酸；甲氧基嘌呤酯由6-甲氧基嘌呤与2-溴乙酸乙酯反应制备；甲氧基嘌呤异羟肟酸由甲氧基嘌呤酯与盐酸羟胺反应制备；羟基嘌呤酯由6-羟基嘌呤与2-溴乙酸乙酯反应制备；羟基嘌呤异羟肟酸由羟基嘌呤酯与盐酸羟胺反应制备。

36、本发明公开了上述嘌呤衍生物中制备提高黄姑鱼三倍体诱导成功率的试剂中的用途。

37、本发明由于对性成熟的伪雄黄姑鱼和黄姑鱼雌鱼进行营养调控和光温调控，取精取卵；人工授精获得受精卵，并浸于海水中处理后进行孵化培育，最后再进行全雄三倍体黄姑鱼的诱导培育；在人工授精及孵化培育中在将受精卵浸入海水中时，可以在海水中加入嘌呤衍生物对受精卵进行处理，提高黄姑鱼的三倍体诱导成功率，因而具有如下有益效果：黄姑鱼三倍体的诱导成功率高，并在后续诱导下成功得到全雄黄姑鱼三倍体。因此，本发明是在于提供一种诱导三倍体成功率高的、效果好的高效生产全雄黄姑鱼三倍体的诱导方法。