用于冷冻和解冻哺乳动物细胞的方法和组合物与流程

背景技术：

1、如细胞、组织、器官、血液制品、胚胎、精子、干细胞、鱼卵等生物材料的冷冻保存需要将生物材料冷冻到足够低的温度，使得可能会损坏材料的化学过程停止，从而保存材料。

2、冷冻保存领域通常不仅旨在冷冻生物材料，而且还旨在保留其活力，即其在解冻后恢复正常生物功能的能力。当冷冻生物材料时，内部的流体通常会经历相变，在此期间可能形成冰晶。冰晶的形成可能对生物材料造成损害，使其在解冻后可能无法生存。

3、因此，需要优化冷冻保存条件，特别是在冷冻保存用于疗法的细胞时，以确保可能需要运送以用于各种应用，例如用于细胞疗法、再生医学、组织工程和许多其它生物医学应用的细胞的生存。

4、欠佳的冷冻保存可导致细胞活力和功能性在批次间发生变化，细胞产量降低，还会导致可能选择具有与原始细胞不同的遗传或表观遗传特征的亚群。监管要求也对冷冻保存有影响，因为这些将要求对产品的冷冻、储存和解冻采取稳健并且可重复的方法。

技术实现思路

1、本技术至少部分基于用于有效冷冻和解冻哺乳动物细胞的方法和组合物。本发明部分基于大规模冷冻保存/解冻方法的开发，所述方法通常适用于哺乳动物细胞，例如免疫细胞，特别是适用于细胞疗法的工程化的免疫细胞。本技术公开了一种冷冻方法，所述方法包括各种冷却、加热和保持步骤，所述方法允许冷冻保存细胞，所述细胞在解冻后具有高活力和功能。此外，本文所述的冷冻/解冻方法能够在少于或约60分钟内大规模(例如，体积大于10ml)地一致冷冻含有细胞的样品，以及能够向有需要的受试者直接施用后续解冻的细胞样品，如本文所述。

2、举例来说，如下文更详细描述，本文所述的方法允许在体外和体内保留免疫细胞功能，至少与新鲜分离的细胞可比较。此外，本文提供的方法和组合物可用于保存大体积免疫细胞，尤其是适用于细胞疗法的同种异体的工程化的免疫细胞，例如用于储存和运输到细胞库或医院，在细胞库或医院，细胞可用于进一步培养和分析或可直接注射到有需要的患者中。因此，本技术提供了在保存大体积哺乳动物细胞，特别是适用于细胞疗法的工程化的免疫细胞方面极为有效的冷冻和解冻方法。

3、在一些方面，大规模冷冻保存免疫细胞的方法包括：(a)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比容器的全容量体积小至少5％，并且其中样品体积是至少10ml；(b)在多步工艺中以最大限度地减少熔化潜热的控制速率将容器从高于样品的冷冻温度的温度冷却到约或低于-80℃的温度；以及(c)将细胞储存于液氮气相中，从而冷冻保存免疫细胞。

4、在一些实施方案中，最大限度地减少熔化潜热的控制速率包括将温度以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率降低到-80℃或更低的最终温度的两个或更多个步骤。

5、在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于120分钟、少于110分钟、少于100分钟、少于90分钟、少于80分钟、少于70分钟或少于60分钟。因此，在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于120分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于110分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于100分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于90分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于80分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于70分钟。在一些实施方案中，实现免疫细胞冷冻保存的总时间少于60分钟。

6、在一些实施方案中，免疫细胞是新鲜分离的或至少曾冷冻和解冻。

7、在一些实施方案中，免疫细胞是天然存在或工程化的自然杀伤(nk)细胞、αβt细胞、γδt细胞、调节性t细胞(treg)、诱导性多能干细胞(ipsc)、ipsc来源的t或nk细胞、造血干细胞(hsc)、间充质基质细胞(msc)、树突状细胞、巨噬细胞或b细胞。因此，在一些实施方案中，免疫细胞是天然存在或工程化的nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是工程化的nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是αβt细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是γδ。在一些实施方案中，免疫细胞是treg。在一些实施方案中，免疫细胞是ipsc。在一些实施方案中，免疫细胞是ipsc来源的t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是ipsc来源的nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是hsc。在一些实施方案中，免疫细胞是msc。在一些实施方案中，免疫细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是b细胞。

8、在一些实施方案中，免疫细胞是经嵌合抗原受体(car)工程改造的脐带血来源的nk细胞。

9、在一些实施方案中，nk细胞包含嵌合抗原受体(car)。nk细胞可包含任何car，包括例如以下中的一者或多者：cd19 car、b细胞成熟抗原(bcma)car、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)car、cd22 car、间皮素car、muc1 car、上皮细胞粘附分子(epcam)car、表皮生长因子受体(egfr)car、cd123 car、cd20 car、her2 car、gd2 car、cd133 car、epha2 car和前列腺特异性膜抗原(psma)car。因此，在一些实施方案中，nk细胞包含cd19 car。在一些实施方案中，nk细胞包含bcma car。在一些实施方案中，nk细胞包含gpc3 car。在一些实施方案中，nk细胞包含cd22 car。在一些实施方案中，nk细胞包含间皮素car。在一些实施方案中，nk细胞包含muc1 car。在一些实施方案中，nk细胞包含epcam car。在一些实施方案中，nk细胞包含egfr car。在一些实施方案中，nk细胞包含cd123 car。在一些实施方案中，nk细胞包含cd20car。在一些实施方案中，nk细胞包含her2 car。在一些实施方案中，nk细胞包含gd2 car。在一些实施方案中，nk细胞包含cd133 car。在一些实施方案中，nk细胞包含epha2 car。在一些实施方案中，nk细胞包含psma car。

10、在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-15、il-15与il-15rα的复合物、il-18、il-12、il-7、ccl19中的一者或多者。因此，在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-15。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-15与il-15rα的复合物。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-18。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-12。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达il-7。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达ccl19。

11、在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达一种或多种自杀基因。举例来说，在一些实例中，nk细胞被工程化成表达icaspase9、非分泌性tnfα、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(uprtase)、胞嘧啶脱胺酶(cd)中的一者或多者。因此，在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达一种或多种icaspase9。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达非分泌性tnfα。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(uprtase)。在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达胞嘧啶脱胺酶(cd)。

12、在一些实施方案中，nk细胞被工程化成表达cd19 car、il-15和icaspase9。

13、在一些实施方案中，nk细胞是包括cd19-car的基因工程化的脐带血nk细胞，该cd19-car包含：抗cd19结合结构域；跨膜结构域，例如t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154；和细胞内信号传导结构域，例如细胞内信号传导结构域fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3-ζ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。cd-19结合结构域可以是单链抗体或单链抗体片段，例如scfv。在一个实施方案中，抗cd19结合结构域包括包含seq id no:1中所示的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含seq id no:2中所示的氨基酸序列的重链可变区。在另一实施方案中，cd-19car可包括抗cd19结合结构域、cd28跨膜结构域(示例性cd28跨膜序列在seq idno:3中示出、cd3z信号传导结构域(示例性cd3z序列在seq id no:4中示出，还可包括自杀开关，例如icaspase9和/或il-15。

14、在一个实施方案中，基因工程化的脐带血nk细胞包括编码抗cd19结合结构域的重链可变区的核酸分子和/或编码抗cd19结合结构域的轻链可变区的核酸分子。

15、在一些实施方案中，容器的全容量体积是约50ml。

16、在一些实施方案中，容器的全容量体积是约50ml并且样品体积小于40ml。

17、在一些实施方案中，样品体积是约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约31ml、约32ml、约33ml、约34ml、约35ml、约36ml、约37ml、约38ml、约39ml、约40ml、约41ml、约42ml、约43ml、约44ml或约45ml。因此，在一些实施方案中，样品体积是约10ml。在一些实施方案中，样品体积是约15ml。在一些实施方案中，样品体积是约20ml。在一些实施方案中，样品体积是约15ml。在一些实施方案中，样品体积是约25ml。在一些实施方案中，样品体积是约30ml。在一些实施方案中，样品体积是约35ml。在一些实施方案中，样品体积是约40ml。在一些实施方案中，样品体积是约45ml。

18、在一些实施方案中，容器是冷冻瓶或冷冻袋。因此，在一些实施方案中，容器是冷冻瓶。在一些实施方案中，容器是冷冻袋。

19、在一些实施方案中，冷冻瓶的内部尺寸介于10mm与18mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的外部尺寸介于15mm与40mm之间。

20、在一些实施方案中，冷冻瓶的内部尺寸是约13.5mm。

21、在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约40mm与50mm之间。在一些实施方案中，冷冻瓶的高度介于约30mm与90mm之间。

22、在一些实施方案中，冷冻瓶的高度是约48.3mm。

23、在一些实施方案中，容器对dmso有抗性。

24、在一些实施方案中，免疫细胞以约6×106与120×106个细胞/毫升之间的浓度存在。在一些实施方案中，免疫细胞以约6×106与25×106个细胞/毫升之间的浓度存在。

25、在一些实施方案中，冷冻保存介质包含冷冻保护剂、白蛋白、二糖、和无热原且等渗的晶体溶液。

26、在一些实施方案中，冷冻保存介质包含人血清白蛋白(hsa)、氯化钠、葡萄糖酸钠、三水合乙酸钠、氯化钾、氯化镁、二甲亚砜(dmso)和海藻糖。

27、在一些方面，提供了一种大规模解冻冷冻保存的免疫细胞的方法，所述方法包括：(a)将水浴加热到在37℃和70℃范围内的温度；(b)将包含冷冻保存的免疫细胞的容器转移到预热的水浴中；以及(c)将容器以约100rpm与约250rpm之间的速度搅动合适的时间段，从而获得解冻的免疫细胞。在一些实施方案中，水浴温度介于55℃与65℃之间。在一些实施方案中，将容器以约100rpm与150rpm之间的速度搅动。

28、在一些实施方案中，合适的时间段介于5-15分钟之间。

29、在一些实施方案中，合适的时间段是约10分钟。

30、在一些实施方案中，搅动发生在定轨振荡器水浴中。

31、在一些实施方案中，在定轨振荡器水浴中搅动细胞是在约120-150rpm的速度下。

32、在一个实施方案中，将细胞在60℃水浴中以125rpm搅动约10分钟。

33、在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。因此，在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约50℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约55℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约60℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约65℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约70℃。在一些实施方案中，定轨振荡器水浴的温度是约75℃。

34、在一些实施方案中，容器具有约50ml的全容量体积和介于约8ml与45ml之间的样品体积。

35、在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有90％、95％、97％或更高的解冻后活力。因此，在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有90％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有95％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有97％的解冻后活力。在一些实施方案中，解冻的免疫细胞具有超过97％的解冻后活力。

36、在一些实施方案中，解冻的免疫细胞保留与新鲜分离的免疫细胞类似的体外和/或体内功能。

37、在一些实施方案中，方法还包括将解冻的免疫细胞施用到有需要的受试者的步骤。

38、在一些方面，提供了一种改变含有免疫细胞的样品的温度的方法，使温度从高于样品的冷冻温度的第一温度变成低于或等于-80℃的最终温度，从而将样品冷冻保存在最终温度下，所述方法包括以下步骤：(a)将样品放置于高于样品的冷冻温度的第一温度下；(b)将第一温度以第一控制速率降低到第二温度，其中第二温度比第一温度低至少2℃；(c)将第二温度以第二控制速率降低到第三温度，其中第三温度比第二温度低至少40℃；(d)将第三温度以第三控制速率升高到第四温度，其中第四温度比第三温度高至少20℃；(e)将第四温度以第四控制速率降低到第五温度，其中第五温度比第四温度低至少10℃；以及(f)将第五温度以第五控制速率降低到最终温度，其中最终温度低于或等于-80℃。

39、在一些实施方案中，第一温度是约4℃到1℃。在一些实施方案中，第一温度是约4℃。在一些实施方案中，第一温度是约3℃。在一些实施方案中，第一温度是约2℃。在一些实施方案中，第一温度是约1℃。

40、在一些实施方案中，第一控制速率介于约0.75℃与1.25℃/分钟之间。

41、在一些实施方案中，第二温度是约-2℃。

42、在一些实施方案中，第二控制速率介于约20℃与30℃/分钟之间。

43、在一些实施方案中，第三温度是约-60℃。

44、在一些实施方案中，第三控制速率介于约5℃与15℃/分钟之间。

45、在一些实施方案中，第四温度是约-25℃。

46、在一些实施方案中，第四控制速率介于0.75℃与1.25℃/分钟之间。

47、在一些实施方案中，第五温度是约-40℃。

48、在一些实施方案中，第五控制速率介于7℃与15℃/分钟之间。

49、在一些实施方案中，最终温度低于或等于-80℃。

50、在一些方面，提供了一种方法，所述方法包括冷冻保存适于细胞疗法的工程化的免疫细胞，所述方法包括：(1)提供包含样品的容器，所述样品包含悬浮于冷冻保存介质中的免疫细胞，其中样品体积比容器的全容量体积小至少5％，其中样品体积是至少10ml；和(2)以最大限度地减少熔化潜热的影响的控制速率逐步冷冻工程化的免疫细胞群，其中所述逐步冷冻包括将细胞以0.75℃/分钟到30℃/分钟之间的速率冷却到-80℃或更低的最终温度，从而冷冻保存细胞。